背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體表達(dá)上調(diào)在糖尿病神經(jīng)痛中的作用

陳盧杭費(fèi)雪瑜康玉蓉王涵芝瞿思穎李想何曉芬方劍喬*蔣永亮*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)院,杭州 310053;2.浙江省針灸神經(jīng)病學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310053;3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)針灸研究所,杭州 310053)

糖尿病神經(jīng)痛(diabetic neuropathic pain,DNP)是糖尿病患者最常見的慢性并發(fā)癥之一,以刺激誘發(fā)性疼痛和自發(fā)性疼痛為主要表現(xiàn),發(fā)作時(shí)疼痛劇烈,嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量[1]。DNP臨床多見于糖尿病發(fā)展晚期,約10%～26%的糖尿病患者深受該并發(fā)癥的困擾[2]。DNP患者的臨床治療往往采用普瑞巴林、杜洛西汀和阿片類藥物等,但此類藥物作用有限,且長(zhǎng)期服用往往伴隨著嚴(yán)重的副作用[3],因此更好地闡明DNP的基本機(jī)制是目前亟待解決的問題。

P2X3屬于嘌呤信號(hào)受體家族成員之一,在最近幾年的報(bào)道中,炎癥及神經(jīng)損傷后體內(nèi)P2X3表達(dá)上調(diào)[4],阻斷P2X3或敲低P2X3可逆轉(zhuǎn)異常性疼痛[5]。P2X3在外周背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)神經(jīng)元中往往表達(dá)于中小直徑神經(jīng)元上[6]。已有研究表明,糖尿病神經(jīng)痛敏化的發(fā)生和維持與DRG神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)密切相關(guān)[7]。P2X3可能是神經(jīng)性疼痛新型的潛在治療靶標(biāo),但在糖尿病神經(jīng)痛中的作用還鮮見報(bào)道。

鏈脲佐菌素(STZ)是一種可以選擇性破壞胰島β細(xì)胞的抗生素。STZ被廣泛用于建立I型糖尿病動(dòng)物模型[8]。相對(duì)于通過其他方式,如遺傳誘導(dǎo)1的自發(fā)性糖尿病或高脂飲食(HFD)結(jié)合低劑量STZ創(chuàng)建的糖尿病動(dòng)物模型,STZ誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物模型由于其便利性和較低的成本,得到了廣泛的應(yīng)用[9-11]。因此,為了進(jìn)一步探究背根神經(jīng)節(jié)P2X3在DNP模型中的作用,本實(shí)驗(yàn)通過單次大劑量腹腔注射STZ(65 mg/kg)建立糖尿病神經(jīng)痛大鼠模型,在STZ注射后7、14、21 d采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)P2X3的表達(dá),并觀察其拮抗劑TNP-ATP對(duì)糖尿病神經(jīng)痛大鼠的干預(yù)效應(yīng),以期為臨床DNP患者的治療提供新的思路與靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

45只6周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠,體重(190±15)g,購(gòu)買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司【SCXK(滬)2017-0005】,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(浙)2018-0012】飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境:晝夜周期12 h/12 h,溫度恒定,濕度恒定。所有實(shí)驗(yàn)均符合浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào):IACUC-20180723-08)。

1.1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素STZ(S0130,美國(guó)Sigma);P2X3抑制劑TNP-ATP(2464,美國(guó)Tocris);兔抗P2X3(APR-002,以色列Alomone);Alexa Fluor 488驢抗兔IgG H&L(ab150065,美國(guó)Abcam);動(dòng)態(tài)足底測(cè)痛儀(意大利UGO BASILE,37450);冷凍切片機(jī)(NX50,德國(guó)Thermo);羅氏卓越型血糖儀(Roche ACCUCHEK Performa);A1R共聚焦顯微鏡(A1R,日本Nikon)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型大鼠造模

禁食16 h后,對(duì)模型組大鼠予以一次性腹腔注射STZ溶液,按照65 mg/kg的劑量進(jìn)行注射,于0.1 mmol/L的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液中溶解STZ,并將溶液的PH值調(diào)整為4.5,所有溶液當(dāng)天使用。在STZ注射后第7天,禁食8 h,對(duì)大鼠進(jìn)行尾靜脈采血從而測(cè)定其血糖水平,糖尿病模型建立成功的納入標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖水平大于16.7 mmol/L。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與實(shí)驗(yàn)干預(yù)

本實(shí)驗(yàn)主要分兩部分進(jìn)行:(1)在20只實(shí)驗(yàn)大鼠中選取14只作為實(shí)驗(yàn)組,對(duì)其進(jìn)行禁食16 h后腹腔注射STZ,剩余大鼠注射檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖液進(jìn)行對(duì)照。觀察大鼠STZ注射前(Base)、注射后7、14、21 d PWT情況,并取大鼠L4-L6 DRG進(jìn)行免疫熒光法測(cè)試,檢測(cè)其各時(shí)間點(diǎn)P2X3受體陽性細(xì)胞表達(dá)率。(2)取25只健康雄性SD大鼠,隨機(jī)分為正常+生理鹽水(Control+NS,n=6)組和STZ腹腔注射組(n=19),剔除1只未成模大鼠后,將18只造模成功的DNP大鼠隨機(jī)分為模型+生理鹽水(DNP+NS,n=6)組、模型+50 nmol P2X3抑制劑TNP-ATP組(DNP+50 nmol TNP-ATP,n=6)和模型+100 nmol P2X3抑制劑TNP-ATP組(DNP+100 nmol TNP-ATP,n=6)。觀察50 nmol與100 nmol TNP-ATP或NS干預(yù)前和干預(yù)后0.5、1、1.5 h PWT,同時(shí)觀察50 nmol與100 nmol TNP-ATP連續(xù)注射7 d后PWT變化情況。

1.2.3 機(jī)械痛閾檢測(cè)

檢測(cè)方法:將大鼠于測(cè)量前置于塑料盒進(jìn)行適應(yīng),待到大鼠安靜后進(jìn)行測(cè)量。取大鼠左側(cè)后足進(jìn)行機(jī)械痛覺刺激。對(duì)準(zhǔn)大鼠左后足中央啟動(dòng)儀器,金屬針以恒定速度上行,刺激力度逐漸遞增直至大鼠縮足。檢測(cè)每隔5 min進(jìn)行1次,每只大鼠進(jìn)行5次測(cè)試,去掉最大值與最小值后計(jì)算平均數(shù)。

1.2.4 免疫熒光法檢測(cè)DRG神經(jīng)元上P2X3受體陽性細(xì)胞表達(dá)

使用戊巴比妥(80 mg/kg)麻醉大鼠,使用生理鹽水對(duì)大鼠主動(dòng)脈進(jìn)行灌注至肝變白,再使用4%多聚甲醛進(jìn)行灌注,取出L4-L6 DRG后使用蔗糖溶液梯度脫水,液氮冷凍后置于-80℃冰箱保存。使用OCT包埋,行10μm厚度的冰凍切片。使用TBST漂洗3次,將樣本放置于含兔抗P2X3(1∶800)的TBST溶液中進(jìn)行孵育,次日復(fù)溫。加入驢抗兔IgG H&L(1∶800)進(jìn)行孵育后漂洗,后轉(zhuǎn)移至載玻片封片。每組選擇3只大鼠,每只大鼠L4-L6 DRG每個(gè)節(jié)段取3～5張切片,使用激光共聚焦顯微鏡取得圖像,使用Image J圖像軟件進(jìn)行分析,并計(jì)算陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.2.5 藥物干預(yù)

將TNP-ATP溶于生理鹽水中,干預(yù)方式參照文獻(xiàn)的方法[11-12],在大鼠左后足足背行藥物注射,DNP+50 nmol TNP-ATP大鼠注射量為50 nmol,DNP+100 nmol TNP-ATP大鼠注射量為100 nmol,注射體積為50μL;連續(xù)7 d注射藥物量同上。Control+NS組和DNP+NS組大鼠注射等體積生理鹽水。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±sˉx)表示。所有數(shù)據(jù)均用GraphPad Prism 5和SPSS 19.0軟件處理,多組間使用單因素ANOVA分析,兩組間使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病模型的建立

使用STZ腹腔注射建立糖尿病大鼠模型,模型組大鼠在STZ注射7 d后較正常組空腹血糖顯著升高(P＜0.01),并維持到第21天(見圖1)。

圖1 模型組與正常組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)空腹血糖(n=6)Note.Compared with the control group,**P＜ 0.01.(The same in the following figures)Figure 1 Fasting blood glucose at different time points in model and control rats(n=6)

2.2 各時(shí)間點(diǎn)機(jī)械痛閾變化情況

模型組與正常組比較,PWT在STZ注射前無顯著性差異(P＞0.05);同時(shí),兩組在STZ注射后第7天PWT仍無明顯差異(P＜0.05);STZ注射后第14天和第21天模型組PWT較正常組大鼠降低(P＜0.01)(見圖2)。

圖2 模型組與正常組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)機(jī)械痛閾變化情況(n=6)Figure 2 Changes of PWT in model group and control group rats at different time points(n=6)

2.3 各時(shí)間點(diǎn)不同大鼠P2X3陽性細(xì)胞表達(dá)情況

與正常組比,STZ注射第7、14、21天后大鼠L4、L5 DRG上P2X3陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(P＜0.01),STZ注射第14、21天后大鼠L6 DRG上P2X3陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多(P＜0.01)(見圖3)。

圖3 模型組大鼠L4-L6 DRG上P2X3表達(dá)情況和陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=3)Figure 3 P2X3 expression on L4-L6 DRG and statistical results of positive cells in model group rats(n=3)

2.4 單次注射TNP-ATP對(duì)DNP大鼠模型的鎮(zhèn)痛作用

為了探究TNP-ATP是否可以有效緩解糖尿病神經(jīng)痛,在第15天給予單次TNP-ATP(50、100 nmol)。在TNP-ATP注射前(0 h)、注射后0.5、1、1.5 h進(jìn)行機(jī)械縮爪閾值測(cè)試(見圖4)。與溶劑對(duì)照組相比,以50 nmol的劑量注射TNP-ATP對(duì)PWT無明顯改善。但是,以100 nmol的劑量注射TNPATP可以顯著增加大鼠PWT,表明了TNP-ATP對(duì)DNP大鼠糖尿病神經(jīng)痛有作用。PWT的上調(diào)在0.5 h開始且達(dá)到峰值,并持續(xù)至少1 h。

圖4 單次注射TNP-ATP對(duì)DNP大鼠機(jī)械痛閾的影響(n=6)Note.Compared with the control+NS group,**P＜0.01.Compared with the DNP+NS group,##P＜0.01.(The same in the following figure)Figure 4 Effect of TNP-ATP Single injection on PWT in DNP rats(n=6)

2.5 多次注射TNP-ATP對(duì)DNP大鼠模型的鎮(zhèn)痛作用

為了確定TNP-ATP重復(fù)治療是否對(duì)DNP大鼠具有鎮(zhèn)痛作用,從第14天到第21天每天給予TNPATP(50、100 nmol),連續(xù)7 d。如圖5所示,每日1次,重復(fù)注射7次TNP-ATP(100 nmol)可明顯提高DNP大鼠的PWT。同時(shí),與溶劑對(duì)照組處理的DNP大鼠相比,重復(fù)給予低劑量的TNP-ATP(50 nmol)的DNP大鼠PWT無明顯變化。

圖5 單次注射TNP-ATP對(duì)DNP大鼠機(jī)械痛閾的影響(n=6)Figure 5 Effect of TNP-ATP Multiple injection on PWT in DNP rats(n=6)

3 討論

高血糖所引發(fā)的糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)病中的細(xì)胞和分子機(jī)制仍未完全闡明,但大量文獻(xiàn)證實(shí),高血糖會(huì)導(dǎo)致周圍神經(jīng)末梢受損,導(dǎo)致糖尿病患者的長(zhǎng)期疼痛。在這項(xiàng)研究中,以大鼠作為模型動(dòng)物研究了P2X3的表達(dá)對(duì)糖尿病神經(jīng)病理痛各個(gè)階段的影響。結(jié)果顯示,單次大劑量的STZ注射可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)1型糖尿病癥狀。大鼠在STZ注射后14 d,出現(xiàn)明顯的DNP癥狀,即疼痛的超敏行為,如機(jī)械性異常性疼痛[13-15],同時(shí)伴有DRG中P2X3表達(dá)升高。我們發(fā)現(xiàn)P2X3非特異性拮抗劑TNP-ATP可抑制DNP機(jī)械痛覺超敏反應(yīng)。綜上所述,這些發(fā)現(xiàn)表明DNP可能是由背根神經(jīng)節(jié)P2X3表達(dá)升高所介導(dǎo)的。

目前人們已使用了多種不同的方法建立DNP動(dòng)物模型。例如,自發(fā)性糖尿病動(dòng)物,如WBN/Kob大鼠和Ins2 Akita小鼠[16-17];或遺傳缺陷導(dǎo)致的糖尿病模型,如C57BL/Ks(db/db)小鼠模型[18];以及高脂高糖飲食或藥物(四氧嘧啶或STZ)誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物[19-21]。然而,STZ誘發(fā)的糖尿病操作簡(jiǎn)單,價(jià)格低廉,所以被廣泛用于糖尿病模型建立。小鼠,大鼠和猴子等動(dòng)物體內(nèi)胰腺β細(xì)胞對(duì)STZ刺激相當(dāng)敏感,無論是腹膜內(nèi)(I.P.)或靜脈內(nèi)(I.V.)注射STZ均可對(duì)胰腺β細(xì)胞具有直接的細(xì)胞毒性,因此它們是誘導(dǎo)1型糖尿病的首選[22-23]。因此,通過單次腹腔注射大劑量STZ(65 mg/kg)建立了1型糖尿病大鼠模型。STZ注射后,大鼠空腹血糖升高和PWT降低表明成功建立了DNP大鼠模型。

之前已有多項(xiàng)研究表明P2X3活化參與了神經(jīng)病理痛[24-25],P2X3受體高選擇性大量地表達(dá)于處理痛覺信息的DRG中小直徑神經(jīng)元上,激活后可使Ca2+、Na+內(nèi)流,K+外流,廣泛參與痛信號(hào)產(chǎn)生、傳導(dǎo)和痛敏化調(diào)制,在多種神經(jīng)痛敏化中起著重要作用[26]。由于P2X3對(duì)極低濃度的ATP敏感,因此可以使用不同的ATP濃度來調(diào)節(jié)嘌呤能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[27]。ATP通過改變感覺神經(jīng)元電壓門控離子通道活性(包括CaV和NaV)來調(diào)節(jié)疼痛敏感性[28-29],TNP-ATP是ATP的結(jié)構(gòu)類似物,其重要作用位點(diǎn)廣泛分布于P2X1～P2X4受體[30],可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合于P2X3受體細(xì)胞外ATP結(jié)合位點(diǎn),其抑制作用起效快、可逆,且不表現(xiàn)出使用依賴性,是理想的P2X3受體抑制劑[31]。

在本研究中,發(fā)現(xiàn)模后7 d時(shí),DRG中P2X3表達(dá)有一定程度增多,而此時(shí)大鼠痛閾并未出現(xiàn)明顯變化;而模后14～21 d,隨著P2X3表達(dá)逐漸增加,外周敏化逐漸形成,大鼠PWT明顯下降。同時(shí),發(fā)現(xiàn)較低劑量的TNP-ATP無法緩解STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的機(jī)械痛覺超敏反應(yīng),而當(dāng)施用高劑量TNPATP時(shí),卻可有效的緩解疼痛,說明P2X3可能參與了大鼠糖尿病神經(jīng)病理痛。

綜上所述,腹腔注射STZ可成功誘導(dǎo)DNP大鼠模型,背根神經(jīng)節(jié)P2X3表達(dá)上調(diào)可能參與糖尿病神經(jīng)痛形成,為DNP的臨床治療提供了嶄新的策略與思路。