美洛昔康納米骨架膠囊的溶出與體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究

張 丹,王小旭,謝賀賀，吳翠栓

(北京德立福瑞醫(yī)藥科技有限公司,北京 102101)

美洛昔康是一種新型非甾體抗炎藥(NSAIDs)，用于治療骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[1-2]，與其他NSAIDs相比，引起的胃腸道不良反應(yīng)更輕[3-4]。但由于美洛昔康的水溶性較差，導(dǎo)致口服生物利用度較低。

口服納米骨架技術(shù)[5-7]是采用具有納米孔徑的介孔二氧化硅和pH敏感高分子材料為載體，制備難溶性藥物納米骨架分散系統(tǒng)。本研究采用納米骨架技術(shù)制備美洛昔康納米骨架膠囊，并與市售美洛昔康片(莫比可?)進(jìn)行對(duì)比，對(duì)自制的美洛昔康納米骨架膠囊進(jìn)行體外溶出特征和比格犬體內(nèi)口服藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。

1 儀器與材料

1.1儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司);RC806D型溶出儀(天大天發(fā)科技有限公司);T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計(jì)(普析通用儀器有限責(zé)任公司);AL204型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);BT 25S型電子天平(德國賽多利斯公司);HC-2064型離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);MTN-2800W型氮吹濃縮裝置(天津奧特賽思儀器有限公司)。

1.2試藥 美洛昔康對(duì)照品(批號(hào)100679-201102)和吡羅昔康對(duì)照品(批號(hào)100177-200603)，均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純，Sigma公司，批號(hào)WXBB6447V)；美洛昔康片(商品名莫比可?，勃林格殷格翰公司，批號(hào)384242)；美洛昔康納米骨架膠囊(北京德立福瑞醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)MJ201502282)；水為自制超純水，其余試劑均為分析純。

1.3動(dòng)物 健康比格犬，10月齡左右，雄性，體質(zhì)量為8～10 kg，購自北京瑪斯生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)-2011-0003。

2 方法與結(jié)果

2.1溶出曲線對(duì)比研究

2.1.1溶出曲線測(cè)定 取美洛昔康納米骨架膠囊，參照《中國藥典》2015年版通則0931第二法溶出度與釋放度測(cè)定法，溶出介質(zhì)體積為900 mL，轉(zhuǎn)速為75 r·min-1，依法操作。經(jīng)5、10、30、45、60 min時(shí)，取溶液10 mL，過0.45 μm 濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液；另取美洛昔康對(duì)照品約20 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加 0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液10 mL，超聲使溶解，再用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置于50 mL量瓶中，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液；取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液，參照《中國藥典》2015年版通則0401紫外-可見分光光度法，在362 nm波長處分別測(cè)定吸光度值A(chǔ)，按外標(biāo)法計(jì)算每片溶出量。

2.1.2溶出曲線測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證 專屬性:稱取輔料適量，分別加入不同pH值的溶出介質(zhì)，過濾，在362 nm波長處測(cè)定吸光度值A(chǔ)。結(jié)果顯示，空白輔料溶液在該波長處均無吸收，未對(duì)主成分造成干擾，表明該方法專屬性良好。

線性范圍：精密稱取美洛昔康對(duì)照品適量，加入0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液使溶解，再加介質(zhì)稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg·L-1的系列溶液，以該溶出介質(zhì)為空白，分別在波長362 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)，以吸光度(A)對(duì)美洛昔康質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A1=0.050 4C1+0.002 2，R12=0.999 8(pH=1.0);A2=0.052 5C2+0.003 6，R22=0.999 3(pH=4.5)；A3=0.050 9C3+0.003，R32=0.999 8(水)；A4=0.053 6C4+0.000 6，R42=0.999 6(pH=7.4)。結(jié)果表明，美洛昔康質(zhì)量濃度(C)在0.25～8.00 mg·L-1范圍內(nèi)與吸光度(A)線性關(guān)系良好。

2.1.3溶出曲線對(duì)比 按照上述溶出曲線測(cè)定方法，分別測(cè)定2種制劑在不同pH介質(zhì)中的溶出曲線。結(jié)果表明，對(duì)照品制劑莫比可?在pH值為1.0的鹽酸介質(zhì)中，60 min時(shí)溶出度低于20%，在pH值為4.5的醋酸鹽介質(zhì)中，60 min溶出度低于40%，在水和pH值為7.4的磷酸鹽介質(zhì)中，30 min溶出度約為80%，呈現(xiàn)明顯的pH值依賴性；而美洛昔康納米骨架膠囊在4種介質(zhì)中溶出均快于莫比可?，且在酸性介質(zhì)中溶出度明顯提高。溶出曲線見圖1。

2.2比格犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)對(duì)比研究

2.2.1給藥方案與血漿樣品采集 本研究為單劑量給藥實(shí)驗(yàn)，采用兩周期雙交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，周期間隔為7 d。將12只比格犬隨機(jī)分為2組，禁食12 h后分別口服美洛昔康納米骨架膠囊與莫比可?。分別于給藥前(0 h)和給藥后 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、12.0、36.0、72.0 h由前腿小隱靜脈采血2 mL。血樣取出后立即置于肝素化的EP管中，以4 000 r·min-1離心10 min，分離血漿，于-20 ℃冰箱冷凍保存， 待測(cè)。

2.2.2血漿樣品處理方法 精密吸取血漿0.5 mL，置于5 mL具塞離心管中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，1.0 mol·L-1的鹽酸溶液100 μL，乙醚4.0 mL(分2次，每次2 mL)，渦旋混勻2 min，以4 000 r·min-1離心10 min，合并2次有機(jī)相，于50 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?。殘留物?00 μL流動(dòng)相渦旋1 min溶解，高速離心后，取上清液供HPLC分析。

2.2.3色譜條件 色譜柱：MERCK Hibar?RP-18e(150 mm×4.6 mm 5.0 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.2 mol·L-1醋酸銨=52∶48；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長：355 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。

2.2.4方法學(xué)驗(yàn)證 專屬性:按照2.2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)得空白血漿、空白血漿加美洛昔康對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)(吡羅昔康)及比格犬服藥后血漿樣品的典型色譜圖，美洛昔康的保留時(shí)間約為14.249 min，內(nèi)標(biāo)吡羅昔康的保留時(shí)間約為7.743 min；空白血漿的內(nèi)源性物質(zhì)未干擾色譜分析。

線性范圍：精密稱取美洛昔康對(duì)照品10.0 mg，置于200 mL量瓶中，加入0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液10 mL使其溶解，用水稀釋至刻度，得到50 μg·mL-1的美洛昔康溶液，作為儲(chǔ)備液；在空白血漿中加入不同質(zhì)量濃度的美洛昔康對(duì)照品溶液，使其血漿藥物質(zhì)量濃度分別為0.025、0.050、0.100、0.500、1.000、5.000 μg·mL-1，按照2.2項(xiàng)下血漿處理方法處理，進(jìn)行HPLC分析。以峰面積比(R)對(duì)質(zhì)量濃度(C,μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：C=R×2.121 1-0.015 6，r=0.999 9。結(jié)果表明，美洛昔康血漿質(zhì)量濃度在0.025～5.000 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

定量下限：分別精密吸取美洛昔康對(duì)照品溶液適量，置于5 mL具塞離心管中，氮?dú)獯蹈?，加入空白血漿0.5 mL，配制成美洛昔康質(zhì)量濃度為0.025 μg·mL-1的血漿樣本5份，按照2.2項(xiàng)下方法處理，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，結(jié)果5份樣品平均準(zhǔn)確度為105.26%，RSD值為9.98%。表明質(zhì)量濃度在最低定量限附近的血漿樣本測(cè)定準(zhǔn)確度、精密度良好。

精密度與準(zhǔn)確度：另精密稱取美洛昔康對(duì)照品10.0 mg，置于200 mL量瓶中，加0.1 μg·mL-1的氫氧化鈉溶液10 mL使其溶解，用水稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1的美洛昔康溶液，作為儲(chǔ)備液；在空白血漿中加入不同質(zhì)量濃度的美洛昔康對(duì)照品溶液，制成血漿藥物質(zhì)量濃度分別為0.025、0.050、0.500、5.000 μg·mL-1的血漿樣品。按照2.2項(xiàng)下方法處理，進(jìn)行HPLC分析。在1個(gè)分析批內(nèi)測(cè)定多次，計(jì)算批內(nèi)精密度；在不同時(shí)間連續(xù)制備并測(cè)定3個(gè)分析批，計(jì)算批間精密度。見表1。

表1 美洛昔康血漿樣品精密度測(cè)定

提取回收率：美洛昔康回收率實(shí)驗(yàn)：取美洛昔康對(duì)照品溶液，加入空白血漿中，配制成質(zhì)量濃度為0.025、0.050、0.500、4.000 μg·mL-1的血漿樣品，各5份，置于5 mL具塞離心管中，加入1.0 mol·L-1的鹽酸溶液100 μL及乙醚4.0 mL(分2次，每次2 mL)，渦旋混勻2 min，以4 000 r·min-1離心10 min，合并2次有機(jī)相，于上清液中精密加入內(nèi)標(biāo)(吡羅昔康)溶液50 μL，渦旋混勻后于50 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?。殘留物?00 μL流動(dòng)相渦旋1 min溶解，高速離心后，取上清液供HPLC分析。計(jì)算美洛昔康與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比(As-r)。另取空白血漿6份，加入1.0 mol·L-1的鹽酸溶液100 μL，乙醚4.0 mL(分2次，每次2 mL)，渦旋混勻2 min，以4 000 r·min-1離心10 min，合并2次有機(jī)相，加入與前一步驟等量的美洛昔康對(duì)照品溶液適量，配成系列質(zhì)量濃度水平對(duì)照品溶液，各2份，再分別精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，渦旋混勻后于50 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?。殘留物?00 μL流動(dòng)相渦旋1 min溶解，高速離心后，取上清液供HPLC分析，計(jì)算美洛昔康與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比(Ar-r)。按照公式回收率=(As-r)÷(Ar-r)×100%計(jì)算美洛昔康血漿樣品的回收率，結(jié)果表明,4種質(zhì)量濃度的平均回收率均大于80%，且穩(wěn)定。見表2。

表2 美洛昔康血漿樣品回收率 (n=5)

內(nèi)標(biāo)吡羅昔康回收率實(shí)驗(yàn)：取空白血漿0.5 mL，共5份，置于5 mL具塞離心管中，按照2.2.2項(xiàng)下血漿樣品處理方法自“精密加入內(nèi)標(biāo)(吡羅昔康)溶液50 μL”起同法操作，并進(jìn)行色譜分析，記錄內(nèi)標(biāo)色譜峰面積(As-is)。另取空白血漿2份，加入1.0 mol·L-1的鹽酸溶液100 μL，乙醚4.0 mL(分2次，每次2 mL)，渦旋混勻2 min，以4 000r·min-1離心10 min，合并2次有機(jī)相，于上清液中精密加入內(nèi)標(biāo)(吡羅昔康)溶液50 μL，渦旋混勻后于50 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?。殘留物?00 μL流動(dòng)相渦旋1 min使溶解，高速離心后，取上清液供HPLC分析。記錄內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積(Ar-is)。按照公式回收率=(As-is)÷(Ar-is)×100%計(jì)算內(nèi)標(biāo)血漿樣品的回收率。結(jié)果表明，在內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為5.0 μg·mL-1時(shí)，5份樣品中內(nèi)標(biāo)的回收率分別為90.24%、87.16%、91.38%、92.44%、89.09%，平均回收率為90.06%，RSD值為2.27%，內(nèi)標(biāo)在該質(zhì)量濃度水平的平均回收率大于80%且穩(wěn)定。

穩(wěn)定性：按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法配制0.05、0.50、5.00 μg·mL-13種不同質(zhì)量濃度的血漿樣品，分別考察未處理血漿樣品室溫放置8 h、凍融循環(huán)3次、-20 ℃冰凍15 d、處理后血漿樣品自動(dòng)進(jìn)樣器放置48 h的穩(wěn)定性。經(jīng)測(cè)定，3種質(zhì)量濃度樣品在不同條件放置后，所測(cè)得的質(zhì)量濃度與標(biāo)示質(zhì)量濃度偏差均在±15%范圍內(nèi)，結(jié)果表明，穩(wěn)定性符合要求。綜上，高效液相色譜-紫外(HPLC-UV)方法的驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法的專屬性、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、定量限、提取回收率和穩(wěn)定性等均符合要求，可用于美洛昔康血藥質(zhì)量濃度的測(cè)定。

2.2.5比格犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較 比格犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后進(jìn)行方差分析，采用雙向單側(cè)t檢驗(yàn)及[1-2α]%置信區(qū)間法進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)。結(jié)果與莫比可?相比，美洛昔康納米骨架膠囊經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的藥物達(dá)峰濃度(Cmax)的90%置信區(qū)間為135.3%～154.8%，藥時(shí)曲線下面積(AUC0～t)的90%置信區(qū)間為104.5%～179.0%，相對(duì)生物利用度(F0～72)=136.8%。2種制劑在比格犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3，平均藥-時(shí)曲線見圖2。

圖2 口服2種制劑后的平均藥-時(shí)曲線

表3 美洛昔康在比格犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

美洛昔康納米骨架膠囊是以具有納米孔徑的二氧化硅和pH敏感材料為主要載體，使難溶性藥物美洛昔康高度分散，從而制備成的高溶出度、高生物利用度的制劑。其能提高體外溶出及體內(nèi)吸收，是因?yàn)槎趸璧木薮蟊缺砻娣e具有很強(qiáng)的吸附作用，使藥物分散在其中，與溶出介質(zhì)的接觸面積更大，釋放速率更快，且更小的粒徑使藥物的遷移變得更加容易，能夠提高藥物與胃腸道的接觸面積，增加藥物的生物利用度。另外，將藥物制成固體分散體時(shí)易發(fā)生晶型轉(zhuǎn)變，藥物晶型由結(jié)晶轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形，在溶解過程中，無需能量破壞藥物的晶格結(jié)構(gòu)，大大提高了藥物的溶出速率，同時(shí)載體還可作為藥物結(jié)晶的抑制劑來穩(wěn)定處于高能態(tài)的無定形藥物的存在。

根據(jù)生物藥劑學(xué)分類，美洛昔康屬于BCS Ⅱ類藥物[8]，溶出是口服吸收的限速步驟，而增加難溶藥物的溶解度對(duì)其釋藥速率尤為重要[9-12]。此外，美洛昔康溶解度具有pH依賴性，在酸性介質(zhì)中溶解度低[13]，圖2中莫比可?在酸性介質(zhì)中的溶出行為有相應(yīng)體現(xiàn)。而圖2顯示美洛昔康納米骨架膠囊在酸性介質(zhì)中的主藥溶出度顯著提高，從而確保了其在腸道內(nèi)更快吸收。體現(xiàn)在比格犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)對(duì)比研究中，與市售莫比可?相比(tmax=3.500 h)，美洛昔康納米骨架膠囊表現(xiàn)出較快的藥物吸收速率(tmax=2.833 h)。此外，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)經(jīng)等效性分析表明，相同劑量下，美洛昔康納米骨架膠囊Cmax是莫比可?的1.461倍，AUC0-t是莫比可?的1.319倍，生物利用度提高30%左右。結(jié)果表明，美洛昔康納米骨架膠囊顯著提高了主藥在酸性介質(zhì)中的溶出量，且提升了其在比格犬體內(nèi)的吸收速度與程度，臨床應(yīng)用可增強(qiáng)鎮(zhèn)痛效果。

盡管美洛昔康是一種選擇性COX-2抑制劑，但仍存在10%～20%的胃腸道不良反應(yīng)發(fā)生率[14]，且通常與劑量相關(guān)[15]。美國食品藥品管理局(FDA)等專業(yè)醫(yī)學(xué)組織的用藥指南中明確強(qiáng)調(diào)：NSAIDs應(yīng)在最短療程內(nèi)使用最低有效劑量，以降低心血管和胃腸道等毒性風(fēng)險(xiǎn)[16-17]。故在此基礎(chǔ)上可繼續(xù)開發(fā)起效時(shí)間快的低劑量美洛昔康制劑，減少藥物用量以減緩胃腸道刺激，該研究為進(jìn)一步開發(fā)新型美洛昔康制劑及其臨床安全、合理用藥提供了依據(jù)。