豬丁型冠狀病毒在懸浮培養(yǎng)豬腎細(xì)胞LLC-PK1上的增殖特性分析

李厚偉，王 蕾，張先鋒，胡 慧，張真真，張云飛，劉林濤，姬星宇，胡永浩*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2. 商丘美蘭生物工程有限公司，柘城 476200；3. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046)

豬丁型冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)屬于冠狀病毒科丁型冠狀病毒屬，PDCoV可以感染不同年齡的豬，其中，以哺乳仔豬最易感。近年來,PDCoV常與豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒混合感染，導(dǎo)致仔豬死亡率驟升。2014年，Hu等研究發(fā)現(xiàn)，該病毒可在LLC-PK1細(xì)胞上生長與傳代，并產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變。但是細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)工藝無法適應(yīng)疫苗的規(guī)?；a(chǎn)要求，而無血清懸浮培養(yǎng)工藝正成為當(dāng)前國內(nèi)外疫苗生產(chǎn)的主要趨勢。

本研究對LLC-PK1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝及PDCoV在懸浮培養(yǎng)的LLC-PK1細(xì)胞上的增殖特性進(jìn)行了初步探索，以期為利用懸浮培養(yǎng)工藝規(guī)模化生產(chǎn)PDCoV滅活疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

PDCoV HNZK-04株P(guān)10代(GenBank No：MH708124；10TCID·0.1 mL)、LLC-PK1細(xì)胞、抗PDCoV的豬多克隆抗體受贈于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)實驗室；MEM培養(yǎng)基、TPCK胰酶、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)均購自Gibco；PK201培養(yǎng)基購自壹生科(深圳)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PDCoV適應(yīng)性LLC-PK1懸浮細(xì)胞株的篩選 采用不含F(xiàn)BS的PK201培養(yǎng)基逐漸代替含5% FBS的MEM培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)，每次改變培養(yǎng)基成分時依次用離心傳代法和稀釋傳代法進(jìn)行細(xì)胞傳代，當(dāng)細(xì)胞密度>1.5×10cells·mL，活率≥95%時即認(rèn)為細(xì)胞已適應(yīng)生長。采用有限稀釋法篩選單克隆細(xì)胞株，將PDCoV HNZK-04株P(guān)10代接種于不同的單克隆細(xì)胞株，以收獲病毒液的滴度篩選PDCoV高適應(yīng)性懸浮細(xì)胞株命名為LLC-PK1Sa。

1.2.2 間接免疫熒光法(IFA)鑒定PDCoV對LLC-PK1細(xì)胞的感染性 分別將PDCoV HNZK-04株P(guān)10代及LLC-PK1Sa細(xì)胞增殖的PDCoV F10代(10TCID·0.1 mL)病毒接種于LLC-PK1細(xì)胞，300 μL·孔。同時設(shè)不接毒對照組，按照已建立的IFA方法進(jìn)行檢測，其中，一抗為抗PDCoV的豬多克隆抗體(1∶1 000)，二抗為FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG抗體(1∶100)，熒光顯微鏡下觀察病毒對細(xì)胞的感染情況。

1.2.3 PDCoV在懸浮培養(yǎng)LLC-PK1細(xì)胞上增殖工藝的優(yōu)化 分別對影響病毒增殖的主要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。1)將細(xì)胞密度分別調(diào)整為5×10、1×10、2×10、3×10cells·mL，TPCK胰酶濃度為5.0 μg·mL， 按MOI為10接種PDCoV HNZK-04株P(guān)10代，待細(xì)胞病變達(dá)80%左右時收毒。2)在確定的最佳細(xì)胞密度條件下，TPCK胰酶濃度為5.0 μg·mL，分別按MOI為10、10、10接種PDCoV HNZK-04株P(guān)10代，于接種后24、36、48、60、72、84、96 h收毒。3)在最佳細(xì)胞密度及MOI條件下，TPCK胰酶濃度分別為1、2.5、5.0、7.5、10 μg·mL，每種濃度3個重復(fù)，待細(xì)胞病變達(dá)80%左右時收毒。分別測定所收獲的PDCoV 的TCID。

2 結(jié) 果

2.1 PDCoV適應(yīng)性LLC-PK1懸浮細(xì)胞株的篩選

如圖1a所示，LLC-PK1細(xì)胞貼壁生長時呈規(guī)則纖維樣，緊密排列；圖1b～d所示，細(xì)胞形態(tài)由纖維樣變?yōu)閳A形，密度逐漸增大，但是大小不一，有少量結(jié)團(tuán)現(xiàn)象；圖1e所示LLC-PK1細(xì)胞形態(tài)和大小都趨于一致，無明顯結(jié)團(tuán)現(xiàn)象。通過對LLC-PK1細(xì)胞的單克隆及PDCoV HNZK-04株適應(yīng)性培養(yǎng)，最終優(yōu)選出可穩(wěn)定增殖PDCoV的LLC-PK1Sa細(xì)胞株。

a. 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞；b. 3%FBS懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞；c. 2%FBS懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞；d. 1%FBS懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞；e. 無血清懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞a. Monolayer culture’s cells; b. 3%FBS suspension culture’s cells; c. 2%FBS suspension culture’s cells; d. 1%FBS suspension culture’s cells; e. Serum-free suspension culture’s cells圖1 LLC-PK1細(xì)胞在不同血清含量的培養(yǎng)基中生長狀態(tài)(100×)Fig.1 The growth status of LLC-PK1 cells in medium with different serum contents (100×)

2.2 間接免疫熒光法(IFA)檢測結(jié)果

如圖2所示，對照組細(xì)胞質(zhì)無綠色熒光，PDCoV接種LLC-PK1細(xì)胞后，絕大部分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)均呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，表明經(jīng)貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞增殖的PDCoV均可特異性的感染LLC-PK1細(xì)胞。

2.3 PDCoV在懸浮培養(yǎng)LLC-PK1細(xì)胞上的最佳增殖工藝

從表1結(jié)果可知，當(dāng)PDCoV接種于細(xì)胞密度為2×10cells·mL時，病毒滴度可達(dá)10TCID·0.1 mL；當(dāng)MOI為10時，在48 h時收獲的病毒液滴度可達(dá)10TCID·mL；當(dāng)TPCK胰酶濃度達(dá)7.5 μg·mL時，收獲病毒液的滴度最高，可達(dá)10TCID～10TCID。

3 討 論

由于血清中存在不明或有害成分，不僅可能降低疫苗的安全性，而且可以中和胰酶，進(jìn)而使病毒不能有效感染細(xì)胞而增殖，因此實現(xiàn)PDCoV在無血清懸浮培養(yǎng)LLC-PK1細(xì)胞中增殖具有切實意義。為了實現(xiàn)PDCoV的高效增殖，不僅需要理想的宿主細(xì)胞，還需要對影響病毒增殖的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在病毒接種細(xì)胞時存在細(xì)胞密度效應(yīng)，在利用LLC-PK1Sa細(xì)胞增殖PDCoV時也證實這一現(xiàn)象的存在，過高或者過低的MOI都不利于PDCoV的高效增殖。另外，本研究發(fā)現(xiàn)PDCoV對TPCK胰酶的依懶性較強，但隨著TCPK胰酶濃度的增加，病毒的滴度出現(xiàn)先增加后減低的趨勢。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于較低濃度的TPCK胰酶可以促進(jìn)病毒利用宿主的氨基肽酶N(APN)作為進(jìn)入受體，通過介導(dǎo)細(xì)胞間融合而促進(jìn)病毒的復(fù)制以及細(xì)胞病變的產(chǎn)生；隨著TPCK胰酶濃度的增加，致使細(xì)胞不能耐受而提前脫落，導(dǎo)致病毒滴度隨之下降。

4 結(jié) 論

以LLC-PK1細(xì)胞為母本，篩選出PDCoV高適應(yīng)性懸浮細(xì)胞株LLC-PK1Sa，且PDCoV按MOI為10接種密度為2×10cells·mL的LLC-PK1Sa細(xì)胞，當(dāng)TPCK胰酶終濃度達(dá)到7.5 μg·mL時，接毒后48 h收獲的病毒液滴度最高。本研究結(jié)果可為生物反應(yīng)器規(guī)?；鲋砅DCoV提供候選細(xì)胞株。

A. 懸浮細(xì)胞增殖的PDCoV感染的細(xì)胞；B. 貼壁細(xì)胞增殖的PDCoV感染的細(xì)胞；C. 對照細(xì)胞；其中，感染細(xì)胞為綠色熒光，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光A. Infected cells by PDCoV with suspension cell proliferation; B. Infected cells by PDCoV with monolayer cell proliferation; C.Control cells; PDCoV-infected cells stained as green and nuclei stained as blue圖2 PDCoV感染LLC-PK1細(xì)胞熒光圖(100×)Fig.2 Immunofluorescence staining of LLC-PK1 cells infected with PDCoV(100×)

表1 PDCoV在懸浮培養(yǎng)LLC-PK1細(xì)胞上增殖的工藝優(yōu)化結(jié)果