偽狂犬病病毒變異株gC抗體間接ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用

吳學(xué)敏,陳如敬，陳秋勇，車勇良，嚴(yán) 山，劉玉濤，周倫江，王隆柏

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福州 350013)

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)是一種神經(jīng)性皰疹病毒，可感染多種哺乳動(dòng)物，包括反芻動(dòng)物、食肉動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物，導(dǎo)致易感動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病。豬是PRV的天然宿主，偽狂犬病(pseudorabies，PR)對養(yǎng)豬業(yè)危害性大，具有高度隱性感染的特點(diǎn)，耐過的母豬常呈潛伏感染。2011年以來，許多豬場發(fā)生了PR，主要表現(xiàn)為豬群PRV-gE抗體陽性率顯著升高，普遍出現(xiàn)母豬流產(chǎn)、仔豬神經(jīng)癥狀和死亡率高等臨床情況。目前，該病在部分地區(qū)偶有發(fā)生，也還發(fā)現(xiàn)免疫PRV疫苗的養(yǎng)豬場發(fā)生偽狂犬病，并分離到PRV新的流行毒株。相關(guān)研究表明，新分離的PRV毒株出現(xiàn)了變異，而經(jīng)典毒株的疫苗未能完全保護(hù)變異強(qiáng)毒力PRV的感染。PRV已發(fā)現(xiàn)11種功能性蛋白，其中，gC糖蛋白為囊膜蛋白，廣泛分布于病毒顆粒的囊膜表面，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的中和抗體。自2012年以來，大量關(guān)于PRV新分離毒株的研究表明，主要免疫保護(hù)基因(、、)均發(fā)生不同程度的變異，與疫苗Bartha毒株差異較大。因此，掌握豬群保護(hù)性抗體水平情況，在PR的預(yù)防中尤為重要。

本研究通過克隆表達(dá)變異PRV FJ-2012株基因，利用原核表達(dá)的gC重組蛋白以建立PRV-gC 蛋白抗體ELISA檢測方法，并對PR流行場和凈化場進(jìn)行檢測，為豬場PR的防控提供依據(jù)，也為進(jìn)一步開展變異PRV血清學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株和細(xì)胞

PK細(xì)胞、pCzn1 質(zhì)粒和Arctic express(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。2012年，從福建省免疫偽狂犬疫苗發(fā)生豬偽狂犬病的豬場分離到PRV，并命名為FJ-2012株，該毒株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑材料

限制性內(nèi)切酶I和I購自寶生物工程(大連)有限公司，EasyPureQuick Gel Extraction Kit，EasyPurePlasmid MiniPrep Kit (EM101)，酶標(biāo)記豬二抗均購自北京全式金有限公司。蛋白純化的Ni-IDA親和層析膠購自Novagen公司。PRV-gB糖蛋白ELISA抗體檢測試劑盒購自西班牙海博萊公司。試驗(yàn)涉及相關(guān)的豬血清(包括PRV-gB/gE抗體均為陽性或者陰性的血清)由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存。

1.3 pCzn1-gC重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中登錄的PRV參考毒株全基因組序列(ID：KM189913.1)，以gC蛋白的主要膜外區(qū)域(53 986—55 272)的片段序列設(shè)計(jì)基因的表達(dá)引物gC-F：5′-CATATGGGCACGACGCCCACCGGG-3′， gC-R：5′-TCTAGATTAGCTGGTCACGACGGGCCAGC-3′。引物由生工生物(上海)工程有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增的片段大小為1 287 bp。 以PRV FJ-2012株的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增的片段插入pCzn1載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Arctic express(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行PCR和雙酶切(I、I)驗(yàn)證，并將重組質(zhì)粒送生工生物(上海)工程有限公司進(jìn)行測序。

1.4 pCzn1-gC重組蛋白的表達(dá)及純化

雙酶切及PCR驗(yàn)證均正確的單克隆菌落，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·L，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。用12% SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證表達(dá)效果，以及使用Ni-IDA親和層析純化目的蛋白，BCA法測定目的蛋白濃度。

1.5 pCzn1-gC重組蛋白間接ELISA方法的建立

根據(jù)矩陣滴定法，確定間接ELISA方法的抗原包被濃度和血清稀釋比例的最佳配比。通過檢測40份PRV抗體陰性血清(gB和gE抗體均為陰性)，統(tǒng)計(jì)分析樣品的OD值的平均值(Mean)和標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)，初步確定陰陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。通過檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗體陽性血清、豬流行性腹瀉病毒抗體(PEDV)陽性血清、豬圓環(huán)病毒2型抗體(PCV-2)陽性血清、豬瘟病毒抗體(CSFV)陽性血清、豬細(xì)小病毒抗體(PPV)陽性血清以及PRV抗體陽性血清(gB和gE抗體均為陽性)，驗(yàn)證該方法的特異性。利用批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)試驗(yàn)，驗(yàn)證該ELISA方法的重復(fù)性。對PRV抗體陽性豬血清(gB和gE抗體均為陽性)倍比稀釋后，確定該ELISA方法的敏感性。最終確定建立PRV-gC抗體間接ELISA方法。

1.6 gC抗體檢測分析

1.6.1 與gB抗體檢測對比 用上述建立的方法，對若干個(gè)豬場隨機(jī)抽取的120份豬血清進(jìn)行檢測，同時(shí)使用某品牌商品化試劑盒(競爭ELISA方法)檢測gB抗體，將檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析。

1.6.2 不同豬場gC抗體檢測對比 用上述建立的方法，對來源于PRV野毒陽性豬場的80份豬血清，及來源于PRV完全凈化豬場的血清80份進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增

以變異PRV FJ-2012株的核酸為模板，針對gC蛋白基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的條帶約1 287 bp，將PCR產(chǎn)物送生工生物(上海)工程有限公司進(jìn)行克隆測序，將序列與GenBank中的PRV對應(yīng)序列進(jìn)行比對確認(rèn)擴(kuò)增的片段為PRV病毒的gC蛋白基因。

2.2 gC蛋白表達(dá)載體構(gòu)建

構(gòu)建的pCzn1-gC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Arctic express(DE3)表達(dá)菌，進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證，PCR結(jié)果如圖1可見到明顯的目的條帶，與預(yù)期的條帶(1 287 bp)大小一致；酶切后產(chǎn)物跑膠也可見預(yù)期的條帶(1 287 bp)。將抽取的質(zhì)粒送去測序，測序的結(jié)果與病毒擴(kuò)增的gC片段序列相似性為100%，說明成功構(gòu)建了變異PRV FJ-2012株的gC蛋白表達(dá)載體。

M，DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3.pCzn1-gC重組質(zhì)粒M. 2K marker；1-3. pCzn1-gC recombinant plasmid圖1 PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 The results of PCR validation

2.3 gC重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建好的表達(dá)菌于IPTG終濃度為0.5 mmol·L的LB培養(yǎng)基，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。收集細(xì)菌沉淀并裂解，SDS-PAGE膠顯示在約47.5 ku處有一條明顯的重組蛋白條帶(圖2)，且Western blot試驗(yàn)也表明，在47.5 ku處有特異性條帶。表明Arctic express(DE3)菌有表達(dá)出PRV-gC重組蛋白，并命名為“pCzn1-gC融合蛋白”。

2.4 gC重組蛋白間接ELISA方法

2.4.1 抗原包被最佳濃度和血清最佳稀釋度 將純化后的pCzn1-gC融合蛋白包被于ELISA板，采用矩陣法測試結(jié)果顯示：當(dāng)抗原包被濃度為10 μg·mL， 樣品血清按1∶50稀釋時(shí)，樣品陽性O(shè)D值較大，為0.816，且P/N值也最大，為2.22。因此，最佳抗原包被濃度為10 μg·mL，最佳血清抗體稀釋度為1∶50。

2.4.2 間接ELISA方法臨界值的確定 參照本研究建立的方法，檢測PRV-gB和PRV-gE抗體均為陰性的豬血清，初步確定gC蛋白抗體間接ELISA方法判定標(biāo)準(zhǔn)：被檢樣品OD值≥0.438判定為陽性，≤0.406判定為陰性，介于兩者之間判定為可疑。

M．蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)破碎菌液；2.誘導(dǎo)后破碎菌液；3.誘導(dǎo)破碎后菌液上清；4.誘導(dǎo)破碎后菌液沉淀；5～7.洗脫純化后結(jié)果M．Protein maker；1.Uninduced broken bacterial liquid；2.Broken bacterial liquid after induction；3.Bacterial supernatant after induced crushing；4.Induced bacterial precipitation after crushing；5-7.Results after elution and purification圖2 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed protein

2.4.3 特異性驗(yàn)證 采用本研究建立的方法，對PRRSV、PEDV、PCV-2、CSFV和PPV的陽性血清檢測結(jié)果都為陰性，僅PRV抗體陽性血清為陽性，因此該方法的特異性良好，對其他病原抗體無交叉反應(yīng)。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 采用本研究建立的方法，對樣品批內(nèi)重復(fù)檢測結(jié)果顯示：每個(gè)樣品重復(fù)測試OD值的方差為0.003～0.009，變異系數(shù)為0.5%～1.9%；批間重復(fù)檢測結(jié)果顯示：每個(gè)樣品重復(fù)測試OD值的方差為0.009～0.024，變異系數(shù)為2.0%～3.9%；因此，本研究建立的ELISA方法穩(wěn)定可用，具有良好的重復(fù)性。

2.4.5 敏感性試驗(yàn) 對PRV抗體陽性豬血清(gB和gE抗體均為陽性)進(jìn)行倍比(1∶2～1∶128)稀釋，用該方法檢測結(jié)果表明：陽性血清以1∶32倍稀釋后，再按1∶50進(jìn)行稀釋檢測，即1 600倍稀釋后仍能檢測出陽性，表明本研究建立的ELISA方法具有較高的敏感度。

2.5 初步應(yīng)用及符合率

用本研究建立的方法和商品化gB抗體檢測試劑盒，對臨床豬血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：PRV-gC抗體陽性率為91.67%，PRV-gB抗體陽性率為95.00%，其中，商品化試劑盒測出陽性樣品中的4份 和可疑樣品中的1份，本方法結(jié)果均判定為陰性，因此兩種抗體檢測結(jié)果的整體符合率為95.83%。結(jié)果表明，在豬群血清中，PRV的gC蛋白抗體和gB蛋白抗體的陽性率基本一致，該方法可用于臨床檢測，為PRV的疫苗免疫效果評價(jià)提供參考。

2.6 不同豬場gC抗體檢測結(jié)果

用本試驗(yàn)建立的方法，對來源于PRV野毒陽性豬場的80份豬血清，及來源于PRV野毒凈化豬場的80份血清進(jìn)行檢測，兩種豬場均免疫偽狂犬基因缺失疫苗，gC抗體檢測結(jié)果如表1所示，PRV陽性豬場的gC抗體陽性率為96.25%(77/80)，而PRV野毒完全凈化豬場的gC抗體陽性率僅為78.75%(63/80)。從不同豬場gC抗體檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRV野毒完全凈化豬場的gC抗體陽性率明顯低于PR不穩(wěn)定豬場，也明顯低于本場gB抗體的陽性率，表明經(jīng)典PRV毒株基因缺失疫苗免疫產(chǎn)生的gC抗體與變異FJ-2012株的gC蛋白不能起完全的免疫反應(yīng)。

表1 不同豬場PRV抗體檢測結(jié)果

3 討 論

酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linked immune sorbent assay，ELISA)是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種免疫測定技術(shù)，可分為直接法、間接法、競爭法、雙抗體夾心法等，原理都是抗原與抗體的結(jié)合反應(yīng)。間接ELISA方法是在固相載體包被抗原，加入待檢樣品，再加入酶標(biāo)抗體，再進(jìn)行顯色和讀數(shù)，根據(jù)建立的陰陽性臨界值進(jìn)行判定結(jié)果。該方法具有操作方便、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，便于臨床檢測使用，且樣品直接作為一抗未經(jīng)標(biāo)記處理，保證樣品的原有特征，僅通過酶標(biāo)二抗增強(qiáng)其反應(yīng)信號，因此更適用于血液中病毒或疫苗產(chǎn)生抗體的檢測。目前市售PRV gB-ELISA抗體檢測試劑盒多數(shù)是基于 1～2個(gè)抗原表位建立的阻斷ELISA方法，但流行的PRV變異株gB抗原位點(diǎn)出現(xiàn)了一定的漂移，因此阻斷ELISA可能會(huì)出現(xiàn)一定比例的誤判。本試驗(yàn)利用新分離的PRV變異毒株FJ-2012株的gC重組蛋白為包被抗原建立相應(yīng)的ELISA檢測方法，旨在提高ELISA檢測方法的廣譜性、特異性及敏感性，也基本能滿足PRV血清學(xué)臨床診斷的要求。

PRV基因組核苷酸堿基G+C含量高達(dá)75%，在所有糖蛋白中g(shù)B、gC和gD蛋白與宿主的免疫應(yīng)答密切相關(guān)，是PRV感染誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫的主要免疫原性抗原。gC糖蛋白為PRV的囊膜蛋白，分布于病毒顆粒的囊膜表面，具有高度保守性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的中和抗體，是豬和小鼠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的重要靶抗原，同時(shí)也是病毒與宿主細(xì)胞受體黏附的主要成分，被認(rèn)為是一種有效的免疫反應(yīng)誘導(dǎo)劑。有研究表明，利用變異偽狂犬病病毒gD和gC蛋白抗原表位串聯(lián)體具有臨床保護(hù)作用，有助于預(yù)防偽狂犬病病毒變異株的攻擊。近幾年，我國PRV新分離的毒株gC蛋白基因及對應(yīng)氨基酸均發(fā)生不同程度變異，其中，gC蛋白63—69 aa出現(xiàn)7個(gè)氨基酸的插入，還有134—138 aa和143—153 aa區(qū)域都是gC蛋白重要的B細(xì)胞抗原線性表位。本研究檢測結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，存在感染PRV野毒的豬場gC抗體陽性率明顯高于PRV野毒凈化場，表明PRV變異毒株的gC蛋白抗原性有發(fā)生不同程度的改變，也驗(yàn)證了變異毒株gC蛋白基因序列和氨基酸序列變異在免疫學(xué)上的差異。

4 結(jié) 論

從2011年下半年P(guān)R的再次流行，很多免疫疫苗的豬也發(fā)生PR，再次提醒要重視該病的監(jiān)測和凈化。臨床上使用的PRV血清學(xué)檢測試劑盒大部分都是針對gE和gB蛋白抗體的檢測，而本研究利用新分離PRV流行毒株的gC蛋白，建立了特異性強(qiáng)、靈敏度高和重復(fù)性好的PRV-gC蛋白抗體間接ELISA檢測方法，完全能滿足PRV野毒流行的豬場和PRV野毒凈化豬場豬群PRV-gC蛋白抗體血清學(xué)診斷要求；從不同豬場gC抗體檢測結(jié)果表明，經(jīng)典PRV毒株基因缺失疫苗免疫產(chǎn)生的gC抗體與變異FJ-2012株的gC蛋白不能起完全的免疫反應(yīng)。