環(huán)境空氣暴露對豬糞懸液中菌群及代謝物的影響

孫靜陳奕齡丁玉春葛良鵬*

(1.重慶市畜牧科學(xué)院,重慶 402460;2.農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點實驗室,重慶 402460;3.重慶市養(yǎng)豬科學(xué)重點實驗室,重慶 402460;4.重慶市醫(yī)用動物資源開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心,重慶 402460)

目前,糞菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)已成為干預(yù)微生物組的主要手段之一。微生物組的可變性為FMT等治療性干預(yù)措施提供了希望,但也可能引起了嚴重的安全隱患。由于腸道微生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性高,無目的地干預(yù)措施可能會將微生物組轉(zhuǎn)移為不期望的狀態(tài),反而給健康帶來更意想不到的后果。比如,抗性基因的傳播[1-2]、產(chǎn)氣莢膜梭菌感染[3]等不良事件的發(fā)生。供體的選擇、供體糞便的處理方式、受試者的準備、移植方式和次數(shù)等都可能影響FMT的療效。目前,用于復(fù)發(fā)性CDI治療的FMT并無統(tǒng)一的標準和監(jiān)管,不同國家的政策差別較大[4]。在丹麥,J?rgensen等[5]采取了比較嚴格的供體篩選方法,包括病史、體格檢查、血液、糞便以及尿液檢查,僅約20%的參與者符合捐贈糞便資格。Ramai等[6]根據(jù)PubMed、MEDLINE、Google Scholar和Cochrane數(shù)據(jù)庫上FMT相關(guān)研究,推論證實FMT的成功并不取決于供體-患者的關(guān)系;Allegretti等[7]對1924例FMT治療艱難梭菌感染(Clostridioides difficileinfection,CDI)的數(shù)據(jù)進行分析,發(fā)現(xiàn)糞便運輸時間和糞便凍存時間對FMT療效的影響差異不明顯:糞便處理時長超過150 min,并未顯著降低FMT的療效;當糞便凍存時長超過1年甚至3年時,FMT的療效與凍存30 d內(nèi)的效果相似。

同樣是雜食動物,豬與人在消化道解剖學(xué)和生理學(xué)特征方面具有相似性。最近多項研究還利用無菌豬模型實現(xiàn)了動物腸道菌群“擬人化”的能力。比如,Zhang等[8]對無菌仔豬接種成人和嬰兒的糞便懸液,成功模擬了成人和嬰兒的腸道微生物群落結(jié)構(gòu);接種患有嚴重急性營養(yǎng)不良和中度急性營養(yǎng)不良的兒童的糞懸液構(gòu)建悉生豬模型,揭示了共生腸道菌群與宿主健康生長存在因果關(guān)系,闡明了治療兒童營養(yǎng)不良的方法[9]。此外,腸道微生物組與宿主動物的共同進化,它在營養(yǎng)消化與利用、抵御病原體、調(diào)節(jié)免疫和內(nèi)分泌等方面發(fā)揮的微生物作用,促使養(yǎng)豬生產(chǎn)對FMT這一策略的應(yīng)用也產(chǎn)生了興趣。比如,通過比較常規(guī)飼養(yǎng)豬和悉生豬或無菌豬的生理和代謝參數(shù)等來研究腸道微生物的作用[10];或使用FMT作為提高生豬飼料利用率的可能策略等[11]。Hu等[12]以金華豬為例,嘗試利用FMT方式調(diào)節(jié)雜種新生仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu),來改善腸道屏障和免疫功能。這些研究提示FMT在構(gòu)建悉生豬模型上的應(yīng)用廣泛,那么,對影響FMT的相關(guān)因素開展研究就十分必要。供體選擇、糞便樣本的處理、糞菌移植方式、糞菌庫建立以及安全性保障等是影響FMT實施和效果的幾個關(guān)鍵因素。本研究以SPF豬作為供體,在有氧或厭氧下處理并制備得到糞便懸液,比較環(huán)境空氣暴露對糞便懸液中微生物組和代謝產(chǎn)物的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

供體豬由重慶市畜牧科學(xué)院雙河實驗豬基地自繁獲得【SCXK(渝)2018-0002】。在符合現(xiàn)行國標(GB 14925-2010)規(guī)定的屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng),自由采食和飲水【SCXK(渝)2018-0002】。參考GB/T22914-2008《SPF豬病原的控制與監(jiān)測》標準,選擇健康的5頭成年雌性無特定病原級別(specific pathogen free,SPF)巴馬小型豬(耳號分別為13,14,69,77,78),體重約50 kg,包括非洲豬瘟病毒、豬瘟病毒、口蹄疫病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、乙型腦炎病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒、布魯氏菌、豬肺炎支原體、豬流感病毒、豬弓形蟲、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒在內(nèi)的13種病原均為陰性。經(jīng)重慶市畜牧科學(xué)院倫理委員會的許可(XKY-20150113),所有實驗均在重慶市畜牧科學(xué)院重慶國家現(xiàn)代畜牧業(yè)示范區(qū)實驗用豬工程中心完成(重慶榮昌)【SYXK(渝)2018-0002】。

1.1.2 供體豬糞便的收集

供體豬選定后,單欄飼養(yǎng)。采樣當天清晨,打掃其圈舍至無明顯殘留糞污。采用無菌密封采樣袋分別收集上述5頭供體豬的新鮮糞便,每頭各收集3份。其中1份直接放入液氮保存(未處理對照組,或稱C組),1份直接保存在低溫運輸箱(4℃)(有氧暴露組,或稱T1組),剩余1份轉(zhuǎn)入?yún)捬醪蓸雍?由密封培養(yǎng)罐和厭氧培養(yǎng)應(yīng)用袋制造厭氧環(huán)境,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,中國),再保存于低溫運輸箱(4℃)(厭氧暴露組,或稱T2組),在30 min內(nèi)運回實驗室進一步處理。

1.1.3 主要試劑與儀器

QIAamp DNA stool Mini Kit(QIAGEN公司);AxyPreDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司);TruSeqTM DNA Sample Prep Kit;色譜柱為BEH C18柱(100mm×2.1mm i.d.,1.7μm;Waters,Milford,USA)。厭氧工作站(英國DWS公司,型號DG250);潔凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司,型號DL-CJ-2ND1);QuantiFlourTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(美國Promega公司);PCR儀(美國ABI,GeneAmp9700型);高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀UHPLC-Q Exactive HF-X系統(tǒng)(賽默飛公司)。

1.2 方法

1.2.1 供體豬糞懸液的制備

豬供體糞便的處理上參考Pang等[13]描述的方法。T1組在超凈臺內(nèi)(氮氣約占78%,氧氣約為21%)完成糞懸液的制備,T2組在厭氧工作站內(nèi)(純氮氣和無氧混合氣體供應(yīng),氮氣＞80%,其余氣體為氫氣和二氧化碳)完成糞懸液的制備。制備過程在樣品采集后2 h內(nèi)完成。糞懸液的制備操作為:無菌密封勻漿袋內(nèi),新鮮糞便和滅菌水按照1∶5的比例混合均勻,再通過4層滅菌醫(yī)用紗布過濾,收集獲得糞懸液。每頭供體豬的新鮮糞便樣品(約2 g),各個糞懸液樣品抽取4 mL,用于細菌基因組的提取和非靶向代謝組分析;剩余糞懸液和滅菌甘油按照體積比9∶1混合,分裝成每管1 mL,-80℃保存。

1.2.2 測序與分析

(1)擴增子測序:采用CTAB/SDS方法提取各糞便樣品的總基因組DNA,然后用338F/806R引物擴增16S rRNA的V3-V4區(qū)域,ITS1F/ITS2R引物對擴增真菌ITS區(qū)域。利用Illumina Miseq測序平臺完成擴增子測序,微生物多樣性和組成的確定參考之前的分析方法[14]。

(2)非靶向代謝組:采用LC-MS分析平臺(賽默飛公司,超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜UHPLC-Q Exactive HF-X系統(tǒng))對15個豬糞便樣品進行代謝組學(xué)分析。樣品經(jīng)過前處理去除雜質(zhì)、提取代謝物,然后LC-MS正、負模式下分別上級檢測采集信息,得到代謝物的MS和MS/MS信息,采用Progenesis QI(Waters Corporation,Milford,USA)軟件進行搜庫鑒定,將MS和MS/MS質(zhì)譜信息與代謝數(shù)據(jù)庫(http://www.hmdb.ca/;http://metlin.scripps.edu/)進行匹配,最終得到代謝物列表及數(shù)據(jù)矩陣。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

細菌和真菌功能預(yù)測分析:利用Tax4Fun對16S RNA基因序列進行COG和KEGG功能注釋,獲得OTU在COG和KEGG各功能水平的注釋信息及各功能在不同樣本中的豐度信息。FUNGuild用于真菌功能分類分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

Student’st檢驗用于比較α多樣性(Shannon指數(shù)和Chao指數(shù))的組間差異;單因素方差分析用于比較組間微生物豐度差異;Heatmap分析展示不同分組/樣品在各分類學(xué)水平上的群落組成的相似性和差異性;組間差異檢驗采用ANOSIM分析方法;基于Bray-Curtis距離的PCoA分析展示各組樣品之間的微生物總體分布和離散程度;PCA用于觀察各組樣品之間的代謝物的總體分布和離散程度;PLSDA用于區(qū)分組間差異,變量重要性(variable importance,VIP)＞1用于篩選出對模型貢獻較大的變量。本研究以VIP＞1的變量作為差異代謝物或潛在標志物。采用Student’st檢驗結(jié)合OPLS-DA方法,篩選出組間差異代謝物(同時滿足VIP＞1,P＜0.05)。Spearman相關(guān)系數(shù)r展示菌群組成與差異代謝物豐度上的相關(guān)關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 細菌組成與豐度比較

利用338F/806R引物對,對C、T1和T2這三組共15個樣品中微生物群落測序,共獲得raw reads 645275*2,總堿基數(shù)目為388 455 550;優(yōu)化后有效序列數(shù)目為645 275,有效堿基數(shù)目為266 910 646;序列平均長度為413.64 bp(見表1)。

表1 基于Illumina Miseq測序平臺的16S rRNA V3-V4測序結(jié)果Table 1 Illumina Miseq sequencing of the V3-V4 region of the bacterial 16S rRNA gene

對97%相似水平下的細菌OTUs進行統(tǒng)計分析,15個樣品中共檢出1020個OTUs。C組、T1組和T2組檢出的OTUs數(shù)目分別為915、982以及968,其中856個OTUs在三組間共享。此外,FMT制備操作(T1或T2組)與C組在Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)上組間差異顯著(P＜0.05,圖1A,1B),提示需氧或厭氧下供體豬糞便的FMT制備操作均提高了樣品中菌群多樣性。相似性分析(ANOSIM檢驗)顯示R值為0.314(P=0.005),表明組間差異大于組內(nèi)差異,提示實驗分組成立。PCoA分析顯示T1與T2組在豬糞便菌群結(jié)構(gòu)上組間差異小,而與C組間差異明顯(圖1C)。

圖1 FMT制備處理對SPF級豬糞便樣品中細菌群落多樣性的影響Note.A.Student’s t test for Shannon index of OTU level.B.Student’s t test for Chao index of OTU level.C.PCoA analysis.*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 1 Influence of FMT preparation on bacterial community diversity in SPF pigs’fecal samples

FMT制備操作保存了新鮮供體糞樣中的全部細菌門,組間共享18種細菌門(圖2A)。其中,厚壁菌門(Firmicutes)的相對平均豐度在C、T1和T2組中分別為65.07%、62.39%和61.90%,其次為擬桿菌門(Bacteroidetes),它在C、T1和T2組中相對平均豐度分別為23.98%、32.72%和33.06%。FMT制備操作后,大部分細菌門的豐度組間差異不明顯(P＞0.05),僅顯著改變了黏膠球形菌門(Lentisphaerae)和互養(yǎng)菌門(Synergistetes)豐度(P=0.035和P=0.002)。兩者在C組中的相對豐度極低,在T1組的相對平均豐度分別為0.109%和0.037%,T2組中分別為0.019%和0.040%。值得注意的是,盡管螺旋體門(Spriochaetes)的豐度在組間差異不顯著(P＞0.05),但需氧下FMT制備操作后豐度從8.34%降低到1.28%,厭氧下降低為1.13%。該菌在C組各樣本中豐度變化較大,從2.18%～13.28%。這提示,FMT制備操作對豬糞便中的Spirochaetes豐度影響較大。Heatmap分析顯示T1和T2組菌落先聚類,再和C組聚類(圖2B)。

T1和T2組間細菌屬組成上無明顯差異,但豐度上差異明顯。相對豐度較高的細菌屬主要集中在Firmicutes和Bacteroidetes,比如Lchnospiraceae_XPB1014 group,Prevotellaceae_NK3B31 group,Ruminococcaceae UCG_005。和C組相比,T1和T2組的Terrisporobacter,Treponema_2的豐度顯著低于C組(P＜0.05),而Ruminococcaceae_UGC_005,Rikenellaceae_RC9_gutgroup以及Ruminococcaceae_NK4A214 group的豐度顯著高于C組(P＜0.05)(圖2C,2D)。

圖2 FMT制備處理對供體豬糞便細菌群落組成的影響Note.A.Barplot results of community abundance on bacterial phylum level.B.Heatmap results on bacterial genus level.C.Student’s t-test barplot on bacterial genus level between C and T1 groups.D.Student’s t-test barplot on bacterial genus level between group C and T2.*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 2 Influence of FMT preparation on bacterial community of SPF pigs’feces

2.2 真菌組成和豐度比較

利用ITS1F-ITS2R引物對,對各樣品中真菌群落組成情況進行測序。結(jié)果顯示raw reads數(shù)為898449*2,總堿基數(shù)目為540 866 298,有效堿基數(shù)目為245 604 522,具體測序信息見表2。

表2 基于Illumina Miseq sequencing平臺的真菌ITS1-ITS2區(qū)域的測序結(jié)果Table 2 Illumina Miseq sequencing of ribosomal RNA ITS1-ITS2 genomic region in fecal mycobiota

對97%相似水平下的真菌OTUs進行統(tǒng)計分析,15個樣品中共檢出158個OTUs。C組、T1組和T2組各檢出的OTUs數(shù)目分別為128、85和77個,其中3組間共享48個OTUs。Shannon指數(shù)組間差異不顯著(P＞0.05);C組與T1組、T2組之間在Chao指數(shù)上差異顯著(P＜0.01)。ANOSIM檢驗顯示R=-0.068,P＞0.05,提示豬糞便中真菌組成,組間差異不明顯,與PLS-DA分析結(jié)果相同(見圖3)。

圖3 FMT制備操作對供體豬糞便樣品中真菌群落多樣性的影響Note.A.Student’s t-test for Shannon index of OTU level.B.Student’s t-test for Chao index of OTU level.C.PLS-DA analysis.**P＜0.01.Figure 3 Influence of FMT preparation on the fungal community diversity in SPF pigs’fecal samples

C組共識別出128個真菌OTU,T1組識別出85個,T2組識別出77個OTU。群落組成分析結(jié)果顯示,C組以子囊菌門(Ascomycota)為主,相對平均豐度為63.26%;其次為擔子菌門(Basidionmycota)和Neocallimastigomycota,分別占27.13%和9.17%。當糞便經(jīng)過FMT制備操作處理后,無論是在需氧或厭氧條件下Ascomycota相對豐度大幅度提升,在T1組平均豐度達到87.65%,在T2組達到85.15%;而Neocallimastigomycota豐度降低到1%以下(T1組為0.25%,T2組為0.44%)。基于樣本中群落豐度數(shù)據(jù),結(jié)果顯示在真菌門上組間差異均不顯著(P＞0.05);節(jié)擔菌科(Wallemiaceae)、Sporidiobolaceae和Bulleribasidiaceae組間存在顯著差異(P＜0.05),這三種真菌科在C組的豐度很低,少于1%。Wallemiaceae在C組的平均豐度為0.999% ±1.049%,在T2組中豐度為0.476%±1.065%,但在T1組未檢出。在真菌屬上,節(jié)單菌屬(Wallemia)的豐度在組間存在差異,但它在C組和T2組中豐度也低于1%,在T1組中未檢出(圖4)。這提示這類真菌在需氧下FMT制備操作時,可能因為其含量過低而未被保存下來,而厭氧暴露似乎部分保存了這類真菌。

圖4 FMT制備處理對供體豬糞便真菌群落組成的影響Note.A.Barplot results of community abundance on fungal phylum level.B.One-way ANOVA barplot results of community abundance on fungal family level.C.One-way ANOVA barplot results of community abundance on fungal genus level.*P＜0.05.Figure 4 Influence of FMT preparation on fungal community of SPF pigs’fecal samples

2.3 菌群功能預(yù)測

利用Tax4Fun對樣品中細菌進行COG和KEGG pathway功能注釋和豐度比較,結(jié)果顯示共注釋到24個COG功能分類,組間豐度相似。其中,Carbohydrate transport and metabolism和Amino acid transport and metabolism豐度最高,相對豐度均超過8.0%(P＞0.05,圖5A)。KEGG pathway level1水平上共注釋到 cellular processes,environmental information processing,genetic information processing,human diseases,metabolism以及Organismal systems這6個KEGG通路,組間差異小(P＞0.05)。其中,注釋到metabolism的通路達到137個,但各相對豐度在組間差異不明顯(P＞0.05)。

FUNGuild通過微生態(tài)guild對真菌群落進行分類分析。由圖5B發(fā)現(xiàn),糞便中真菌的主要功能為腐生營養(yǎng)型,其中未定義腐生真菌(undefined Saprotroph)平均相對豐度在C組高達77.56%,T1組為87.92%,T2組為83.53%。C組中,Animal Endosymbiont-Plant Saprotroph平均相對豐度達到9.89%,略高于Animal Pathogen的平均相對豐度(7.35%)。相比之下,糞便經(jīng)過過濾處理后,Animal Endosymbiont-Plant Saprotroph豐度急劇減少,在T1組僅為0.34%,T2組為0.85%;其他功能分類,如Animal Pathogen,組間豐度差異不明顯(P＞0.05)。

圖5 T1、T2和C組中糞菌功能預(yù)測結(jié)果Note.A.The result of COG function classification of fecal bacterial community from donor pigs.B.The result of fungal functional annotation from donor pigs inferred by FUNGuild.Figure 5 Bacterial and fungal function classification in groups C,T1 and T2

2.4 代謝組分析

2.4.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控

利用LC-MS分析平臺測定15個豬糞便樣品中代謝物組成和豐度情況,并采用PCA對數(shù)據(jù)結(jié)果進行質(zhì)控分析。質(zhì)控樣本(Quality Control,QC)用于評價在上級過程中分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性。QC樣本相關(guān)性越高(越接近于1)表明測試方法穩(wěn)定性越好,數(shù)據(jù)質(zhì)量越高。在正負離子2個模式下,QC樣本相關(guān)性最小值為0.994,表明此次檢測方法穩(wěn)定,數(shù)據(jù)可信(見圖6)。通過PLS-DA得到模型評價參數(shù)(R2,Q2),R2和Q2值越接近1,表明模型越穩(wěn)定可靠;如果R2和Q2＜0.5,則模型可靠性較差。相關(guān)評價參數(shù)結(jié)果:C組與T2組比較時(即T2:C代謝集):R2X=0.513,R2Y=0.935,Q2=0.897;C組與T1組比較時(即T1:C代謝集):R2X=0.521,R2Y=0.614,Q2=0.451;說明模型構(gòu)建穩(wěn)定,數(shù)據(jù)可靠;T1與T2比較時(即T2:T1代謝集):R2X=0.326,R2Y=0.41,Q2=-0.709,提示T1和T2模型效果不好,這兩組間得到的差異物質(zhì)不可信。

圖6 QC樣本相關(guān)性分析結(jié)果Note.A.Positive ion mode.B.Negative ion mode.Figure 6 Results of QC sample correlation analysis

2.4.2 代謝物分類統(tǒng)計

利用代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB,www.hmdb.ca)對豬糞便中代謝物進行注釋。正、負離子模式下,402和195種代謝物被分類為14個超類別(superclass)和21個子類別(subclass)。其中,有243種代謝物注釋到“脂類和類脂分子”(lipids and lipid-like molecules),有54種代謝物注釋到“有機雜環(huán)化合物”(organoheterocyclic compounds),50種代謝物注釋到“有機酸和雜環(huán)化合物”(organic acid and derivatives)。子類別中,注釋到“氨基酸、肽和類似物”(amino acids,peptides and analogues),“脂肪酸和偶聯(lián)物”(fatty acids and conjugates)以及“膽汁酸、醇類和衍生物”(bile acids,alcohols and derivatives)的代謝物數(shù)量分別為41、26和25個。

2.4.3 差異代謝產(chǎn)物的篩選與鑒定

采用Student’st檢驗結(jié)合OPLS-DA,篩選出組間差異代謝物。同時滿足變量重要性VIP＞1,P＜0.05,差異倍數(shù)FC＞1或FC＜1。陽離子模式下T1-C代謝集篩選出差異代謝物數(shù)量為90個,T2-C代謝集篩選出差異代謝物數(shù)量122個,T2-T1代謝集篩選出差異代謝物3個。陰離子模式下T1-C代謝集篩選出差異代謝物65個,T2-C代謝集篩選出差異代謝物79個,T2-T1代謝集篩選出差異代謝物1個(見表3)。因此,T1:C代謝集篩選出的差異代謝物共有155個,T2:C代謝集篩選出的差異代謝物共有201個,它們之間共享的差異代謝物達142種。

表3 差異代謝物分析結(jié)果Table 3 Results of metabolite differential analysis

由于T2:T1代謝集模型擬合不可信,因此,本研究僅對T1:C和T2:C兩代謝集進行KEGG功能注釋與富集分析。T2:C代謝集注釋到“代謝”(metabolism)一級分類的代謝物最多。其中,“氨基酸代謝”(amino acid metabolism)二級分類通路下的代謝物個數(shù)達到為15個;其次為“脂質(zhì)代謝”(lipid metabolism)有10個。類似的,T1:C代謝集注釋到“代謝”一級分類下代謝物最多。其中,amino acid metabolism二級分類下代謝物為10個,和lipid metabolism分類下數(shù)目相同(圖7A,7B)。此外,對代謝集內(nèi)各代謝物在KEGG通路中進行通路富集和通路拓撲學(xué)分析。其中,代謝途徑D-Glutamine and D-glutamate metabolism(pathway ID:map00471;P＜0.01)的相對重要性最大,其次為Cutin,suberine and wax biosynthesis(pathway ID:map00073,P＜0.01),它們在T1:C和T2:C代謝集中的重要性得分均高于3.0(圖7C,7D)。

圖7 KEGG代謝通路富集和注釋結(jié)果Note.A.T1:C metabolite comparison.B.T2:C metabolite comparison.C.KEGG Topology analysis for T1:C metabolite comparison.D.KEGG Topology analysis for T2:C metabolite comparison.Figure 7 KEGG pathway classification.

2.4.4 樣本中代謝物組成與微生物群落組成相關(guān)性分析

圖8A,8B可知,T1:C代謝集豐度前10的差異代謝物為 2-Amino-2-methylbutanoate,(-)-Stercobilin、2,4-Dimethylpimelic acid、L-Proline、3’-Deaminofusarochromanone、 Gingerglycolipid B、Prednisolone、Spirolide D、Polysorbate 20以及PS(16∶0/18∶02(9Z,12Z)),它們與Spirochaetes的相對豐度均呈正相關(guān)。除(-)-Stercobilin外,其余差異代謝物與Spirochaetes呈顯著正相關(guān)(r＞0.60,P＜0.05);T2:C代謝集豐度前10的差異代謝物為PE(14∶0/0∶0)、Spirolide D、Gingerglycolipid B、Prednisolone、PE(14∶1(9Z)/18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z )、 2-Amino-2-methylbutanoate、 2,4-Dimethylpimelic acid、3’-Deaminofusarochromanone、4-[5-(3-hydroxypropyl)-1-benzofuran-2-yl]benzene-1,2-diol和Americanol,它們也與Spirochaetes的相對豐度呈正相關(guān)(r＞0.60,P＜0.05)。

將樣品中豐度前10的菌屬與上述差異代謝物進行相關(guān)性分析(圖8C,8D)。結(jié)果顯示,T1:C和T2:C代謝集中豐度前10的差異代謝物與Treponema_2呈正相關(guān)(r＞0.6,P＜0.05),而與Ruminococcaceae NK4A214 group和[Eubacterium]coprostanoligenesgroup呈負相關(guān)(r＜-0.4,P＜0.05)。提示糞便中這些特定菌屬的豐度與差異代謝物的產(chǎn)生密切相關(guān)。Spirochaetes在C組平均相對豐度為8.34%。有氧暴露下FMT制備操作后豐度降低為1.28%,厭氧下豐度降低到1.13%,降低倍數(shù)超過6.5倍。Treponema_2屬于Spirochaetes細菌,在C,T2和T1組中的相對豐度分別為(7.31%±4.90%),(0.69%±0.37%)和(0.81%±0.51%)。Ruminococcaceae NK4A214group屬于Firmicutes細菌,在C,T1和T2組中的相對豐度分別為(2.16%±0.25%)、(3.36%±0.91%)和(3.42%±0.62%)。[Eubacterium]coprostanoligenesgroup屬于Firmicutes細菌,在C、T1和T2組的相對豐度分別為(2.58%±0.37%)、(5.37%±2.33%)和(4.69%±1.01%)。這些菌群豐度受FMT制備操作而改變,并顯著影響包括2-Amino-2-methylbutanoate、2,4-Dimethylpimelic acid、Prednisolone、Spirolide D等在內(nèi)的多種代謝物的產(chǎn)生。

圖8 糞便細菌和真菌群落組成與代謝物水平的相關(guān)性分析Note.A.Correlation between metabolite and phylum-level microbial composition in T1:C metabolite comparison.B.Correlation between metabolite and phylum-level microbial composition in T2:C metabolite comparison.C.Correlation between metabolite and genus-level microbial composition in T1:C metabolite comparison.D.Correlation between metabolite and genus-level microbial composition in T2:C metabolite comparison.*Significant correlation.Red color.Positive correlation.Blue color.Negative correlation.Figure 8 Correlation analysis between microbial composition and metabolites in SPF pigs’fecal samples

3 討論

在以前的研究中,供體的作用已被證明是重要的[15]。SPF豬是在屏障或隔離環(huán)境下飼養(yǎng),排除了特定的病原微生物和寄生蟲的豬群,是優(yōu)良的動物實驗、生物制劑及生命科學(xué)研究用豬。因此,選擇SPF豬的糞便作為FMT的供體具備合理性。此外,多捐贈者方法已被證實可以提高供體微生物群落多樣性,有助于FMT后取得一個良好的結(jié)果[16]。因此,參照現(xiàn)行國家標準GB/T22914-2008,本研究最終選擇了5頭SPF巴馬小型豬作為FMT供體動物。

供體豬糞懸液的制備方法影響了樣品中菌群組成結(jié)構(gòu),這是影響FMT效果的又一重要因素。過去研究發(fā)現(xiàn)益生菌的活力對其發(fā)揮重用具有重要影響。然而,Andresen等[17]研究發(fā)現(xiàn)死菌也能對腸易激綜合征發(fā)揮益處;冷凍和新鮮糞便制劑對CDI具有相似的治療功效[18-20],提示糞便制劑中活菌數(shù)可能并不制約FMT的使用。制備FMT用的糞懸液時,短暫的有氧暴露和厭氧暴露均未顯著改變樣品中細菌和真菌組成,但影響了菌群的豐度。和未處理糞便樣品相比,有氧和厭氧操作都完整地保留了全部的細菌門分類,豬FMT用糞懸液中仍然是以Firmicutes和Bacteroidetes為主,和健康豬群的直腸微生物研究結(jié)果一致[21]。然而,有氧和厭氧下FMT制備操作導(dǎo)致了Spirochaetes細菌的豐度減少約8倍,Terrisporobacter的豐度減少3倍,Treponema_2豐度減少9倍以上。此外,結(jié)果顯示SPF巴馬小型豬糞便中真菌群落以Ascomycota,Basidionmycota和Neocallimastigomycota為主,FMT制備操作導(dǎo)致了糞便中真菌群落豐度的降低。比如,有氧處理組降低了糞便中Neocallimastigomycota的豐度超過36倍,厭氧處理組降低該菌的豐度也達到20倍。值得注意的,有氧或厭氧下FMT制備操作也造成Wallemina等低豐度菌群豐度的降低,甚至無法通過擴增子測序手段檢出。當然,FMT制備操作也提高了某些菌群的豐度,包括Ruminococcaceae UGC-005,Rikenellaceae RC9gutgroup以及Ruminococcaceae NK4A214 group的豐度都顯著高于未處理的糞樣(P＜0.05)。值得注意的是,Spirochaetes含有豬腸道內(nèi)與豬痢疾有關(guān)的主要病原,尤其是密螺旋體屬(Treponema)細菌[22]。本研究中,5頭供體豬糞便樣本按照NY/T545的方法完成了豬痢疾密螺旋體病病原檢測,結(jié)果為陰性。Treponema_2在15個樣本中均被檢出,并隨FMT制備操作豐度顯著降低(P＜0.05)。其中,它在未處理組的平均豐度為(7.31%±4.90%),在有氧暴露組為(0.81%±0.51%),在厭氧暴露組為(0.69%±0.37%)。此外,研究顯示對供體豬糞便樣品實施處理后,樣品中代謝物含量也發(fā)生改變,且厭氧下處理對供體豬糞便懸液中的代謝產(chǎn)物更具影響,畢竟與未處理組相比,厭氧暴露組中檢出了201種差異代謝物,而有氧暴露組中檢出155種差異代謝物。相關(guān)性分析結(jié)果揭示糞便中Treponema_2與多種代謝物的產(chǎn)生密切相關(guān)。值得注意的是,經(jīng)FMT制備操作后Spirochaetes豐度降低,更導(dǎo)致了Prednisolone和Spirolide D兩種代謝產(chǎn)物的減少。Spirolide D是一種脂溶性貝毒素,Prednisolone(中文名:波尼松龍)是常用的抗炎腎上腺皮質(zhì)激素類藥物,具有抗炎作用,這些結(jié)果提示本研究采用的糞便FMT制備操作方法可有效降低豬糞便中Treponema和Spirochaetes菌群的豐度,一定程度上提高了FMT的安全性。

目前,FMT不僅作為治療復(fù)發(fā)性CDI,恢復(fù)患者腸道多樣性的一種技術(shù)[23-24],還廣泛用于悉生動物模型的構(gòu)建,在宿主代謝、營養(yǎng)、免疫力以及藥物發(fā)現(xiàn)中腸道生態(tài)學(xué)的研究上發(fā)揮著重要作用。僅從這一出發(fā)點而言,沒有必要采用標準化的制備方法,但應(yīng)盡可能地保證移植的糞懸液反映的是供體原始的糞便微生物組。除制備時環(huán)境空氣暴露的差異外,研究使用的供體豬數(shù)量、動物個體差異以及新鮮糞便采集量、實驗操作時間、以及每份測序樣本中所含細菌、真菌以及代謝物含量的差異等都可能成為潛在影響因素。當然,在今后實際使用上可通過擴大供體豬數(shù)量和糞便采集量、自動化糞懸液制備、增加測序樣本重復(fù)數(shù)等操作來降低這些潛在問題。

4 結(jié)論

SPF巴馬小型豬糞便樣品中主要的細菌群落為Firmicutes和Bacteroidetes,主要的真菌群落為Ascomycota、Basidionmycota和Neocallimastigomycota。盡管處理時間短暫,糞懸液的制備操作仍強烈地降低了包括Spirochaetes、Terrisporobacter和Treponema_2在內(nèi)的細菌群落以及Neocallimastigomycota真菌群落的豐度,提高了Ascomycota的相對平均豐度,并顯著影響豬糞懸液中包括Prednisolone、Spirolide D等在內(nèi)的多種代謝物的產(chǎn)生。值得注意的是,有氧暴露對豬糞懸液中真菌群落豐度的影響高于厭氧暴露處理。結(jié)果提示,糞懸液的FMT制備操作有效地降低Treponema和Spirochaetes等有害菌群和相關(guān)代謝產(chǎn)物的豐度,提高了FMT的安全性。