MGIT 960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)在泌尿系結(jié)核診斷中的價(jià)值

李 靜，趙 濤，梁亞萍，仵倩紅

(陜西省結(jié)核病防治院,陜西 西安710100)

泌尿系結(jié)核(Tuberculous urinary，UTB)是臨床上一種常見的肺外結(jié)核，被認(rèn)為是一種嚴(yán)重的肺外結(jié)核(EPTB)[1-2]，全年約占EPTB病例中的30%～40%，在發(fā)展中國(guó)家位居肺外結(jié)核的第二位[3]。UTB起病隱匿，表現(xiàn)具有多態(tài)性與其他細(xì)菌感染癥狀相似，臨床癥狀不明顯和缺乏特異性，而且通常在疾病的晚期出現(xiàn)癥狀，是UTB患者診斷延遲和治療效果不佳的主要原因[4]。目前篩查較好的尿路造影(CTU)及磁共振泌尿系統(tǒng)水成像技術(shù)(MRU)[5]大多基層并未開展，所以對(duì)于基層臨床診斷除了典型的臨床癥狀最重要的還是依賴于傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)室診斷UTB常用的檢測(cè)方法是：抗酸桿菌(AFB)涂片和分枝桿菌培養(yǎng)[4,6]。AFB涂片雖然快速、價(jià)低，但是尿液標(biāo)本陽(yáng)性檢出率及敏感性都很低，而分枝桿菌培養(yǎng)周期長(zhǎng)、不能滿足臨床早期、快速診治的需求，故尋求一種新的快速、準(zhǔn)確且高敏感度和高特異度的實(shí)驗(yàn)室診斷方法成為UTB檢測(cè)工作的重要目標(biāo)。GeneXpert MTB/RIF(GeneXpert)是以全自動(dòng)半巢式實(shí)時(shí)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，以rpoB基因?yàn)榘谢?，? h內(nèi)同時(shí)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥。2013年GeneXpert檢測(cè)作為新型分子診斷技術(shù)被WHO推薦用于肺外結(jié)核的診斷[7]。但目前GeneXpert用于尿液樣本的數(shù)據(jù)有限，本研究中，通過分析AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert檢測(cè)對(duì)UTB的診斷效能，進(jìn)一步評(píng)估MGIT 960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測(cè)對(duì)UTB的診斷價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 收集2019年1-12月陜西省結(jié)核病防治院收治的185例疑似UTB患者尿液標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)資料，納入同時(shí)采用AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng) 和GeneXpert檢測(cè)的112例疑似UTB患者，所有患者臨床確診資料均來源于臨床原始病例記錄。泌尿系結(jié)核患者診斷依據(jù)(符合下列三項(xiàng)任何一項(xiàng)者，即可確診[8]：尿結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性；病理檢查證實(shí)有結(jié)核病變；膀胱鏡及(或)X線尿路造影有結(jié)核病的典型表現(xiàn)，并結(jié)合臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室各種檢查結(jié)果作出診斷。非泌尿系結(jié)核患者診斷依據(jù)：臨床已確診為其他部位結(jié)核患者(包括肺結(jié)核，腸結(jié)核，子宮內(nèi)膜結(jié)核，結(jié)核性胸膜炎，結(jié)核性腦膜炎，血行播散性結(jié)核)及泌尿系感染，泌尿系腫瘤患者。

1.2 主要試劑和儀器 抗酸染色試劑為實(shí)驗(yàn)室自配萋尼染色試劑；MGIT 960檢測(cè)系統(tǒng)所用的培養(yǎng)儀及試劑均由美國(guó)BD公司提供；GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)及配套試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Cepheid公司。

1.3 檢測(cè)方法 按照無菌采集標(biāo)本的要求收集留取患者晨尿標(biāo)本至少5 ml，每份標(biāo)本均進(jìn)行AFB涂片，MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert檢測(cè)。①AFB涂片：嚴(yán)格按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[8]操作。將尿液標(biāo)本用一次性吸管吸取少許于潔凈玻片上涂片，大小約為1 cm×2 cm、干燥后萋尼染色鏡檢，按照檢驗(yàn)規(guī)程報(bào)告結(jié)果。②MGIT 960培養(yǎng)：嚴(yán)格按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[9]操作。取2 ml尿液標(biāo)本經(jīng)N-乙酰-L-半胱胺酸-氫氧化鈉法(NALC-NaOH，終濃度為1.5%)消化去污處理后，室溫靜置15 min，用磷酸鹽緩沖液(pH=6.8PBS)中和后再3000 g離心15 min，棄上清，2 ml PBS緩沖液重懸沉淀物，取0.5 ml重懸液接種至MGIT 960培養(yǎng)管中，加入0.8 ml 營(yíng)養(yǎng)添加劑(OADC)和雜菌抑制劑(PANTA)的混合液，嚴(yán)格按照說明進(jìn)行操作。將接種好的MGIT960培養(yǎng)管放入MGIT 960系統(tǒng)中孵育，儀器對(duì)分枝桿菌的生長(zhǎng)進(jìn)行自動(dòng)監(jiān)測(cè)。儀器報(bào)陽(yáng)后采用結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)試劑盒(MPB64)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的初步鑒定[10]。③GeneXpert檢測(cè)：嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行檢驗(yàn)。將1 ml尿液標(biāo)本與2 ml GeneXpert 系統(tǒng)前處理液混合，擰緊瓶蓋，渦旋震蕩15 s，室溫靜置15 min，使標(biāo)本充分液化，將消化后的2 ml樣品用無菌吸管吸入GeneXpert系統(tǒng)測(cè)試盒中，上機(jī)檢測(cè)，約2 h報(bào)告結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以臨床確診患者為參考標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert及MGIT960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測(cè)技術(shù)的敏感度、特異度、符合率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 112例患者一般資料 112例患者中男 59例、女 53例，其中62例(55.4%)確診為泌尿系結(jié)核患者(UTB組),18例(29.0%)尿結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性；44例(71.0%)以膀胱鏡及(或)X線尿路造影有結(jié)核病的典型表現(xiàn)，并結(jié)合臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室各種檢查結(jié)果作出診斷。50例(44.6%)臨床確診為非泌尿系結(jié)核(非UTB組)患者(包括肺結(jié)核25例，腸結(jié)核4例，子宮內(nèi)膜結(jié)核2例，結(jié)核性胸膜炎4例，結(jié)核性腦膜炎3例，血行播散性結(jié)核2例及泌尿系感染6例，泌尿系腫瘤4例)。UTB組中男34例(54.8%)、女28例(45.2%)；年齡17～73歲，平均(46.37±15.51)歲；非UTB組中男25例(50.0%)、女25例(50.0%)，年齡19～78歲，平均(45.42±18.13)歲。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 不同檢測(cè)方法診斷UTB的效能 以臨床確診泌尿系結(jié)核患者為標(biāo)準(zhǔn)，AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert對(duì)UTB的檢測(cè)效能，見表2。AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert和MGIT 960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測(cè)的敏感度分別為12.9%(8/62，95%CI：4.6%～21.2%),29.0%(18/62，95%CI：17.7%～40.3%),53.2%(33/62,95%CI：40.8%～65.6%)和72.6%(45/62，95%CI：61.5%～83.7%)。尿液標(biāo)本AFB涂片的敏感度低于MGIT 960培養(yǎng)(χ2=4.87,P<0.05),尿液標(biāo)本AFB涂片的敏感度低于GeneXpert檢測(cè)(χ2=22.77,P<0.05),62例臨床診斷患者中MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert檢測(cè)UTB結(jié)果有6例患者結(jié)果是一致的， MGIT 960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測(cè)的敏感度高于GeneXpert檢測(cè)(χ2=4.97,P<0.05)、MGIT 960培養(yǎng)(χ2= 23.52,P<0.05)以及AFB涂片(χ2=45.11,P<0.05)。特異度分別為96.0%(48/50),100.0%(50/50)，100.0%(50/50)和100.0%(50/50)；符合率分別為50.0%(56/112),60.7%(68/112)，74.1%(83/112)和84.8%(95/112)。

表2 不同檢測(cè)方法對(duì)UTB診斷效能

3 討 論

UTB是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性、進(jìn)行性、破壞性病變，是肺外結(jié)核的一種，泌尿系結(jié)核病中以腎結(jié)核最為重要，常常在肺結(jié)核病發(fā)生或愈合較長(zhǎng)時(shí)間以后才開始出現(xiàn)臨床病象，多繼發(fā)于肺結(jié)核[11-14]。由于UTB早期臨床癥狀不明顯和缺乏特異性常常導(dǎo)致診斷的延誤，從而影響患者的生存質(zhì)量并危及生命。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法仍是結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而與痰標(biāo)本不同，尿液標(biāo)本實(shí)驗(yàn)室檢查中AFB涂片查找抗酸桿菌的陽(yáng)性率很低，而分枝桿菌培養(yǎng)周期長(zhǎng)、不能滿足臨床早期、快速、準(zhǔn)確診治的需求，故尋求一種新的快速、準(zhǔn)確且高敏感度和高特異度的診斷方法成為UTB檢測(cè)工作的重要目標(biāo)[15-16]。而GeneXpert檢測(cè)作為新型分子診斷技術(shù)，其在肺外結(jié)核中的診斷價(jià)值已被多項(xiàng)研究評(píng)估[17-18]，認(rèn)為應(yīng)用GeneXpert檢測(cè)胸腔積液、腦脊液及骨關(guān)節(jié)結(jié)核部位膿液標(biāo)本具有較高的敏感度和檢測(cè)方法的優(yōu)越性，被認(rèn)為可用于肺外結(jié)核的各種類型的臨床標(biāo)本(如腦脊液和組織樣本)檢測(cè)的確證性診斷試驗(yàn)，但對(duì)于尿液的檢測(cè)效果數(shù)據(jù)較少，2017年P(guān)ang等[19]以L-J固體培養(yǎng)法為診斷標(biāo)準(zhǔn)比較了AFB涂片、L-J固體培養(yǎng)法和GeneXpert三種檢測(cè)方法在UTB中的診斷敏感度，分別為18.5%(15/81，95%CI：10.1%～20.7%)，45.7%(37/81，95%CI：34.8%～56.5%)和63.0%(51/81，95%CI：52.4%～73.5%)。陳禹等[20]以臨床確診為診斷金標(biāo)準(zhǔn)比較了AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert三種檢測(cè)方法在UTB中的診斷敏感度，分別為11.9%(7/59，95%CI：4.9%～22.9%)，42.4%(25/59，95%CI：29.6%～55.9%)和為64.4% (38/59，95%CI：50.9%～76.4%)。本研究中以臨床確診為診斷標(biāo)準(zhǔn)比較了AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert三種檢測(cè)方法在UTB中的診斷敏感度，分別為12.9%(8/62，95%CI：4.6%～21.2%)，29.0%(18/62，95%CI：17.7%～40.3%)和53.2% (33/62，95%CI：40.8%～65.6%)。相比于其他研究本研究這三種檢測(cè)方法的敏感度均較低，尤其以MGIT 960培養(yǎng)更為明顯，分析原因主要有以下幾點(diǎn)：①尿液標(biāo)本含菌量本身就較低，而此次納入的臨床患者留取的尿液標(biāo)本均為晨尿，并非24 h尿，含菌量更少使得陽(yáng)性檢出率更低；②此研究中AFB涂片法的尿液標(biāo)本染色具體實(shí)驗(yàn)操作方法同痰液，冷染半個(gè)小時(shí)，而尿液標(biāo)本的相比較痰液黏附率本身就很低[21]，冷染時(shí)間長(zhǎng)固定效果減弱沖片時(shí)更容易脫落，且AFB涂片需抗酸桿菌達(dá)到5×103～1×104個(gè)/ml的濃度才能檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，涂片樣本量難以達(dá)到檢測(cè)需求故而陽(yáng)性檢出率更低；③MGIT 960培養(yǎng)對(duì)環(huán)境要求極高，但前處理過程較為復(fù)雜，尿液標(biāo)本在處理過程中所用的消化條件與痰液相同，而該處理過程更適合痰液，對(duì)于含菌量較少的尿液標(biāo)本來說過于嚴(yán)苛，使得尿液樣本中的大多結(jié)核分枝桿菌暴露于堿性環(huán)境中[22]，從而使一定比例的結(jié)核分枝桿菌被殺死失去活性，且最終培養(yǎng)的加樣量?jī)H有500 μl載菌量較低，從而導(dǎo)致MGIT 960培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率低；④GeneXpert雖操作過程簡(jiǎn)單，但加樣量也只有1 ml，載菌量也較低；⑤有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌在感染患者的尿液中間歇排泄，單個(gè)尿液標(biāo)本(如晨尿、隨機(jī)尿)比24 h尿標(biāo)本更可能呈現(xiàn)假陰性[23]，這也是此次研究這幾種檢測(cè)方法敏感性均較低的主要原因。

本研究中，AFB涂片法的敏感度最低，其中有2例涂片陽(yáng)性的疑似患者臨床最終確診為非泌尿系結(jié)核。GeneXpert檢測(cè)的敏感度明顯高于其他兩種檢測(cè)方法，但MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert的檢測(cè)陽(yáng)性者僅有6例為同時(shí)陽(yáng)性，重疊比例較低，這可能的原因?yàn)椋罕狙芯恐写蠖郩TB患者在留取樣本之前已經(jīng)在當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病院進(jìn)行了一段時(shí)間的抗結(jié)核藥物治療，而結(jié)核菌培養(yǎng)主要針對(duì)檢測(cè)的是活的結(jié)核分枝桿菌，GeneXpert主要檢測(cè)的是結(jié)核分枝桿菌的DNA，已使用抗結(jié)核藥物將會(huì)影響結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率，且MGIT 960培養(yǎng)與GeneXpert的細(xì)菌濃度陽(yáng)性閾值檢測(cè)限也不相同(前者為100條/ml，后者為131條/ml)。在這三種檢測(cè)方法中GeneXpert檢測(cè)有明顯的優(yōu)點(diǎn)：用時(shí)短、2 h可在患者標(biāo)本中直接檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，且能檢測(cè)利福平是否耐藥，但是盡管現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在結(jié)核病研究中發(fā)揮著越來越重要的作用，但是結(jié)核桿菌培養(yǎng)方面依然有著不可替代的作用，而且至今仍然是結(jié)核及肺外結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[24]，較AFB涂片的敏感性要高，對(duì)于排菌量小、涂片檢測(cè)陰性的患者能及時(shí)發(fā)現(xiàn)傳染源，對(duì)疫情控制有重要價(jià)值，在結(jié)核病的診斷、菌種鑒定、藥物敏感性試驗(yàn)為了更好的為臨床提供診斷依據(jù)，所以為了提高陽(yáng)性檢出率，避免漏檢，更好的利用每種檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)。本研究采用MGIT 960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測(cè)，得出其敏感度為72.6%(45/62，95%CI：61.5%～83.7%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GeneXpert檢測(cè)、MGIT 960培養(yǎng)和AFB涂片三種檢測(cè)方法在UTB中的診斷敏感度：53.2% (33/62，95%CI：40.8%～65.6%)(χ2=4.97，P<0.05)；29.0%(18/62，95%CI：17.7%～40.3%)(χ2= 23.52，P<0.05)；12.9%(8/62，95%CI：4.6%～21.2%)(χ2=45.11，P<0.05)。所以MGIT 960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測(cè)在UTB中有較高的診斷優(yōu)勢(shì)，可以進(jìn)一步推廣。

本研究也存在一定的局限性：①雖然統(tǒng)計(jì)了全年疑似病例，但是最終納入的UTB患者樣本量仍然較小；②本研究中MGIT 960培養(yǎng)對(duì)尿液標(biāo)本前處理使用的是痰液的處理方式，降低了MGIT 960培養(yǎng)對(duì)尿液標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的檢出率；③由于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)條件有限，對(duì)于不相符的檢測(cè)結(jié)果未能進(jìn)行進(jìn)一步研究。基于此次的研究結(jié)果， MGIT 960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測(cè)在尿液樣本中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的優(yōu)異性還需要更大的樣本量來驗(yàn)證，并對(duì)于不相符的結(jié)果最好能夠進(jìn)行基因測(cè)序等進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，GeneXpert檢測(cè)對(duì)UTB早期診斷具有較高的敏感度和特異度且高于傳統(tǒng)的抗酸染色涂片鏡檢和結(jié)核菌培養(yǎng)，但因其檢測(cè)量只有1 ml，可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌載菌量較低而使檢測(cè)敏感度較低，另外為了鑒定結(jié)核分枝桿菌并對(duì)抗結(jié)核藥物進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，僅僅依靠PCR方法是不夠的。而MGIT 960培養(yǎng)聯(lián)合GeneXpert檢測(cè)，不僅結(jié)合了MGIT 960培養(yǎng)檢出活的結(jié)核分枝桿菌以及GeneXpert早期快速的優(yōu)勢(shì)，更好的發(fā)現(xiàn)傳染源并進(jìn)行菌種鑒定，也補(bǔ)充了GeneXpert檢測(cè)技術(shù)在耐藥檢測(cè)方面的單一性，能更好的指導(dǎo)臨床用藥及合理調(diào)整用藥方案，對(duì)患者的診斷治療以及耐藥篩查都有很大的幫助，也大大降低了漏診率，篩查意義更重大。