兩種肥胖型多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗大鼠模型的構(gòu)建及評價

徐海燕杜青徐琳本黃建華王紅梅丁正香

(湖南省中醫(yī)藥研究院,長沙 410006)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種以慢性無排卵、高雄激素血癥(多毛、痤瘡、雄激素性脫發(fā))以及卵巢多囊樣改變?yōu)橹饕卣鞯膬?nèi)分泌代謝紊亂疾病,影響著12%～18%的女性[1]。長期的內(nèi)分泌紊亂可導(dǎo)致不孕、肥胖、糖脂代謝異常,并帶來一系列遠(yuǎn)期并發(fā)癥,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[2]。其中,肥胖是促進(jìn)PCOS病情發(fā)生發(fā)展的重要因素之一,肥胖型PCOS約占總發(fā)病率的一半,體內(nèi)還存在明顯的胰島素抵抗(insulin resistance,IR)[3]。胰島素抵抗和高胰島素血癥是PCOS病理生理的主要特征,約50%～65%PCOS患者存在胰島素抵抗[4]。IR不僅是導(dǎo)致PCOS患者生殖障礙和代謝異常的主要原因,還可增加2型糖尿病、心腦血管疾病、代謝綜合征等風(fēng)險,嚴(yán)重影響患者身心健康[5]。

PCOS-IR由于發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,臨床組織樣本獲取困難,已成為目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn),現(xiàn)有可供研究的實(shí)驗(yàn)動物模型眾多,但與臨床PCOS-IR特征的符合程度仍存在一定的差異[6-7],建立理想的PCOS-IR動物模型在實(shí)驗(yàn)研究中顯得尤為重要。PCOS的動物造模方法主要包括經(jīng)典Poresky法、雄激素聯(lián)合HCG法、孕激素聯(lián)合HCG法、雌激素法、芳香花酶抑制劑法等[8-10]。盡管造模方法多樣,但仍有不盡完美之處,如雄激素大多屬于油劑,長期皮下注射,藥物不易吸收,容易導(dǎo)致造模不理想;孕激素法可能會影響促排卵藥物的療效,不適合促排卵藥物研究;雌激素法對模型下丘腦-垂體軸有一定的損害,不適合后期治療研究[4]。篩選并建立一種更貼近臨床病理生理特征的PCOS-IR的實(shí)驗(yàn)動物模型對于臨床防治具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用兩種不同方式分別聯(lián)合高糖高脂飲食建立肥胖型PCOS-IR動物模型,通過比較兩種模型不同時間節(jié)點(diǎn)生殖、內(nèi)分泌和代謝指標(biāo)差異,以期篩選出更符合臨床特征的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

36只6周齡SPF級雌性SD大鼠,體重180～220 g,購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司【SCXK(湘)2019-0004】,在湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動物中心【SYXK(湘)2020-0008】飼養(yǎng),允許大鼠在恒定溫度、濕度和光暗循環(huán)((22±2)℃;55%±10%;7:00～19:00光照循環(huán))下自由飲用水和食物。本研究經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院動物倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審批號IACUC2019-0029),按照與湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動物中心的有關(guān)協(xié)議進(jìn)行,所有程序均按照中國科學(xué)技術(shù)部制定的“實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指導(dǎo)意見”進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑與儀器

來曲唑片(規(guī)格:每片2.5 mg,批號:190426KF,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司);胰島素注射液(規(guī)格:每支400 IU,批號:21801204,江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司);注射用絨促性素HCG(每支1000 U,批號:190303,麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠);快速革蘭氏染色液(批號MA0391-Jun-20E),購于大連美侖生物;卵泡刺激素(FSH,批號JM-01972R1)、促黃體生成素(LH,批號JM-02030R1)、雌二醇(E2,批號JM-01475R1)、總睪酮(T,批號JM-10537R1)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β,批號JM-01454R1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α,批號JM-10494R1)、胰島素(INS,批號JM-01993R1)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA),購于江蘇晶美生物技術(shù)有限公司。IL-1β和TNF-α RT-PCR上下游引物(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(TaKaRa)。血糖儀及血糖試紙(艾科,美國);Olympus生物顯微鏡(OLYMPUS公司,日本);TrilogyII型生化分析儀(Drew Scientific,美國);envision2105型酶標(biāo)儀(PerkinElmer,美國);生物組織切片機(jī)(Thermo Scientific,美國);水平瓊脂糖電泳槽(北京六一,中國);實(shí)時熒光定量PCR儀(Thermo Scientific,美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與造模

將36只SD大鼠按體重隨機(jī)分為3組:對照組,每日灌胃0.5%羧甲纖維素鈉溶液;Letrozole組,每日灌胃來曲唑溶液(1 mg/kg),HCG+INS組,頸背部皮下注射逐漸增量的胰島素注射液,第1天(每天1次、每次0.5 U),第2、3天(每天1次、每次1.5 U),第4天(每天1次、每次2 U),第5天(每天1次、每次2.5 U),第6天(每天1次、每次3 U),第7、8天(每天1次、每次4 U),第9、10天(每天1次、每次5 U),第11～30天(每天1次、每次6 U),并加用HCG每天1次、每次3.0 U。其中對照組給予普通飼料和純凈水,Letrozole組和HCG+INS組皆給予高脂飼料(基礎(chǔ)維持飼料61.5%、豬油12%、蔗糖5%、奶粉5%、花生5%、雞蛋10%、麻油1%、食鹽0.5%)和5%葡萄糖溶液飼養(yǎng),連續(xù)30 d。

1.2.2 一般狀態(tài)觀察

每天觀察記錄各組動物活動、進(jìn)食、糞便等,每周進(jìn)行體質(zhì)量監(jiān)測。在造模第18天開始進(jìn)行陰道涂片,連續(xù)10 d,判斷大鼠動情周期變化。每天固定時間,抓住大鼠腰背部皮膚,腹部朝上,露出陰道口,將沾有生理鹽水的無菌棉棒輕置于陰道內(nèi),轉(zhuǎn)動4～5圈,將粘液均勻涂在載玻片上、風(fēng)干、采用快速革蘭氏染色法進(jìn)行染色,風(fēng)干后顯微鏡下觀察排卵情況。分別在第23、30天挑選各組動物的一半進(jìn)行以下處理。

1.2.3 樣本采集

動物禁食不禁水12 h,腹腔麻醉后,腹主動脈取血,離心(3000 r/min,15 min),收集上清,-80℃保存待用。實(shí)施安死術(shù)后取子宮、卵巢,稱取重量。將左側(cè)卵巢保存在4%多聚甲醛固定液中,右側(cè)卵巢液氮速凍,-80℃保存待用。

1.2.4 代謝指標(biāo)和性激素檢測

取上述保存的血清,采用生化儀檢測空腹血糖(FBG)、血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平;采用酶聯(lián)免疫吸附法,按照試劑盒說明操作,檢測血清胰島素(INS)、卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、總睪酮(T)水平變化。并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR=FBG(mmol/L)×INS(mIU/L)/22.5)。

1.2.5 卵巢病理形態(tài)學(xué)檢測

取固定的各組大鼠卵巢組織,使用70%、90%、95%乙醇,二甲苯進(jìn)行常規(guī)脫水,石蠟包埋、切4μm薄片,以及蘇木素-伊紅(HE)染色,脫水,封片,顯微鏡下觀察卵巢病理形態(tài)學(xué)變化。

1.2.6 血清和卵巢炎癥因子檢測

按照ELISA試劑盒說明操作,檢測血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)水平變化。采用實(shí)時熒光定量PCR法,檢測凍存的卵巢組織中TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)水平,取約20 mg卵巢組織,加入1 mL TRIzol,充分研磨,裂解5 min,提取樣本總RNA,核酸蛋白測定儀測定260/280 nm處A值,進(jìn)行定量。按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明書將定量的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反應(yīng)體系為2X SYBGREEN PCR Master Mix 15μL,ddH2O 11 μL,上下游引物(10μmol/L)各1μL,cDNA 1μL。擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性15 min,95℃變性15 s,60℃退火30 s,共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,反應(yīng)結(jié)束后以2-ΔΔCt法計(jì)算分析目的基因TNF-α和IL-1β相對表達(dá)水平,以基因/內(nèi)參吸光度比值的(±s)表示。引物序列見表1。

表1 TNF-α和IL-1β引物序列Table 1 TNF-αand IL-1βprimer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0,所有計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間采用單因素方差分析(One-way-ANOVA),不服從正態(tài)分布用非參數(shù)檢驗(yàn),P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重變化

每周體重監(jiān)測發(fā)現(xiàn),各組大鼠體重逐漸增長,與對照組比,Letrozole組大鼠在第4周,體重顯著增加(P＜0.05),HCG+INS組無顯著性差異(見圖1)。

圖1 各組大鼠體重增長曲線Note.Compared with control group,*P＜0.05.Figure 1 Growth curve of rat body mass in each group

2.2 陰道涂片觀察

于造模第18天,開始進(jìn)行陰道涂片,共10 d,每5 d為一個動情周期,一共兩個動情周期,觀察大鼠動情周期的變化。對照組大鼠的陰道涂片顯微鏡下觀察可見規(guī)律的排卵周期,在動情期可見大量的角質(zhì)化鱗狀上皮細(xì)胞(見圖2);Letrozole組大鼠陰道涂片未觀察到規(guī)律性周期,在第二個動情周期多數(shù)表現(xiàn)為大量的白細(xì)胞和有核上皮細(xì)胞,未見角化細(xì)胞;HCG+INS組偶見大片不規(guī)則角質(zhì)化鱗狀上皮細(xì)胞,大部分表現(xiàn)為白細(xì)胞和有核上皮細(xì)胞共存,提示有偶發(fā)排卵的情況存在(見圖2)。

圖2 各組大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片觀察Figure 2 Smears observation of vaginal exfoliated cell of rats in each group

2.3 臟器濕重比較

稱量各組大鼠子宮和雙側(cè)卵巢重量,與對照組大鼠比較,在第23天和第30天,Letrozole組來曲唑給藥大鼠子宮濕重皆顯著性降低,卵巢濕重明顯增加(P＜0.05或P＜0.01);第30天,HCG+INS組注射給藥大鼠在卵巢濕重明顯增加(P＜0.05),子宮濕重增加但無顯著性差異(見圖3)。

圖3 各組大鼠子宮和卵巢的濕重比較Note.Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.01.(The same in the following figures)Figure 3 Comparison of wet weight of uterus and ovary of rats in each group

2.4 卵巢形態(tài)學(xué)變化

光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),對照組大鼠卵巢皮質(zhì)區(qū)卵泡數(shù)目較多,處于不同發(fā)育階段,黃體清晰,可見卵丘和卵母細(xì)胞,顆粒細(xì)胞層大多呈現(xiàn)8～9層,緊密排列,成熟卵泡結(jié)構(gòu)完整,無充血、水腫等現(xiàn)象;Letrozole組大鼠卵巢囊性改變,卵泡囊性擴(kuò)張明顯,閉鎖較多,顆粒細(xì)胞層數(shù)量減少,黃體數(shù)量減少;HCG+INS組大鼠各級未發(fā)育成熟的小卵泡數(shù)較Letrozole組稍少,黃體較大,顆粒細(xì)胞層減少,排列疏松(見圖4)。其中,在實(shí)驗(yàn)第23天和第30天各組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)差異不明顯。

圖4 各組大鼠不同時間節(jié)點(diǎn)卵巢HE染色Figure 4 Hematoxylin-eosin staining of the ovary of rats at different time points in each group

2.5 空腹血糖、胰島素和血清總膽固醇、甘油三酯變化

與對照組比較,第23天,Letrozole組和HCG+INS組空腹胰島素和胰島素抵抗指數(shù)升高,TG水平明顯增加(P＜0.05或P＜0.01);第30天,兩組空腹血糖、空腹胰島素和胰島素抵抗指數(shù)皆明顯高于對照組,TC、TG水平皆顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)(見圖5)。

圖5 各組大鼠空腹血糖、胰島素含量、胰島素抵抗、血清總膽固醇、甘油三酯比較Figure 5 Comparison of fasting blood glucose,insulin content,insulin resistanceserum total cholesterol and triglyceride of rats in each group

2.6 血清性激素濃度變化

在第23天,與對照組比較,Letrozole組T水平升高,E2水平降低(P＜0.05),HCG+INS組LH增加,E2降低(P＜0.05);在第30 d,兩組FSH、LH水平均顯著上調(diào),E2水平下調(diào),且Letrozole組T水平最高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見圖6)。

圖6 各組大鼠血清性激素水平比較Figure 6 Comparison of serum sex hormone levels in rats in each group

2.7 各組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平和卵巢TNF-α和IL-1βmRNA比較

在第23天,與對照組比,Letrozole組血清TNF-α水平和卵巢TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01),HCG+INS組血清TNF-α、IL-1β水平和卵巢IL-1βmRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.05或P＜0.01);在第30天,兩組血清TNF-α和IL-1β水平皆顯著增加(P＜0.05或P＜0.01)(見圖7)。

圖7 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平和卵巢TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá)變化Figure 7 Changes of serum TNF-αand IL-1βlevels and ovarian TNF-αand IL-1βmRNA expression in rats in each group

3 討論

PCOS是育齡期女性最常見的內(nèi)分泌疾病之一,也是累及全身多系統(tǒng)的疾病。其診斷通?；谂R床指標(biāo)月經(jīng)失調(diào)、Ferriman-Gallwey得分、超聲檢查、肥胖癥(BMI)及生化相關(guān)指標(biāo),如性激素六項(xiàng)、空腹血糖、空腹胰島素等[11]。目前,可以用來制備PCOS的動物模型主要有大鼠、小鼠、家兔和猴,根據(jù)模型的經(jīng)濟(jì)性、穩(wěn)定性、標(biāo)準(zhǔn)性以及重復(fù)性原則,大鼠被選為常用動物[4]。PCOS模型建立以無排卵或偶發(fā)性排卵、性激素分泌紊亂、糖脂代謝異常、胰島素抵抗、卵巢多囊性病理改變等為主要評價指標(biāo)。本研究以近年來研究發(fā)現(xiàn)的胰島素抵抗致PCOS代謝異常特征為主要關(guān)注點(diǎn),并比較眾多PCOS造模方法的實(shí)施難易程度、可復(fù)制性及與臨床癥狀的吻合程度,從中優(yōu)選了比較常用和適合的PCOS-IR造模方法:來曲唑法和經(jīng)典的Poresky法。

來曲唑是一種新型芳香化酶抑制劑,其通過抑制體內(nèi)雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致體內(nèi)雄激素增加,高雄激素血癥不僅可以導(dǎo)致IR,更是形成PCOS的基礎(chǔ)[12]。經(jīng)典的Poresky法是胰島素聯(lián)合HCG法,利用外源性胰島素刺激卵泡膜細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞合成雄激素,造成高雄激素血癥;同時HCG是一種LH的類似物,能促使LH水平增加,阻礙卵泡顆粒細(xì)胞的正常有絲分裂,并且與胰島素有協(xié)同作用,共同加重高雄激素血癥,導(dǎo)致排卵障礙,卵巢多囊樣改變[13]。因PCOS-IR患者大多表現(xiàn)為肥胖,相較非肥胖型PCOS患者,肥胖型PCOS患者胰島素抵抗表現(xiàn)更為嚴(yán)重[14]。但是,單純的來曲唑灌胃給藥和胰島素聯(lián)合HCG注射給藥難以造成動物肥胖,因此,本研究采用5%葡萄糖液和高脂飼料飼養(yǎng),促使動物肥胖,形成了更符合臨床肥胖型PCOS特征的動物模型。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),PCOS-IR動物模型造模時長難以選擇,蔡云等[12]發(fā)現(xiàn),30 d來曲唑聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)可成功誘導(dǎo)出PCOS-IR大鼠模型;魏巍等[15]研究表明,21 d胰島素聯(lián)合HCG法和來曲唑法均可成功誘導(dǎo)大鼠PCOS-IR模型,且大鼠模型其生殖及代謝指標(biāo)的變化前者更具優(yōu)勢;王麗珍等[13]發(fā)現(xiàn),8周胰島素聯(lián)合HCG法聯(lián)合高脂飼料才可成功誘導(dǎo)大鼠PCOS-IR模型。因造模時間長短不一,PCOS-IR動物模型與臨床特征吻合程度也存在差異,故本實(shí)驗(yàn)對兩種不同方法和不同時間PCOS-IR動物模型各主要評價指標(biāo)進(jìn)行比較探討。

研究結(jié)果顯示,在造模第23天,來曲唑聯(lián)合高脂飲食法和經(jīng)典Poresky法聯(lián)合高脂飲食基本能夠誘導(dǎo)出PCOS-IR動物模型。在造模第30天,兩種綜合評價指標(biāo)誘導(dǎo)PCOS-IR動物模型更接近PCOS臨床特征,出現(xiàn)排卵障礙、LH、FSH升高。與經(jīng)典Poresky法相比,雖然來曲唑組大鼠血脂TC水平無顯著變化,但體重明顯增加,并出現(xiàn)顯著的排卵障礙,無偶發(fā)排卵現(xiàn)象,卵巢多囊性改變明顯,性激素分泌更加紊亂,伴高雄激素血癥。因此,來曲唑造模聯(lián)合高脂飼料法在第30天更加符合臨床肥胖型PCOS-IR特征。相比前人的研究,進(jìn)一步豐富了肥胖型PCOS-IR動物造模方法的評價及選擇,為后續(xù)藥物研究模型的選擇上提供更加有效的參考。

由于PCOS患者處于長期的慢性低度炎癥狀態(tài),炎癥反應(yīng)目前被認(rèn)為是PCOS性激素失衡和胰島素抵抗的關(guān)鍵環(huán)節(jié),體內(nèi)升高的促炎性因子(TNF-α和IL-1β等)可進(jìn)一步加劇胰島素抵抗,加重代謝紊亂和卵巢功能障礙,形成惡性循環(huán)[16-17]。臨床研究顯示,相比非肥胖型PCOS-IR患者,肥胖型PCOS-IR患者體內(nèi)炎性因子TNF-α和IL-1β等顯著升高[18-19]。因此,本實(shí)驗(yàn)對各組大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量和卵巢中TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)這些炎癥因子水平均明顯升高,這與臨床報道一致。該實(shí)驗(yàn)通過對不同PCOS-IR動物模型的篩選與炎癥機(jī)制的初探,為后續(xù)臨床診斷和藥物開發(fā)奠定良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。