自身免疫型卵巢早衰模型的研究

王海丹郭紅玉馬蔚蓉王瓊嚴(yán)士海符蕊

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院江蘇省中醫(yī)院,南京 210029)

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是一種常見的婦科疾病,其特征是40歲以前出現(xiàn)卵巢功能衰退,伴隨著閉經(jīng)、血清高促性腺激素和低雌激素的癥狀[1]。它是早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)的終末階段[2],對育齡婦女來說從身體和精神上都是傷害,不僅有圍絕經(jīng)期帶來的痛苦,還會導(dǎo)致生育力下降或喪失,認(rèn)知力下降,缺血性心臟病、骨質(zhì)疏松、自身免疫性等疾病[3-4],身體和精神上的改變嚴(yán)重影響婦女及其家人的身心健康和生活質(zhì)量。卵巢功能不全的原因很多,比如:自身免疫因素、遺傳基因、環(huán)境和生活方式、心理壓力、藥物化學(xué)因素等[5-6]。自身免疫異常是比較重要的因素之一,約5%～30%的POF病例有自身免疫病因[7-8]。40多年前,卵巢組織就被證實(shí)是免疫系統(tǒng)的一個靶向器官[9]。但目前免疫性卵巢早衰的發(fā)病機(jī)制、有效的檢測及治療方法還在進(jìn)一步探索之中。本文通過比較采用不同的造模時間和不同佐劑觀察小鼠透明帶多肽抗原誘導(dǎo)的免疫性卵巢早衰模型建立的相關(guān)因素,為高效高質(zhì)量地建立免疫性卵巢早衰模型提供了一定的參考,為研究藥物對免疫性卵巢早衰的作用機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

24只8周齡SPF級健康雄性A/J小鼠,體重18～22 g,購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司【SCXK(蘇)2019-0009】。24只8周齡SPF級健康雌性C57BL/6小鼠,體重18～22 g,購于斯貝福生物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2019-0010】。將A/J雄鼠和C57BL/6雌鼠進(jìn)行交配,繁育出B6AF1小鼠,7周齡時將所繁育的雌性小鼠查1周動情周期變化,篩選出具有正常動情周期的B6AF1小鼠50只,體重18～22 g。飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心【SYXK(蘇)2017-0069】。實(shí)驗(yàn)小鼠在SPF級環(huán)境分籠飼養(yǎng),溫度為(20±2)℃,相對濕度維持在45%～65%,照明12 h更替,自由飲水飲食。所有操作均符合南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理要求(審批號:2019DW-09-02)。

1.1.2 主要試劑與儀器

小鼠透明帶多肽粉末:小鼠透明帶3(ZP3)的第330～342個氨基酸序列(NSSSSQFQIHGPR),分析純度96.91%(由上海吉爾生化有限公司生產(chǎn),Catalog:271036);弗氏完全佐劑a(每毫升含有1 mg結(jié)核分枝桿菌TB)(sigma公司,Lot#SLBT1714);弗氏不完全佐劑a(sigma公司,批號:SLBT0114);弗氏完全佐劑b(每毫升含有5 mg結(jié)核分枝桿菌TB)(美國Chondrex公司,LOT:200010);弗氏不完全佐劑b(美國Chondrex公司,LOT:200079);E2試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所,批號:20201015);FSH試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所,批號:20201016);Tunel試劑盒(Servicebio公司,批號:G1501);Donkel試劑盒(Servicebio公司,批號:SA00013-5);DAPI(Servicebio公司,批號:G1012);全自動放免計數(shù)儀(西安 核儀器廠);NIKON ECLIPSE C1正置熒光顯微鏡(日本Nikon公司);Nikon DS-U3成像系統(tǒng)(日本Nikon公司);離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型建立

將動情周期正常的B6AF1小鼠隨機(jī)分為5組:正常組、模型A組、模型B組、模型C組、模型D組。將濃度為1 mmol/L的ZP3溶液與弗氏完全佐劑a和弗氏不完全佐劑a分別按1∶1體積比例配制成免疫試劑a和免疫強(qiáng)化試劑a,與弗氏完全佐劑b和弗氏不完全佐劑b分別按1∶1體積比例配制成免疫試劑b和免疫強(qiáng)化試劑b。造模均為尾根部皮下多點(diǎn)注射。正常組小鼠每次免疫時每只給予0.15 mL生理鹽水。模型A組和模型B組分別單次注射0.15 mL免疫試劑a和免疫試劑b,2周后取材。模型C組和模型D組小鼠首次免疫時每只分別給予0.15 mL免疫試劑a和免疫試劑b,14 d后每只鼠分別給予0.15 mL免疫強(qiáng)化試劑a和免疫強(qiáng)化試劑b進(jìn)行第2次免疫,28 d后進(jìn)行第3次免疫,操作同第2次。第3次免疫后1周取材[10]。

1.2.2 取材及檢測

每天定時用預(yù)吸有生理鹽水的吸管輕輕插入小鼠陰道,取分泌物細(xì)胞,將有陰道分泌物細(xì)胞的液體滴入細(xì)胞板,在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),記錄小鼠動情周期變化[11]。實(shí)驗(yàn)?zāi)└鹘M小鼠取血清,按試劑盒說明采用全自動放免計數(shù)儀檢測小鼠血清E2、FSH水平。取單側(cè)卵巢組織,HE染色觀察卵巢各級卵泡、閉鎖卵泡、黃體的變化。熒光tunel法檢測卵巢細(xì)胞凋亡情況,按照以下步驟進(jìn)行:石蠟切片脫蠟至水、蛋白酶K修復(fù)、破膜、室溫平衡、加反應(yīng)液TDT酶,dUTP、DAPI復(fù)染細(xì)胞核、封片、鏡檢拍照。熒光顯微鏡下觀察DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色,試劑盒為FITC熒光素標(biāo)記,陽性凋亡細(xì)胞核為綠色。免疫熒光法檢測卵巢透明帶的變化,按照以下步驟進(jìn)行:石蠟切片脫蠟至水、抗原修復(fù)、畫圈血清封閉、加一抗Donkel、DAPI復(fù)染細(xì)胞核、淬滅組織自發(fā)熒光、封片、鏡檢拍照。熒光顯微鏡下觀察DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色,陽性表達(dá)為Donkel熒光素標(biāo)記的綠光。

1.2.3 造模成功判定指標(biāo)和鑒定方法

從動情周期變化、性激素水平、卵巢組織病理變化、卵巢顆粒細(xì)胞凋亡以及透明帶變化來判定造模成功與否。如果同時出現(xiàn)動情周期紊亂;低雌激素高促卵泡刺激素水平;卵巢病理呈現(xiàn)初級、次級、成熟卵泡率變少,閉鎖卵泡率上升;卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率上升;透明帶呈現(xiàn)亮色熒光圈;并且以上各項(xiàng)指標(biāo)與正常組比較差異具有顯著性的組別就判定為造模成功。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有統(tǒng)計計算均用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)皆以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。凋亡率統(tǒng)計采用Image J軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠動情周期變化

正常組和模型A組小鼠以動情前期、動情期、動情后期、動情間期的規(guī)律呈現(xiàn)5～6 d的1個循環(huán)。模型B組小鼠造模1周后呈現(xiàn)動情周期紊亂,但是各期還是呈現(xiàn)5～6 d的規(guī)律,只是動情后期和動情間期延長。模型C組和模型D組均在第3次免疫后呈現(xiàn)出明顯的動情周期紊亂,80%的小鼠一直處于動情后期和動情間期,模型C組和模型D組比較差異無顯著性(P＞0.05)(見圖1)。

圖1 小鼠動情周期細(xì)胞變化Note.a.Pre-estrus.Most of them are nucleated epithelial cells,but there are a few keratinized epithelial cells,no white blood cells.b.Estrous phase.All keratinocytes or a few epithelial cells occasionally.c.Late estrus.Nucleated epithelial cells,white blood cells and keratinocytes.d.Interestrous phase.Mostly white blood cells and a few epithelial cells and mucus.Figure 1 Changes of estrous cycle cells in mice

2.2 血清E2、FSH水平變化

與正常組相比,模型B組小鼠E2水平明顯降低,FSH水平明顯增加,與正常組比,差異具有顯著性(P＜0.05)。模型C組和模型D組小鼠E2水平顯著降低,FSH水平顯著增加,與正常組比,差異具有顯著性(P＜0.01)。模型A組小鼠血清E2、FSH水平與正常組比較差異無顯著性(P＞0.05),模型C組和模型D組小鼠血清差異無顯著性(P＞0.05)(見表1)。

表1 ZP3致卵巢早衰小鼠血清E2、FSH水平變化(±s,n=8)Table 1 Changes of serum E2 and FSH levels in mice with premature ovarian failure induced by ZP3(±s,n=8)

表1 ZP3致卵巢早衰小鼠血清E2、FSH水平變化(±s,n=8)Table 1 Changes of serum E2 and FSH levels in mice with premature ovarian failure induced by ZP3(±s,n=8)

注:與正常組比,*P＜0.05,**P＜0.01。(下表同)Note.Compared with normal group,*P＜0.05,**P＜0.01.(The same in the following tables)

組別Groups造模方式Modeling method E2(pg/mL) FSH(mIU/mL)正常組Normal group等量生理鹽水NS 33.31±5.21 8.80±1.48模型A組Model A group 1次免疫+1 mg/mL TB Primary immunization+1 mg/mL TB 31.45±10.95 10.27±2.10模型B組Model B group 1次免疫+5 mg/mL TB Primary immunization+5 mg/mL TB 27.63±4.17* 13.29±4.51*模型C組Model C group 3次免疫+1 mg/mL TB Tertiary immunization+1 mg/mL TB 23.88±3.68** 15.31±4.28**模型D組Model D group 3次免疫+5 mg/mL TB Tertiary immunization+5 mg/mL TB 23.43±5.36** 12.68±2.13**

2.3 小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)的變化

正常組卵巢皮質(zhì)區(qū)各級卵泡、黃體相間分布,比例正常。模型A組和B組初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡的比例有所下降,閉鎖卵泡有上升趨勢,但與正常組比較,初次級卵泡率、成熟卵泡率、閉鎖卵泡率差異無顯著性(P＞0.05)。模型C組和D組卵巢皮質(zhì)多見黃體和閉鎖卵泡,少見初級和次級卵泡,成熟卵泡基本未見或個別偶見,與正常組比較,模型C組和D組初次級卵泡率、成熟卵泡率、閉鎖卵泡率差異有顯著性(P＜0.01,P＜0.05),模型C組和D組之間比較差異無顯著性(P＞0.05)(見圖2,表2)。

表2 ZP3致卵巢早衰小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化(±s,n=8)Table 2 Morphological changes of ovarian tissue in mice with premature ovarian failure induced by ZP3(±s,n=8)

表2 ZP3致卵巢早衰小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化(±s,n=8)Table 2 Morphological changes of ovarian tissue in mice with premature ovarian failure induced by ZP3(±s,n=8)

組別Groups造模方式Modeling method初次級卵泡率(%)Primary and secondary follicles rate(%)成熟卵泡率(%)Mature follicles rate(%)閉鎖卵泡率(%)Occluded follicles rate(%)正常組Normal group等量生理鹽水NS 56.24±20.91 5.17±2.95 38.59±18.94模型A組Model A group 1次免疫+1 mg/mL TB Primary immunization+1 mg/mL TB 40.10±19.26 3.48±6.48 56.42±21.99模型B組Model B group 1次免疫+5 mg/mL TB Primary immunization+5 mg/mL TB 36.36±14.28 4.53±4.52 59.11±16.64模型C組Model C group 3次免疫+1 mg/mL TB Tertiary immunization+1 mg/mL TB 28.42±16.10* 1.39±2.50* 70.20±15.25**模型D組Model D group 3次免疫+5 mg/mL TB Tertiary immunization+5 mg/mL TB 32.20±10.11* 1.39±2.38* 66.40±10.58**

圖2 小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)的變化Note.Complete histological structure of ovary.Local histological structure of ovary.Figure 2 Morphological changes of ovarian tissue in mice

2.4 小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的變化

正常組、模型A、B、C、D組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率分 別 為 8.15%、10.21%、11.18%、35.49%、36.89%。模型組C組、D組顆粒細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組,差異具有顯著性(P＜0.05)。模型A組、B組顆粒細(xì)胞凋亡率有升高趨勢,但是與正常組比較,差異無顯著性(P＞0.05)(見圖3,表3)。

圖3 小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的變化Note.Apoptosis of ovarian granulosa cells was detected by fluorescence TUNEL.Under UV excitation,the DAPI-stained nuclei were blue,while the apoptotic nuclei were green.Figure 3 Changes in apoptosis of mouse ovarian granulosa cells

表3 ZP3致卵巢早衰小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的變化(±s,n=3)Table 3 Changes of apoptosis of ovarian granulosa cells in mice with premature ovarian failure induced by ZP3(±s,n=3)

表3 ZP3致卵巢早衰小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的變化(±s,n=3)Table 3 Changes of apoptosis of ovarian granulosa cells in mice with premature ovarian failure induced by ZP3(±s,n=3)

注:與正常組比,**P＜0.01。Note.Compared with normal group,**P＜0.01.

組別Groups 造模方式Modeling method 凋亡率(%)Apoptosis rate(%)正常組Normal group 等量生理鹽水NS 8.15±0.99模型A組Model A group 1次免疫+1mg/mL TB Primary immunization+1mg/mL TB 10.21±1.08模型B組Model B group 1次免疫+5mg/mL TB Primary immunization+5mg/mL TB 11.18±2.15模型C組Model C group 3次免疫+1mg/mL TB Tertiary immunization+1mg/mL TB 35.49±1.93**模型D組Model D group 3次免疫+5mg/mL TB Tertiary immunization+5mg/mL TB 36.89±2.71**

2.5 小鼠卵巢透明帶的變化

正常組卵巢未見透明帶呈現(xiàn)很亮的綠光圈,模型各組卵巢可見明顯的透明帶綠色熒光,其中模型C組、D組透明帶熒光更明顯,顏色更亮(見圖4)。

圖4 小鼠卵巢組織透明帶的變化Note.The zona pellucida of mice ovary was detected by immunofluorescence assay.The DAPI-stained nuclei were blue under UV excitation and the positive expression was green light labeled with Donkel luciferin.Figure 4 Changes of zona pellucida in mouse ovarian tissue

3 討論

隨著POF臨床發(fā)病率的上升,尋求有效的POF治療方案,尤其是針對其發(fā)病機(jī)制的靶向治療,最終改善其卵巢功能,已成為亟待解決的難題[12-13]。而對于POF基礎(chǔ)研究來說,建立一個有效的POF動物模型尤為重要。POF動物模型根據(jù)不同的因素有幾種不同的造模方式[14-15],比如直接基因敲除,但是這類動物成本和飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)較高。胸腺切除也可導(dǎo)致卵巢早衰,但是手術(shù)復(fù)雜,在上個世紀(jì)有報道,但是近年來不常采用[16]。半乳糖造模周期很長[17],雷公藤和環(huán)磷酰胺等其他化療藥物造模雖耗時較短[18],造模藥物易獲,費(fèi)用低但同時會帶來早衰外的不良反應(yīng)。

透明帶蛋白ZP3被稱作是初級精子受體,它是哺乳動物環(huán)繞在卵母細(xì)胞的外衣,能夠影響卵泡各個發(fā)育階段的透明帶的合成,與卵母細(xì)胞成熟有直線相關(guān)的關(guān)系。用ZP3蛋白建立的POF動物模型與人類卵巢早衰具有相似的生殖內(nèi)分泌和組織學(xué)變化,因此已成為近年來POF造模最重要及可靠的方法[19-20]。通過給予透明帶多肽抗原,使動物體內(nèi)產(chǎn)生抗透明帶的抗體,從而建立免疫性卵巢早衰的模型。在建立的過程中,為了加強(qiáng)抗原的免疫效果會用弗氏完全佐劑進(jìn)行免疫,采用ZP3多肽抗原作為造模劑是學(xué)者的共識,但在弗氏完全佐劑(結(jié)核分枝桿菌濃度不同)的選擇和免疫干預(yù)時間上還不明確,所以本研究組針對不同的造模時間和不同佐劑進(jìn)行了深入研究。研究發(fā)現(xiàn)單次以低濃度結(jié)核分枝桿菌的弗氏完全佐劑免疫動物,從血清性激素水平,卵巢病理改變、顆粒細(xì)胞的凋亡和透明帶抗體變化這幾個方面分析,檢測結(jié)果不符合POF模型動物的特點(diǎn)。單次免疫高濃度弗氏完全佐劑后動物血清呈現(xiàn)低雌激素和高促性腺激素的變化,透明帶抗體熒光也有出現(xiàn),但是在卵巢組織病理學(xué)和顆粒細(xì)胞凋亡方面與正常組相比變化不明顯。高濃度的佐劑雖然增強(qiáng)了免疫的反應(yīng),但是免疫細(xì)胞并未繼續(xù)浸潤和破壞顆粒細(xì)胞,使顆粒細(xì)胞層并未繼續(xù)逐漸減少,所以未見組織病理學(xué)和顆粒細(xì)胞的改變。因此表明單次免疫不能完全達(dá)到POF動物模型的要求。由結(jié)果可見,在第1次ZP3免疫后繼續(xù)加強(qiáng)免疫2次后,小鼠出現(xiàn)動情周期紊亂、高促性腺激素低雌激素、閉鎖卵泡增多、透明帶熒光顯著、卵巢凋亡細(xì)胞增多的現(xiàn)象,這些結(jié)果完全符合POF模型動物的特征。在同樣3次免疫的情況下,弗氏完全佐劑里結(jié)核分枝桿菌濃度的高低未見顯著性的差異。

綜上所述,ZP3誘導(dǎo)可以成功建立免疫型卵巢早衰模型,其中以3次免疫的成模效果更佳,為今后的研究者構(gòu)建卵巢早衰模型提供一定的基礎(chǔ)。