膠質(zhì)瘤中Circular RNA PRKCI的表達(dá)及預(yù)后相關(guān)影響因素研究

陳 隆，張玉富

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710038)

膠質(zhì)瘤是世界范圍內(nèi)常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，每年40多萬人因患膠質(zhì)瘤而死亡[1]。世界衛(wèi)生組織(WHO)將膠質(zhì)瘤分為低級(jí)別(WHO I級(jí)和Ⅱ級(jí))和高級(jí)別(WHO Ⅲ級(jí)和IV級(jí))。雖然膠質(zhì)瘤患者可以通過手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后放化療治療，但患者存活率相當(dāng)?shù)?。有研究[1-2]表明膠質(zhì)瘤患者的5年生存率不到15%，中位生存期只有12～18個(gè)月。近年來，研究人員開始關(guān)注膠質(zhì)瘤的分子機(jī)制、預(yù)后及生物標(biāo)志物治療，試圖開發(fā)針對(duì)膠質(zhì)瘤患者的分子靶向治療，以控制膠質(zhì)瘤的進(jìn)程[3-4]。環(huán)狀RNA(Circular RNA)是一種特殊類型的非編碼RNA，由內(nèi)源性RNA共價(jià)結(jié)合形成閉合環(huán)，其沒有5’端帽子和3’端PolyA尾巴，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。環(huán)狀RNA于20世紀(jì)70年代于病毒中首次被發(fā)現(xiàn)，最初被認(rèn)為是一種錯(cuò)誤的剪切產(chǎn)物[5]。但近年來，高通量測(cè)序和生物醫(yī)學(xué)研究證實(shí)了許多環(huán)狀RNA為組織特異性表達(dá)，且在各種生理病理過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。更有越來越多的研究表明，環(huán)狀RNA在膠質(zhì)瘤中差異表達(dá)，調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、增殖和侵襲，因此可能成為膠質(zhì)瘤診斷的潛在標(biāo)記物[2]。此外，一些環(huán)狀RNA與膠質(zhì)瘤分期有關(guān)，可能有助于判斷患者的預(yù)后[6]。有文獻(xiàn)[7]報(bào)道，Circular RNA PRKCI通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制microRNA-545的作用，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲。鑒于此，本研究旨在探討Circular RNA PRKCI在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其預(yù)后意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經(jīng)病理確診的61份膠質(zhì)瘤標(biāo)本取自從2012年5月至2015年1月開始在空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科接受手術(shù)的患者，年齡25～78歲，其中男性37例，女性24例，WHO Ⅰ級(jí)12例，WHO Ⅱ級(jí)15例，WHO Ⅲ級(jí)16例，WHO Ⅳ級(jí)18例。另有35例正常腦組織標(biāo)本取自本科顱腦損傷患者，其中男性21例、女性14例，年齡21～63歲，術(shù)前影像學(xué)及病史詢問均無膠質(zhì)瘤病史，患者均行開顱手術(shù)清除受傷病灶，其組織作為本研究的對(duì)照組。術(shù)前患者均未接受放化療，也排除患者有其他重大疾病及未同意參與實(shí)驗(yàn)者。所得標(biāo)本保存于液氮中。本研究獲得了唐都醫(yī)院倫理委員會(huì)書面同意及批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照指導(dǎo)方針執(zhí)行。

1.2 研究方法 對(duì)照組組織和膠質(zhì)瘤標(biāo)本用Fast Start Universal SYBR Green Master(德國羅氏)對(duì)總RNA進(jìn)行cDNA和RT-qPCR檢測(cè)，選擇GAPDH作為內(nèi)源性對(duì)照。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RNA樣品用TRIzol試劑提取。分光光度計(jì)檢測(cè)A260/280和A260/230處的光密度值，評(píng)價(jià)提取RNA的濃度和純度。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用qRT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)所用到的相關(guān)引物：Circular RNA PRKCI正向：5’-ATTCAGGGACACCCGTTC-TT-3’和反向：5’-CTCTTCAGAACACTTGCAGCT-T-3’，GAPDH正向：5’-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3’，反向：5’-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’)。

2 結(jié) 果

2.1 Circular RNA PRKCI在膠質(zhì)瘤組和對(duì)照組中的表達(dá) 見表1。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Circular RNA PRKCI在Ⅰ-Ⅱ級(jí)的膠質(zhì)瘤組織中顯著降低[(1.000±0.2287)與(2.707±0.1979),P<0.001]，且Ⅲ-Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)較Ⅰ-Ⅱ級(jí)低[(2.707±0.1979)與(3.830±0.2169),P=0.0019]。

表1 Circular RNA PRKCI在對(duì)照組和膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

2.2 Circular RNA PRKCI水平與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系 見表2。根據(jù)Circular RNA PRKCI表達(dá)均值，將61例膠質(zhì)瘤患者分為低表達(dá)組(28例)和高表達(dá)組(33例)。Circular RNA PRKCI的表達(dá)水平與WHO分級(jí)、KPS評(píng)分顯著相關(guān)，此外，Circular RNA PRKCI的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小、癌癥家族史無明顯相關(guān)性。

表2 Circular RNA PRKCI表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系(例)

2.3 Circular RNA PRKCI表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier分析和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)顯示，Circular RNA PRKCI高表達(dá)患者的5年存活率比低表達(dá)Circular RNA PRKCI的患者差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0309),見圖1。進(jìn)一步評(píng)估Circular RNA PRKCI的預(yù)后作用，COX分析Circular RNA PRKCI和其他臨床參數(shù)對(duì)患者預(yù)后的影響，結(jié)果表明，WHO分級(jí)、KPS評(píng)分、Circular RNA PRKCI表達(dá)水平與患者預(yù)后有關(guān)，且Circular RNA PRKCI過度表達(dá)(P<0.001)可作為膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子,見表3。

圖1 Circular RNA PRKCI高表達(dá)和低表達(dá)患者生存時(shí)間比較

表3 膠質(zhì)瘤患者各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)的單因素和多因素分析

3 討 論

膠質(zhì)瘤是一種嚴(yán)重威脅人類生命的惡性腫瘤，主要影響腦內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞，而膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元的相互作用中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，加上膠質(zhì)瘤的侵襲性生長(zhǎng)，很難通過外科手術(shù)完全切除腫瘤[8-10]。因此，盡管在神經(jīng)腫瘤的診療方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但膠質(zhì)瘤患者的存活率仍然很低，據(jù)報(bào)道低WHO分級(jí)膠質(zhì)瘤患者的平均生存時(shí)間約為60個(gè)月，而高WHO分級(jí)膠質(zhì)瘤患者的平均生存時(shí)間僅有13個(gè)月[11-13]。

環(huán)狀RNA早在20世紀(jì)70年代在病毒中被發(fā)現(xiàn)，后又于多種生物體內(nèi)檢測(cè)到環(huán)狀RNA的存在，但其一直被認(rèn)為是錯(cuò)誤的剪接產(chǎn)物，在體內(nèi)無實(shí)際功能[14-15]。而新近研究表明，環(huán)狀RNA可參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳等基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[16]。CircRNA在多種疾病尤其是腫瘤中均有不同程度的表達(dá)，可作為新的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，且與其他RNA相比，環(huán)狀RNA干預(yù)具有較少的脫靶和副作用。因此，環(huán)狀RNA是更有前景的分子治療靶點(diǎn)[17]。我們所研究的Circular RNA PRKCI分子此前已被證實(shí)在多種腫瘤中具有促癌作用，其在食管癌中的表達(dá)水平高于正常對(duì)照，且通過miR-3680-3p作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA調(diào)節(jié)AKT3的表達(dá)，這可能在食管癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[18]。環(huán)狀Circular RNA PRKCI通過與在胃癌組織和細(xì)胞系中錯(cuò)誤地高表達(dá)，并通過結(jié)合microRNA-545，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲[19]。此外，Circular RNA PRKCI還通過與microRNA-1324結(jié)合促進(jìn)MECP2的表達(dá)從而促進(jìn)肺癌進(jìn)展，提示我們Circular RNA PRKCI可能成為治療肺癌的潛在靶點(diǎn)[20]。

我們的研究證實(shí)了Circular RNA PRKCI在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，與此同時(shí)，數(shù)據(jù)分析表明高WHO分級(jí)的膠質(zhì)瘤患者具有更高水平的Circular RNA PRKCI，提示Circular RNA PRKCI可與膠質(zhì)瘤的惡性程度有一定關(guān)系。隨后我們分析了Circular RNA PRKCI水平與臨床病理特征的各項(xiàng)指標(biāo)，得到Circular RNA PRKCI的表達(dá)與WHO分級(jí)、KPS評(píng)分、顯著相關(guān)，與年齡、性別、腫瘤大小、癌癥家族史無明顯關(guān)系的結(jié)果。我們進(jìn)一步探討了患者預(yù)后與Circular RNA PRKCI有無聯(lián)系，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)Circular RNA PRKCI的高表達(dá)與患者5年生存率低下有關(guān)，單因素和多因素分析顯示高表達(dá)的Circular RNA PRKCI的表達(dá)水平與高WHO分級(jí)、低KPS評(píng)分是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這些結(jié)果可能為Circular RNA PRKCI導(dǎo)向診斷和治療腦膠質(zhì)瘤的研究提供新的視角和方向。

綜上，Circular RNA PRKCI在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，且其過表達(dá)可能導(dǎo)致了患者的不良預(yù)后。對(duì)Circular RNA PRKCI的進(jìn)一步研究對(duì)今后膠質(zhì)瘤等疾病的診斷和治療具有重要的臨床意義。