脊髓A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞在外周炎性痛中的動(dòng)態(tài)變化

李倩李玲玲李爽黃楚天周君梅

(上海市兒童醫(yī)院,上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,上海 200040)

外周炎性痛是外周局部組織炎性病變或損傷時(shí)引起的疼痛不適[1]。長期的炎性痛限制肢體活動(dòng)、干擾患者情緒,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。

炎性痛的神經(jīng)機(jī)制復(fù)雜,外周傷害性信號(hào)沿感覺傳入神經(jīng)持續(xù)傳入中樞,可使脊髓內(nèi)產(chǎn)生以膠質(zhì)細(xì)胞激活、促炎性細(xì)胞因子升高為特征的神經(jīng)炎癥反應(yīng),引起神經(jīng)元敏化,疼痛信號(hào)級(jí)聯(lián)放大,導(dǎo)致感覺超敏與痛覺過敏等異常[2]。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的一類細(xì)胞,對(duì)神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。當(dāng)外周受到傷害性刺激時(shí),脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞可被激活,數(shù)量增生、形態(tài)肥大,稱為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞[3]。最新研究表明反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞可向A1和A2兩種不同的表型極化,A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌促炎性細(xì)胞因子,誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥以及神經(jīng)元功能損害,具有神經(jīng)毒性;A2星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子,促進(jìn)神經(jīng)元和組織修復(fù),具有神經(jīng)保護(hù)性[4]。但在外周炎癥導(dǎo)致的炎性痛過程中,脊髓A1、A2兩種反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化,尚不清楚。本研究旨在探討脊髓A1、A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞在炎性痛小鼠脊髓中的動(dòng)態(tài)變化,為進(jìn)一步闡明外周炎性痛的機(jī)制提供可能線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

34只6～8 周齡成年雄性清潔級(jí)C57BL/6小鼠,體重25～30 g,由上海靈暢生物科技有限公司提供【SCXK(滬)2018-0003】。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部飼養(yǎng)【SCXK(滬)2018-0021】,晝夜各半循環(huán)照明,濕度恒定,溫度控制在22～25℃。所有操作均符合上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及倫理委員會(huì)要求(審批號(hào):LLSC2020074)。

1.1.2 主要試劑與儀器

CFA(F5881-10 mL,Sigma);GFAP抗體(MAB360,MERCK);C3抗體(ab200999,Abcam);FITC-donkey anti mouse抗體(715-095-150,Jackson);Cy3-donkey anti rabbit抗體(711-165-152,Jackson)。von Frey弗萊毛(Stoelting,美國);IITC熱輻射痛覺測量儀(Life Science Instruments,美國);ND2000自動(dòng)分光光度計(jì)(Thermo,美國);熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(Roche,瑞士)激光共聚焦顯微鏡(Leica,德國)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立

外周炎性痛小鼠模型制備:抓取小鼠右后爪,足底注射完全弗氏佐劑20μL。對(duì)照組小鼠足底注射相同體積的生理鹽水。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥方法

將16只小鼠隨機(jī)分為足底炎性痛組(CFA組)和對(duì)照組(Saline組),每組8只。

1.2.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

分別在造模前1 d、造模后第1、3、5、7天測定小鼠的機(jī)械刺激縮足閾值(mechanical withdraw threshold,MWT)和輻射熱刺激縮爪潛伏期(paw withdrawal latency,PWL)。MWT具體方法如下:將動(dòng)物放在鋪有鐵絲網(wǎng)的塑料籠中,并在測試前連續(xù)2～3 d使其適應(yīng)。在測試日,將小鼠置于籠中適應(yīng)至少30 min。然后,在測試過程中使用von Frey弗萊毛(0.02、0.04、0.07、0.16、0.4、0.6、1.0和1.4 g)垂直刺激后爪的足底正中。采用Dixon介紹的Up-and-Down法計(jì)算小鼠的50%MWT[5]。PWL具體方法如下:將小鼠分別放置在鋪有玻璃板的透明塑料籠中,連續(xù)2～3 d的適應(yīng)期。在測試前1 d禁水,測試當(dāng)天適應(yīng)至少30 min后,將輻射熱隔玻璃板施加到后爪足底表面,直到小鼠將其爪子從玻璃板上抬起。縮爪潛伏期為從施加輻射熱開始到小鼠縮爪的時(shí)間,截止時(shí)間設(shè)置為20 s[6]。

1.2.4 用免疫熒光法測定脊髓GFAP、C3表達(dá)

分別在造模前以及造模后第7天各取材3只小鼠,采用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后灌流固定取材,取脊髓腰膨大段組織,經(jīng)20%及30%蔗糖梯度脫水沉底后,進(jìn)行冰凍切片。脊髓切片采用漂片法進(jìn)行免疫熒光染色,依次進(jìn)行封閉、一抗孵育4℃過夜(抗GFAP一抗1∶800,抗C3一抗1∶200)、漂洗、熒光二抗37℃孵育1 h(FITC或Cy3標(biāo)記的二抗1∶300)、封片,激光共聚焦顯微鏡觀察采集結(jié)果。

1.2.5 用RT-PCR法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)

分別在造模前以及造模后第1、3、7天,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材3只小鼠,采用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后新鮮取材脊髓腰膨大段組織,采用RNA提取試劑盒提取脊髓組織的總RNA。用分光光度計(jì)檢測RNA濃度,取RNA 1μg采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

PCR 引 物: GFAP 上 游 引 物 5′-CACCTACAGGAAATTGCTGGAGG-3′,下游引物5′-CCACGATGTTCCTCTTGAGGTG-3′;Lcn2上游引物5′-ATGTCACCTCCATCCTGGTCAG-3′,下游引物5′-GCCACTTGCACATTGTAGCTCTG-3′;Serping1上 游引物5′-TTGCCTGTGTCCACCAAGCACT-3′,下游引物5′-GCTGCTTCCATACAGGCTCTGA-3′;H2-T23上游引物5′-GTGGCTCCATAGATACCTACGG-3′,下游引物5′-GGTGATGTCAGCAGGGTAGAAG-3′;S100a10上游引物5′-GACAAAGGAGGACCTGAGAGTG-3′,下游 引 物5′-CTCTGGAAGCCCACTTTGCCAT-3′;Ptx3上游引物5′-CGAAATAGACAATGGACTTCATCC-3′,下游引物5′-CATCTGCGAGTTCTCCAGCATG-3′。按照說明書,PCR反應(yīng)體系中加入上下游引物,逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA,以SYBR Green作為熒光標(biāo)記物,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。結(jié)果以2-△△Ct表示靶基因的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±sˉx)表示,行為學(xué)數(shù)據(jù)分析采用雙因素方差分析,分子實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析,組間多重比較采用Bonferroni檢驗(yàn),P＜0.05為差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFA炎性痛小鼠行為學(xué)變化

使用雄性C57BL/6小鼠成功建立了CFA炎性痛小鼠模型。造模前CFA組與對(duì)照組小鼠MWT分別為(0.78±0.06),(0.76±0.04),二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。造模后第7天,CFA組與對(duì)照組小鼠MWT分別為(0.24±0.06),(0.74±0.07)。與對(duì)照組相比,CFA組MWT在造模后第1、3、5、7天均具有顯著性差異(P＜0.05)。而對(duì)照組造模前以及造模后各時(shí)間點(diǎn)均無顯著性差異(P＞0.05)(見圖1A)。

造模前CFA組與對(duì)照組PWL分別為(10.16±0.58),(10.33±1.01),二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。造模后第1天CFA組小鼠造模側(cè)PWL顯著下降,造模后第7天,CFA組與對(duì)照組PWL分別為(3.59±0.58),(10.36±0.81)。與對(duì)照組相比,CFA組PWL在造模后第1、3、5、7天均具有顯著性差異(P＜0.05)。而對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)均無顯著性差異(P＞0.05)(見圖1B)。

圖1 CFA炎性痛小鼠機(jī)械刺激縮足閾值(MWT)和輻射熱刺激縮爪潛伏期(PWL)變化(±sˉx,n=8)Note.Compared with Saline group,*P＜0.05.Figure 1 Time course of the mechanical withdraw threshold(MWT)and the paw withdrawal latency(PWL)in mice treated with CFA or saline(±sˉx,n=8)

2.2 CFA炎性痛小鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞激活過程

RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與造模前相比,CFA炎性痛造模后第3天脊髓內(nèi)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、Lcn2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為(1.84±0.10),(4.64±0.61),較造模前升高(P＜0.05),造模后第7天,GFAP、Lcn2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為(2.05±0.20),(5.43±0.34),與造模前相比具有顯著性差異(P＜0.05)(見圖2)。表明CFA炎性痛小鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞激活。

圖2 CFA炎性痛小鼠脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、Lcn2表達(dá)變化(±sˉx,n=3)Note.Compared with D0,*P＜0.05.(The same in the following figures)Figure 2 RT-PCR analysis showing the time courses in expression changes of the GFAP and Lcn2 in the spinal cord of CFA-treated mice(±sˉx,n=3)

免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與造模前相比,CFA組造模后第7天脊髓背角GFAP信號(hào)水平顯著升高,可以看到星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多、形態(tài)肥大(見圖3)。

圖3 CFA炎性痛小鼠造模前及造模后第7天脊髓背角GFAP表達(dá)(n=3)Note.A’,B’.Partially enlarged picture of A and B.Figure 3 Confocal images show the GFAP immunoreactivity in the ipsilateral spinal dorsal horn of CFA-treated mice before and 7 days after CFA injection(n=3)

2.3 CFA炎性痛小鼠脊髓A1、A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)變化

RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CFA組造模后第7天脊髓內(nèi)A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Serping1、H2-T23的mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為(2.54±0.12),(2.31±0.12),與造模前D0相比有顯著升高(P＜0.05,見圖4A,4B)。A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞極化標(biāo)志物S100a10、Ptx3的mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯下降,且在造模后第7天分別為(0.57±0.15),(0.40±0.04),較造模前均有顯著差異(P＜0.05,見圖4C,4D),提示CFA炎性痛小鼠脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1亞型極化。

圖4 CFA炎性痛小鼠脊髓A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Serping1、H2-T23以及A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物S100a10、Ptx3表達(dá)變化(±sˉx,n=3)Figure 4 RT-PCR analysis showing the time courses in expression changes of the A1 astrocyte maker Serping1,H2-T23 and the A2 astrocyte maker S100a10,Ptx3 in the spinal cord of CFA-treated mice(±sˉx,n=3)

2.4 A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物C3的表達(dá)

免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CFA組在造模后第7天脊髓背角內(nèi)A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物C3相對(duì)熒光強(qiáng)度為(1.74±0.08),C3與GFAP的共定位信號(hào)相對(duì)熒光強(qiáng)度為(4.46±0.38),水平較造模前顯著升高(P＜0.05,見圖5)。

圖5 CFA炎性痛小鼠造模前與造模后第7天脊髓背角A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物C3表達(dá)以及與GFAP共標(biāo)變化(±sˉx,n=3)Note.C’,D’.Locally amplified C3 signal in frame C and D.C’,D’.Locally enlarged picture in frame C and D.Figure 5 Confocal images show the GFAP immunoreactivity(green)and C3(red)in the ipsilateral spinal cord dorsal horn of CFA-treated mice at D0 and D7 after injection(±sˉx,n=3)

3 討論

外周炎性痛是最常見的臨床癥狀之一,常伴發(fā)于局部損傷以及關(guān)節(jié)肌肉炎癥等病理過程,持續(xù)存在的炎性痛,可干擾患者情緒,繼發(fā)新的精神疾病[7]。CFA誘導(dǎo)的足底炎性痛具有造模簡單、行為學(xué)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),且疼痛持續(xù)時(shí)間可長達(dá)2月,是被廣泛使用的炎性痛模型[8]。本研究發(fā)現(xiàn),小鼠CFA注射后1 d,注射區(qū)域即出現(xiàn)明顯充血、腫脹,在造模后第1、3、5、7天,造模側(cè)PWL及MWT均顯著降低,與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,此結(jié)果與以往研究結(jié)果相一致[9]。

在慢性痛的發(fā)生發(fā)展中,脊髓內(nèi)神經(jīng)炎癥是公認(rèn)的病理機(jī)制之一[10]。星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞激活生成的細(xì)胞因子、趨化因子可作用于神經(jīng)元表面受體,使神經(jīng)元興奮性增高,促進(jìn)痛行為維持[11]。有研究表明,炎性痛患者腦脊液中促炎性細(xì)胞因子水平升高,關(guān)節(jié)炎模型小鼠脊髓內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞激活[12-13]。在本研究中,CFA炎性痛小鼠在造模后第3天,脊髓內(nèi)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)升高,而形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示背角星形膠質(zhì)細(xì)胞增生肥大,進(jìn)一步證實(shí)脊髓內(nèi)存在星形膠質(zhì)細(xì)胞激活。

在炎癥等刺激下,反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞可向A1和A2兩種不同的表型極化。A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞可釋放傷害性信號(hào)分子,同時(shí)因其正常的吞噬、營養(yǎng)等功能降低,進(jìn)而加劇了神經(jīng)元的功能損害[14-15]。目前,關(guān)于A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)退行性疾病中的報(bào)道最多,如阿爾茨海默病、帕金森病[16-17],而其在慢性痛中的相關(guān)報(bào)道比較有限。有研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠脊髓背角中,A1型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯增加[18]。本研究通過RT-PCR、免疫熒光等方法發(fā)現(xiàn)CFA小鼠脊髓內(nèi)A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)升高,表明炎性痛小鼠脊髓存在A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞極化。

關(guān)于誘導(dǎo)A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞極化的分子機(jī)制,目前有研究證實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞激活后釋放的IL-1α、TNF和C1q可在直接體外誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活并向A1表型極化[19]。除此以外,有研究在術(shù)后痛大鼠模型上證實(shí),小膠質(zhì)細(xì)胞可通過下調(diào)CXCR7/PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1表型極化[20]。而在本研究中所使用的CFA炎性痛小鼠模型,大量文獻(xiàn)證實(shí)其在造模后早期即存在脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活[21]。炎性痛早期脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞被激活,促使星形膠質(zhì)細(xì)胞激活并向A1型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞極化,進(jìn)而參與脊髓神經(jīng)炎癥反應(yīng),促進(jìn)炎性痛的發(fā)生發(fā)展。提示,A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞可能成為外周炎性痛治療的干預(yù)靶點(diǎn)。