貽貝粘蛋白粘附性及抗氧化作用對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究

劉朝陽(yáng)吳琳琳田茂生張明全趙娜高記華

(1.河北中醫(yī)學(xué)院,石家莊 050091;2.河北中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,石家莊 050011)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性炎癥性腸病,臨床表現(xiàn)為持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹瀉、黏液膿血便等癥狀,具有病程長(zhǎng)、易反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)[1-4]。UC的黏膜炎癥從直腸開始,并以連續(xù)的方式向結(jié)腸近端延伸,且炎癥通常局限于黏膜層[1]。研究顯示,UC是一種腸道屏障疾病,其腸道屏障的功能障礙主要體現(xiàn)在緊密連接的表達(dá)變化,以及在炎癥狀態(tài)下,黏膜的黏附性下降[5]。且高濃度自由基水平和抗氧化能力低下為UC的主要病因之一,所以清除氧自由基、抑制過(guò)氧化可以預(yù)防并治療潰瘍性結(jié)腸炎[6]。目前臨床多采用口服藥物治療UC,由于UC直腸炎癥反應(yīng)致大量腸液分泌及腹瀉,一般外用藥難以維持直腸給藥的藥物治療濃度,且以局部治療為主的直腸給藥制劑匱乏,所以尋找一種粘附性高、具有良好抗氧化作用的直腸給藥制劑是解決問(wèn)題的有效途徑。

貽貝粘蛋白(mussel adhesive protein,MAP)是海洋貽貝的足絲腺分泌并純化的大分子蛋白,該蛋白與高等植物細(xì)胞壁中的伸展蛋白相似,是一種屬于糖蛋白類型的粘液蛋白,具有超強(qiáng)的黏著性能[7]。MAP具有搭載高載量正電荷、多巴基團(tuán)可氧化成膜以及良好疏水性等結(jié)構(gòu)特點(diǎn),可形成具有抗氧化能力的納米級(jí)網(wǎng)狀微觀支架,從而抑制炎癥,并促進(jìn)多種細(xì)胞貼壁和爬行替代[8-9]。貽貝足絲蛋白中含有大量的L-3,4-二羥基苯丙氨酸(DOPA),該基團(tuán)在堿性和過(guò)量甘氨酸作為還原劑的條件下,可參與發(fā)生氧化還原反應(yīng)。研究顯示,活性氧的代謝產(chǎn)物在UC的炎癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要的作用[10],超氧陰離子自由基(O2-)是分子氧的單電子還原產(chǎn)物,具有較高的反應(yīng)活性,極易衰變成活性氧單元[11]。氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitrotretrazolium blue chloride,NBT)還原反應(yīng)常被用于清除O2-能力大小的檢測(cè),故NBT染色法可提示抗氧化作用。本研究旨在探討MAP對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠腸黏膜的作用效果,從粘附性和抗氧化抗炎角度探究其相關(guān)的作用機(jī)制,從而為臨床治療UC提供科學(xué)依據(jù)和治療新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

32只8周齡健康SPF級(jí)雄性SD大鼠,體重180～190 g,來(lái)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(浙)2020-0002】,質(zhì)量合格證號(hào):20200730Aazz06190009。動(dòng)物飼養(yǎng)于菲諾克生物科技(上海)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障環(huán)境【SYXK(滬)2018-0023】,單籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫度(22±3)℃,濕度40%～70%,燈光12 h明暗交替。所有大鼠標(biāo)準(zhǔn)鼠食飼養(yǎng),自由飲水。所有操作均符合菲諾克生物科技(上海)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào):phenotek-sh012)。

1.1.2 主要試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉(MP Biomedicals,SR01606);美沙拉秦栓(Dr.Falk Pharma GmbH,190329A);天然貽貝黏蛋白高聚物肛腸敷料(江陰貝瑞森制藥有限公司,20200707-5);空白凝膠基質(zhì)(江陰貝瑞森制藥有限司,20200707-1);硝酸纖維素轉(zhuǎn)印膜(Pall Corporation,T70720);固體氫氧化鉀(上海麥克林生化科技有限公司,C10285994);甘氨酸(Sigma-Aldrich,SLBR4281V);貽貝粘蛋白(江陰貝瑞森生化技術(shù)有限公司,20012001-R);氯化硝基四氮唑藍(lán)(上海前進(jìn)試劑廠,190327);10%福爾馬林中性固定液(南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司,190803)

5%DSS溶液:稱取葡聚糖硫酸鈉(純度:100%)80 g,加入1600 mL飲用水,攪拌至溶液澄清,常溫貯存,每日配置。美沙拉嗪:美沙拉秦栓45℃水浴溶化,現(xiàn)用現(xiàn)配;甘氨酸-鉀緩沖液(pH=10):稱取75 g甘氨酸溶解于400 mL水中,用固體氫氧化鉀(KOH)調(diào)節(jié)pH=10,加水定容至500 mL,配好后4℃保存;NBT染色液:稱取9 mg NBT加15 mL甘氨酸-鉀緩沖液溶解,混勻,臨用現(xiàn)配;貽貝粘蛋白溶液:稱取10 mg貽貝粘蛋白加10 mL生理鹽水溶解,現(xiàn)用現(xiàn)配。

LeicaASP200型全自動(dòng)脫水機(jī)(LEICA公司,德國(guó));Leica RM2245型半自動(dòng)切片機(jī)(LEICA公司,德國(guó));Leica ST4040型全自動(dòng)染色機(jī)(LEICA公司,德國(guó));Olympus BX53型光學(xué)顯微鏡(Olympus,日本);SC180型圖像分析系統(tǒng)(Olympus,日本);分析天平(常州奧豪斯儀器制造有限公司,中國(guó));HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州智博瑞儀器制造有限公司,中國(guó));烘箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司,中國(guó));D610型數(shù)碼相機(jī)(尼康映像儀器銷售有限公司,日本);培養(yǎng)皿;灌胃針;外科手術(shù)器械;1 mL注射器、2 mL注射器;比例尺;濾紙。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)體重將32只清潔級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組分別為正常組、模型組、美沙拉嗪組、貽貝粘蛋白組,每組8只。單籠飼養(yǎng),每只動(dòng)物在尾部標(biāo)記單獨(dú)的動(dòng)物號(hào),且每只籠具有籠具標(biāo)簽。

1.2.2 造模

模型組、美沙拉嗪組、貽貝粘蛋白組的動(dòng)物連續(xù)7 d自由飲用5%(w/v)DSS溶液,制備UC模型。正常組動(dòng)物同時(shí)予以普通飲用水作為對(duì)照。每日通過(guò)觀測(cè)各組大鼠DAI評(píng)分、體重,監(jiān)測(cè)模型進(jìn)展情況。

1.2.3 給藥

造模24 h大鼠經(jīng)直腸途徑局部治療給藥,模型組給予空白凝膠基質(zhì),美沙拉嗪組予美沙拉嗪,貽貝粘蛋白組給予天然貽貝黏蛋白高聚物肛腸敷料,正常組不做任何操作。給藥前所有動(dòng)物麻醉成功后,擠出直腸末端內(nèi)大便,取仰臥位,以1 mL注射器連接灌胃針吸藥物,每只大鼠給藥300μL,緩慢注入直腸腸腔,灌胃針插入深度約8 cm,給藥時(shí)左手捏緊肛門,給藥完畢采取頭低臀高位放回飼養(yǎng)籠,保持尾部朝上避免藥物流出,早晚各1次,連續(xù)7 d。

1.2.4 取材

于實(shí)驗(yàn)第8天各組動(dòng)物行CO2安樂(lè)處死后,沿大鼠肛周皮毛邊緣起0.5 cm環(huán)形分離肛門,剝離腸管至盲腸根部,測(cè)量自然伸展?fàn)顟B(tài)下盲腸根部到肛門的結(jié)直腸長(zhǎng)度,剝離多余的肌肉、脂肪、腸系膜等組織,縱剖全段結(jié)直腸,平鋪腸管進(jìn)行結(jié)直腸黏膜大體觀察評(píng)分并拍照記錄,生理鹽水沖洗干凈并用吸水紙拭干,分析天平稱重,結(jié)腸組織以肛門為中心卷成“瑞士卷”形狀,然后浸泡在10%福爾馬林中性固定液中,以供病理組織學(xué)觀察。

1.2.5 觀察指標(biāo)

(1)體重:實(shí)驗(yàn)期間每日同一時(shí)間稱量所有動(dòng)物體重并記錄。

(2)疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分:計(jì)算公式:DAI=(體重下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3,將每只動(dòng)物置于無(wú)墊料的干凈籠內(nèi)自由排便,待糞便數(shù)目≥5,按照表1中標(biāo)準(zhǔn)[12-13],根據(jù)所有糞便顆粒硬度和顏色,綜合評(píng)價(jià)大便性狀和便血情況。

表1 DAI評(píng)分表Table 1 DAI Scores

(3)結(jié)直腸長(zhǎng)度:測(cè)量各組大鼠取材后自然伸展?fàn)顟B(tài)下結(jié)直腸的長(zhǎng)度。

(4)結(jié)直腸黏膜大體形態(tài)(CMDI)評(píng)分:將所有標(biāo)本進(jìn)行縱剖,平鋪腸管,按表2標(biāo)準(zhǔn)[14-15]進(jìn)行CMDI評(píng)分并拍照記錄。

表2 CMDI評(píng)分表Table 2 CMDI scores

(5)結(jié)直腸重量與腸重比:所有標(biāo)本稱量濕重,計(jì)算腸重比:腸重比=腸重量/腸長(zhǎng)度

(6)病理組織學(xué)觀察:各組標(biāo)本固定后,逐級(jí)乙醇脫水、透明、浸臘、包埋、切片,常規(guī)HE染色,光鏡下觀察組織病理學(xué)改變并按表3標(biāo)準(zhǔn)[16]進(jìn)行評(píng)分記錄。

表3 病理組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Pathological histology scoring criteria

(7)體外實(shí)驗(yàn):NBT法檢測(cè)MAP粘附性及抗氧化作用

取長(zhǎng)度1 cm的大鼠直腸組織4段,縱剖鋪平,黏膜面朝上用大頭釘固定于濾紙片上,其中1段作為空白對(duì)照,其余3段分別浸泡于貽貝粘蛋白溶液(1 mg/mL)不同時(shí)間(10 s,1 min,10 min),取出后使用生理鹽水沖洗表面3次,置于生理鹽水濕盒,生理鹽水濕潤(rùn)濾紙,將濕盒蓋好后置于37℃烘箱中烘干15 h。取出后將濾紙更換成醋酸纖維素膜,將腸黏膜面朝下置于培養(yǎng)皿中,加入NBT染色液15 mL,使組織被NBT染色液均勻浸沒,避光染色15 min觀察各段組織染色情況并拍照記錄。同法,空白組織浸泡生理鹽水15 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0與GraphPad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),所有數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,符合正態(tài)分布采用單因素方差分析,非正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn),以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重與DAI評(píng)分

正常組大鼠體重呈平穩(wěn)上升趨勢(shì),模型組與正常組相比,于實(shí)驗(yàn)第5天出現(xiàn)體重明顯下降,差異具有顯著性(P＜0.05);與模型組相比,美沙拉嗪組和貽貝粘蛋白組自第5天起可見體重呈上升趨勢(shì),且差異具有顯著性(P＜0.05,圖1A)。

模型組第3天可見5只大鼠出現(xiàn)稀便;第4天所有動(dòng)物均有稀便且活動(dòng)減少;部分動(dòng)物肉眼血便于第5天出現(xiàn),個(gè)別反應(yīng)遲鈍;第6天部分大鼠出現(xiàn)皮毛不潔,體重下降;第7天模型組所有動(dòng)物出現(xiàn)肉眼血便,個(gè)別出現(xiàn)精神萎靡、體重明顯下降,模型組與正常組DAI評(píng)分差異具有顯著性(P＜0.05);與模型組相比,美沙拉嗪組和貽貝粘蛋白組各項(xiàng)體征均減輕,DAI評(píng)分明顯下降,差異具有顯著性(P＜0.05);正常組大鼠無(wú)明顯變化(圖1B)。

圖1 體重與DAI評(píng)分Note.A.Comparison of body weight.B.Comparison of DAI scores.Compared with the model group,*P＜0.05.(The same in the following figure)Figure 1 Body weight and DAI scores

2.2 結(jié)直腸解剖數(shù)據(jù)與黏膜大體形態(tài)觀察

與正常組相比,模型組結(jié)直腸長(zhǎng)度縮短、腸重比增加,差異具有顯著性(P＜0.05);與模型組相比較,美沙拉嗪組和貽貝粘蛋白組結(jié)直腸長(zhǎng)度增加、腸重比降低,差異具有顯著性(P＜0.05,見圖2A,2B)。

模型組結(jié)直腸黏膜形態(tài)觀察見腸黏膜高度水腫、充血,部分黏膜粗糙、糜爛,可見多個(gè)大小不等潰瘍形成,腸壁增厚(圖2D),CMDI評(píng)分高于正常組(P＜0.05,圖2C);與模型組相比,美沙拉嗪組和貽貝粘蛋白組可見結(jié)直腸黏膜水腫、充血減輕,偶見黏膜粗糙(圖2D),CMDI評(píng)分均低于模型組,差異具有顯著性(P＜0.05,圖2C)。

圖2 結(jié)直腸解剖數(shù)據(jù)與黏膜大體形態(tài)觀察Note.A.Comparison of length of colorectum.B.Comparison of intestinal weight ratio.C.Comparison of CMDI scores.D.Observation of gross morphology of colorectal mucosa.Figure 2 Colorectal anatomical datas and observation of gross morphology of colorectal mucosa

2.3 病理組織學(xué)觀察

正常組大鼠結(jié)直腸黏膜上皮完整,隱窩結(jié)構(gòu)清晰,腺體排列規(guī)則,未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),病理組織學(xué)評(píng)分為(0.13±0.35)分;模型組大鼠可見結(jié)直腸黏膜腺體結(jié)構(gòu)被破壞,結(jié)腸隱窩腫脹變形,黏膜下組織大量炎細(xì)胞浸潤(rùn),病理組織學(xué)評(píng)分為(3.38±0.74)分高于正常組,差異具有顯著性(P＜0.05);美沙拉嗪組、貽貝粘蛋白組可見與模型組相似的病理變化,但病變程度較模型組減輕,病理組織學(xué)評(píng)分為美沙拉嗪組(2.38±0.74)分、貽貝粘蛋白組(2.13±0.64)分,均低于模型組(P＜0.05),且貽貝粘蛋白組可見黏膜上皮輕微至輕度再生(見圖3)。

2.4 體外實(shí)驗(yàn):NBT法檢測(cè)MAP粘附性及抗氧化作用結(jié)果

實(shí)驗(yàn)可見空白對(duì)照組織無(wú)染色;與空白對(duì)照組織相比,浸泡10 s組織出現(xiàn)染藍(lán);與浸泡10 s組織相比,浸泡1 min組織可見染藍(lán)加深;浸泡10 min組織可見較浸泡1 min組織更加明顯的深藍(lán)色(見圖4)。

圖4 MAP對(duì)直腸黏膜粘附及抗氧化作用觀察Figure 4 Observations on the adhesion and antioxidant effects of MAP on rectal mucosa

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)UC的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),且多發(fā)于青壯年,并存在一定癌變的危險(xiǎn)性[17-18]。在UC的發(fā)病過(guò)程中,氧化應(yīng)激可導(dǎo)致腸道黏膜生物屏障被損壞,造成機(jī)體炎癥性損傷[1,19]。MAP良好的粘附性可利于腸黏膜黏液層的重建、修護(hù)黏膜屏障,還能減少持續(xù)的炎性刺激黏膜上皮細(xì)胞、使屏障功能得以恢復(fù)[6,20-22],故在本研究中與模型組相比,貽貝粘蛋白組大鼠可見體重明顯增加、稀便和便血癥狀明顯改善,腸黏膜水腫及充血明顯減輕。

生物體系中具有抗氧化能力的物質(zhì)能有效抵御氧化應(yīng)激的有害損傷,從而發(fā)揮抗炎作用[23]。在前期評(píng)價(jià)MAP抗氧化及清除自由基能力的研究顯示[24],MAP對(duì)于DPPH·自由基的清除范圍為4.59%～91.06%;MAP對(duì)ABTS·+的清除率為13.26%～93.77%;FRAP法中隨著MAP濃度的變化其還原能力值范圍為0.153FRAP值到1.825FRAP值。貽貝足絲蛋白中DOPA基團(tuán)在堿性和過(guò)量甘氨酸作為還原劑的條件下,與NBT可氧化還原生成不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜,于本研究體外實(shí)驗(yàn)中可見腸黏膜染色為不同程度藍(lán)紫色,表明MAP粘附于大鼠腸黏膜可發(fā)生氧化還原反應(yīng),且呈現(xiàn)一定的時(shí)間相關(guān)性,由此可見,MAP能夠有效清除超氧陰離子、抑制過(guò)氧化,具有良好的抗炎作用,故本研究病理組織學(xué)觀察中可見貽貝粘蛋白組大鼠炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度較模型組明顯減輕,與前期研究所得MAP具有良好抗氧化活性能力的結(jié)論相符。

美沙拉嗪屬氨基水楊酸類藥物,作為一種非甾體類抗炎藥,可通過(guò)抑制前列腺素的合成以及炎癥介質(zhì)白三烯的形成,產(chǎn)生抑制腸黏膜炎性反應(yīng)的作用[25]。與美沙拉嗪組相比,貽貝粘蛋白組大鼠可見與其相似的體重增長(zhǎng)趨勢(shì)和DAI評(píng)分,且腸黏膜水腫、充血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度均十分相近,可見MAP具有與美沙拉嗪對(duì)UC所相近的治療作用。MAP良好的粘附性使其在直腸可維持藥物的治療濃度,且直腸黏膜為相當(dāng)穩(wěn)定的物理化學(xué)和酶環(huán)境,可避免部分肝首過(guò)效應(yīng),以直腸給藥方式還可避免口服治療的不良反應(yīng)[26]。MAP具有粘附范圍廣、對(duì)粘附面的要求低等特點(diǎn),臨床中對(duì)促進(jìn)慢性潰瘍愈合及促進(jìn)細(xì)胞的粘附等均具有良好效果[27-29],已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

本研究通過(guò)建立UC大鼠模型,觀察MAP對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠癥狀的改善作用,并取得了確切療效,其作用機(jī)制為MAP具有良好粘附性和抗氧化能力,在直腸局部可維持藥物的治療濃度,不僅能修護(hù)腸黏膜屏障功能,還可以清除自由基減輕炎癥,從而減輕腸黏膜屏障損傷,發(fā)揮修復(fù)腸黏膜的作用,為臨床開發(fā)局部治療的直腸給藥制劑治療UC提供新思路。