8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠骨骼肌炎癥及運(yùn)動(dòng)能力的影響

羅勇黃金玲

(1.南京信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院,南京 210023;2.南京工業(yè)大學(xué)浦江學(xué)院,南京 211134)

諸多研究證實(shí)高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖與機(jī)體慢性炎癥的出現(xiàn)息息相關(guān)[1],同時(shí)機(jī)體慢性炎癥也是肥胖誘發(fā)胰島素抵抗的重要因素[2-3],與2型糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝等多種慢性代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4-5]。

眾所周知,運(yùn)動(dòng)干預(yù)是防治肥胖等多種慢性代謝性疾病的有效手段,而探索運(yùn)動(dòng)改善慢性代謝性疾病的途徑對(duì)于更好的理解其在防治慢性代謝性疾病中的作用具有重要意義[6-7]。因此,本文對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠進(jìn)行為期8周的有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù),檢測(cè)有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠運(yùn)動(dòng)能力、骨骼肌骨架蛋白分布、肌萎縮相關(guān)蛋白表達(dá)、骨骼肌炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及炎癥因子蛋白表達(dá)的影響,并提出假設(shè):高脂膳食相關(guān)肥胖誘發(fā)骨骼肌慢性炎癥反應(yīng),導(dǎo)致骨骼肌萎縮和運(yùn)動(dòng)能力下降,而有氧運(yùn)動(dòng)可能通過降低骨骼肌中慢性炎癥水平,改善肥胖誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮,進(jìn)而發(fā)揮提高運(yùn)動(dòng)能力并改善肥胖的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

46只SPF級(jí)5周齡C57BL/6健康雄性小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】,體重約為(17.54±1.46)g,飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(京)2016-0033】。大鼠自由飲水進(jìn)食,溫度22～24℃,相對(duì)濕度40%～60%,12 h晝/12 h夜循環(huán)照明,飼喂普通維持飼料和高脂膳食均由北京華阜康生物科技有限公司【SCXK(京)2020-0004】提供。所有實(shí)驗(yàn)方案均獲得運(yùn)動(dòng)科學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC 2019025A)。

1.1.2 主要試劑與儀器

Desmin、Atrogin-1、MuRF1、TNF-α、IL-1β和IL-10抗體均購自美國(guó)Abcam公司,β-tubulin抗體購自北京中衫金橋公司,蘇木精-伊紅染色試劑購自北京碧云天生物公司。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物氣體代謝監(jiān)測(cè)系統(tǒng)購自美國(guó)Columbus公司,酶標(biāo)儀、垂直電泳儀及凝膠成像儀均購自美國(guó)BIO-RAD公司,病理切片機(jī)、激光共聚焦顯微鏡均購自德國(guó)Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 肥胖小鼠模型制備

小鼠平均體重為(17.54±1.46)g,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(16只,正常飼料,3.85 kcal/g,脂肪供能比為12%)和高脂膳食組(30只,高脂飼料,5.24 kcal/g,脂肪供能比為60%),喂養(yǎng)12周制備肥胖小鼠模型。以空腹條件下高脂膳食組體重超過對(duì)照組平均體重20%作為判斷肥胖小鼠模型建模成功的標(biāo)準(zhǔn)[8],本研究通過12周高脂膳食制備肥胖模型小鼠20只,用于后續(xù)干預(yù)研究。

1.2.2 運(yùn)動(dòng)干預(yù)及實(shí)驗(yàn)分組

采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物氣體代謝監(jiān)測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行小鼠最大運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試,計(jì)算最大運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度作為設(shè)定運(yùn)動(dòng)干預(yù)強(qiáng)度的參考。最大運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試后,對(duì)照組和肥胖組均組內(nèi)隨機(jī)分為對(duì)照安靜組(CS組,8只)、對(duì)照運(yùn)動(dòng)組(CE組,8只)、肥胖安靜組(OS組,10只)和肥胖運(yùn)動(dòng)組(OE組,10只)。CS組和OS組維持原有飼養(yǎng)條件,CE組和OE組維持原有膳食不變,進(jìn)行最大運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度60%的中等強(qiáng)度跑臺(tái)有氧運(yùn)動(dòng),坡度0°,每周6 d,每天1 h,持續(xù)8周。干預(yù)結(jié)束后再次對(duì)各組小鼠進(jìn)行最大運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)樣本采集與制備

末次運(yùn)動(dòng)48 h后對(duì)小鼠進(jìn)行稱重取材,取材前禁食12 h。腹腔注射3%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)麻醉小鼠后取雙側(cè)后肢背側(cè)腓腸肌,用手術(shù)刀剔除肌腱等結(jié)締組織,一側(cè)標(biāo)本經(jīng)PBS漂洗,濾紙吸干水分后迅速置于液氮中用于提取蛋白進(jìn)行后續(xù)檢測(cè);另一側(cè)標(biāo)本置于包埋劑中包埋,用于后續(xù)制作冰凍切片進(jìn)行免疫化學(xué)染色和HE染色。

1.2.4 免疫熒光染色檢測(cè)小鼠骨骼肌骨架蛋白分布

制備小鼠骨骼肌組織冰凍切片,PBS清洗后以組化筆在組織周圍畫圈。5%羊血清室溫封閉30 min,一抗Desmin(1∶500)在濕盒內(nèi)4℃孵育過夜,次日清洗后以一抗相同種屬的熒光二抗避光孵育2 h(1∶500),清洗后DAPI孵育10 min并以抗熒光淬滅封片劑封片。處理完畢后激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像,以Image Pro Plus 6.0軟件處理圖像。

1.2.5 HE染色檢測(cè)小鼠骨骼肌橫截面積和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)

制備小鼠骨骼肌組織冰凍切片,切片入蘇木素染液浸染5 min,自來水洗后切片入乙醇脫水,然后入伊紅染液中染色。之后切片依次放入無水乙醇和二甲苯逐步脫水,最后中性樹膠封片后以顯微鏡鏡檢并采集圖像進(jìn)行分析。圖像中細(xì)胞質(zhì)呈紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.2.6 Western Blot檢測(cè)小鼠骨骼肌萎縮和炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)

稱取小鼠骨骼肌組織約200 mg,加入RIPA試劑勻漿,4℃離心后以BCA方法進(jìn)行蛋白定量,電泳時(shí)上樣量為每孔30μg。一抗Atrogin-1(1∶2000)、MuRF1(1∶1000)、TNF-α(1∶2000)、IL-1β(1∶3000)、IL-10(1∶3000)和β-tubulin(1∶5000)4℃孵育過夜。次日洗膜并加入一抗相同種屬的二抗(1∶3000)孵育2 h。充分洗二抗后使用試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光,于凝膠成像儀中顯像。β-tubulin為內(nèi)參,Image Pro Plus 6.0軟件處理圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。采用Levene檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),雙因素方差分析(Two-way ANOVA)方法處理數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異具有顯著性。Graphpad prism 7繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠體重的影響

圖1顯示,8周運(yùn)動(dòng)干預(yù)期間OS組和OE組能量攝入均分別顯著高于CS組和CE組(P＜0.01),且CE組和OE組能量攝入均分別與CS組和OS組無顯著差異(P＞0.05)。通過檢測(cè)小鼠體重,發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)前OS組和OE組體重均分別顯著高于CS組和CE組(P＜0.01),干預(yù)期間OS組體重均顯著高于CS組(P＜0.01);盡管OE組體重同樣顯著高于CE組(P＜0.05),但有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)至第3周,OE組體重即顯著低于OS組(P＜0.05),至第5周以后差異非常顯著(P＜0.01)。另外,有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)第6周起,CE組小鼠體重顯著低于CS組(P＜0.05)。

圖1 8周有氧運(yùn)動(dòng)下肥胖小鼠能量攝入和體重變化Note.CS.Control-sedentary group.CE.Control-exercise group.OS.Obesity-sedentary group.OE.Obesity-exercise group.Compared with matched control group,*P＜0.05,**P＜0.01.Compared with matched sedentary group,#P＜0.05,##P＜0.01.(The same in the following figures)Figure 1 Changes of food intake and body weight in obese mice during 8-week aerobic exercise

2.2 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響

圖2顯示,OS組小鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)長(zhǎng)、跑動(dòng)距離和峰值跑速均顯著低于CS組(P＜0.01)。盡管有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)8周后,OE組小鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)長(zhǎng)、跑動(dòng)距離和峰值跑速同樣顯著低于CE組(P＜0.01),但相較于OS組,以上指標(biāo)均顯著提高(P＜0.05)。另外,有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)期間CE組與CS組小鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的運(yùn)動(dòng)時(shí)長(zhǎng)、跑動(dòng)距離和峰值跑速未見明顯差異(P＞0.05)。

圖2 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的運(yùn)動(dòng)時(shí)長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)距離和峰值跑速的影響Note.Time,distance and peak speed exercising to exhaustion were detected by a graded exercise testing with animal metabolism detection system.Figure 2 Effects of 8-week aerobic exercise on the time,distance and peak speed in obese mice exercising to exhaustion

2.3 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠骨骼肌骨架蛋白和肌萎縮相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3顯示,CS組和CE組小鼠骨骼肌中Desmin蛋白排列整齊且分布均勻,而高脂膳食干預(yù)的OS組小鼠骨骼肌中Desmin蛋白排列紊亂、模糊甚至缺失,提示OS組小鼠骨骼肌存在一定程度損傷。有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)8周后,OE組小鼠骨骼肌中Desmin蛋白相比OS組更趨于整齊排列并均勻分布。

圖3 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠骨骼肌Desmin蛋白分布的影響Note.Distribution of Desmin protein was detected by Immunofluorescent staining.Figure 3 Effect of 8-week aerobic exercise on the distribution of Desmin protein in skeletal muscle of obese mice

圖4顯示,OS組小鼠骨骼肌中Atrogin-1和MuRF1蛋白表達(dá)均顯著高于CS組(P＜0.01)。有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)8周后,OE組小鼠骨骼肌中Atrogin-1和MuRF1蛋白表達(dá)則均顯著低于OS組(P＜0.01)。另外,CE組小鼠骨骼肌中Atrogin-1和MuRF1蛋白表達(dá)同樣顯著低于CS組(P＜0.01)。

2.4 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠骨骼肌炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

圖5顯示,OS組小鼠骨骼肌纖維橫截面積顯著低于CS組(P＜0.01),而有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)8周后OE組小鼠骨骼肌纖維橫截面積則均顯著高于OS組(P＜0.01),這一結(jié)果與圖4中骨骼肌萎縮相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果一致。通過觀察小鼠骨骼肌切片中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況,發(fā)現(xiàn)OS組小鼠骨骼肌出現(xiàn)萎縮同時(shí)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加(黑色箭頭標(biāo)識(shí)),而有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)8周后OE組小鼠骨骼肌中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,提示骨骼肌炎癥可能參與有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠骨骼肌萎縮的改善作用。

圖4 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠骨骼肌Atrogin-1和MuRF1蛋白表達(dá)的影響Note.Expression of Atrogin-1 and MuRF1 were detected by Western Blot.Figure 4 Effect of 8-week aerobic exercise on the expression of Atrogin-1 and MuRF1 protein in skeletal muscle of obese mice

圖5 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠骨骼肌纖維橫截面積和炎癥浸潤(rùn)的影響Note.Slides of skeletal muscle tissue were performed with HE staining.Figure 5 Effects of 8-week aerobic exercise on skeletal muscle fiber cross-sectional area and inflammatory infiltration in obese mice

2.5 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠骨骼肌炎癥因子蛋白表達(dá)的影響

圖6顯示,相較于CS組,OS組小鼠骨骼肌中TNFα蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.01),IL-10蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.05)。有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)8周后,相較于OS組,OE組小鼠骨骼肌中TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.05),IL-10蛋白表達(dá)則顯著增加(P＜0.01)。另外,CE組小鼠骨骼肌中TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)均顯著下降(P＜0.01),IL-10蛋白表達(dá)則顯著增加(P＜0.05)。

圖6 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠骨骼肌TNF-α,IL-1βand IL-10蛋白表達(dá)的影響Note.Expression of TNF-α,IL-1βand IL-10 were detected by Western Blot.Figure 6 Effect of 8 weeks aerobic exercise on the expression of TNF-α,IL-1βand IL-10 protein in skeletal muscle of obese mice

3 討論

肥胖是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病,而肥胖相關(guān)的慢性炎癥是胰島素抵抗等慢性代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素,已成為近年來人們關(guān)注和研究的重點(diǎn)[9-10]。眾所周知,有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)是防治慢性代謝性疾病的有效手段,已被納入治病處方中[11];而運(yùn)動(dòng)對(duì)于慢性代謝性疾病的防治作用是全身性的整合過程,探索運(yùn)動(dòng)改善慢性代謝性疾病的途徑對(duì)于更好的理解其在防治慢性代謝性疾病中的作用具有重要意義[12]。本研究通過12周高脂膳食干預(yù)制備肥胖小鼠模型,然后以最大運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度60%的中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)8周,檢測(cè)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后小鼠體重、運(yùn)動(dòng)能力、骨骼肌骨架蛋白分布、肌萎縮相關(guān)蛋白表達(dá)、骨骼肌炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及炎癥因子蛋白表達(dá)的變化,旨在一方面為理解有氧運(yùn)動(dòng)改善肥胖的作用提供重要新證據(jù),另一方面有助于進(jìn)一步闡明運(yùn)動(dòng)改善肥胖等慢性代謝性疾病的可能途徑及慢性炎癥的調(diào)節(jié)作用。

肥胖患者普遍存在運(yùn)動(dòng)能力降低,這不僅影響其日常生活活動(dòng),更造成其生命質(zhì)量低下和社會(huì)功能下降[13]。本研究中12周高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的運(yùn)動(dòng)時(shí)長(zhǎng)、跑動(dòng)距離和峰值跑速均明顯低于正常小鼠,這與大部分相關(guān)研究結(jié)果一致[7,9]。在不改變小鼠膳食構(gòu)成前提下,8周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)有效降低肥胖小鼠體重的同時(shí)使得肥胖小鼠運(yùn)動(dòng)能力得到明顯提高,說明有氧運(yùn)動(dòng)是獨(dú)立于飲食方式的改善肥胖等慢性代謝性疾病的有效手段[14-15]。

運(yùn)動(dòng)能力受多種因素制約,其中骨骼肌質(zhì)量是影響運(yùn)動(dòng)能力的關(guān)鍵因素[16]。同時(shí),肥胖期間內(nèi)臟脂肪組織的肥大導(dǎo)致肌肉功能障礙,抑制肌管中收縮蛋白表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致骨骼肌萎縮[17-18]。因此,本研究接下來以骨骼肌萎縮為切入點(diǎn),研究有氧運(yùn)動(dòng)改善肥胖并提高運(yùn)動(dòng)能力的可能途徑。Atrogin-1和MuRF1是在骨骼肌中表達(dá)的E3泛素連接酶,是骨骼肌萎縮發(fā)生的標(biāo)志蛋白[19]。王繼等[20]研究發(fā)現(xiàn),高脂膳食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠骨骼肌中MuRF1和Atrogin-1表達(dá)均顯著降低,而4周運(yùn)動(dòng)干預(yù)可有效降低骨骼肌中MuRF1和Atrogin-1表達(dá)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠骨骼肌中Atrogin-1和MuRF1蛋白表達(dá)明顯增加且骨骼肌纖維橫截面積明顯下降,說明肥胖小鼠體內(nèi)存在骨骼肌萎縮現(xiàn)象。8周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,肥胖小鼠Atrogin-1和MuRF1蛋白表達(dá)明顯減少且骨骼肌纖維橫截面面積明顯增加。Desmin是骨骼肌肌節(jié)外骨架蛋白,連接相鄰肌原纖維Z線和肌纖維膜,是維持骨骼肌Z線穩(wěn)定的重要蛋白[21]。本研究還發(fā)現(xiàn)高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠骨骼肌中Desmin排列紊亂、模糊甚至缺失,8周離心運(yùn)動(dòng)干預(yù)后肥胖小鼠骨骼肌中Desmin蛋白排列明顯趨于整齊并均勻分布。以上提示有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可能通過抑制骨骼肌萎縮、促進(jìn)修復(fù)來發(fā)揮提高肥胖小鼠運(yùn)動(dòng)能力并降低體重的作用。

炎癥是機(jī)體固有的保護(hù)性免疫機(jī)制,但慢性炎癥導(dǎo)致骨骼肌萎縮,被認(rèn)為是糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病等常見疾病的發(fā)病基礎(chǔ)[22]。同時(shí),諸多研究證實(shí)高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖與機(jī)體慢性炎癥的出現(xiàn)息息相關(guān)[23-24]。本研究接下來從骨骼肌炎癥角度探索有氧運(yùn)動(dòng)改善骨骼肌損傷并抑制骨骼肌萎縮,進(jìn)而提高運(yùn)動(dòng)能力、降低體重的可能途徑。研究表明,TNF-α和IL-1β是典型的促炎性細(xì)胞因子,參與機(jī)體慢性炎癥的發(fā)生與發(fā)展[25];IL-10是典型的抗炎性細(xì)胞因子,抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)并促進(jìn)組織修復(fù)[26]。本研究中高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠骨骼肌中出現(xiàn)明顯的炎癥浸潤(rùn),同時(shí)促炎因子TNF-α表達(dá)明顯增加、抗炎因子IL-10表達(dá)明顯減少,說明肥胖小鼠骨骼肌中存在慢性炎癥現(xiàn)象。8周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,肥胖小鼠骨骼肌中炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯減輕,促炎因子TNF-α和IL-1β表達(dá)明顯減少、抗炎因子IL-10表達(dá)明顯增加,提示有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可能通過降低骨骼肌中慢性炎癥反應(yīng)來改善肥胖誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮和運(yùn)動(dòng)能力下降,繼而發(fā)揮改善肥胖等慢性代謝性疾病的作用。

綜上所述,本研究從運(yùn)動(dòng)能力、骨骼肌骨架蛋白分布、骨骼肌纖維橫截面積及其萎縮標(biāo)志蛋白表達(dá)、骨骼肌炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及其炎癥因子蛋白表達(dá)4個(gè)方面證實(shí)高脂膳食相關(guān)肥胖誘發(fā)骨骼肌慢性炎癥反應(yīng),導(dǎo)致骨骼肌萎縮和運(yùn)動(dòng)能力下降;而有氧運(yùn)動(dòng)有效改善肥胖誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮,進(jìn)而發(fā)揮提高運(yùn)動(dòng)能力并改善肥胖的作用,骨骼肌組織中炎癥調(diào)節(jié)可能是其中的重要原因之一。