耳聾基因芯片法檢測(cè)在耳聲發(fā)射不合格的非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾新生兒篩查中的應(yīng)用價(jià)值

江玉剛，耿敏彥

(西安工會(huì)醫(yī)院耳鼻喉科,陜西 西安 710100)

近年來(lái)，新生兒聽力篩查已在我國(guó)廣泛推廣及應(yīng)用，早期對(duì)新生兒聽力做出精準(zhǔn)的評(píng)估，可根據(jù)評(píng)估結(jié)果為其制定及時(shí)有效的治療方案，故新生兒聽力篩查具有重要的臨床價(jià)值[1]。諸多新生兒聽力篩查研究提示，部分新生兒出生時(shí)即被診斷為耳聲發(fā)射不合格，而這部分新生兒可由單一基因突變或不同基因的復(fù)合突變導(dǎo)致，且與環(huán)境相關(guān)，部分新生兒由基因與環(huán)境兩種因素共同造成[2-3]。已有相關(guān)研究[4]證實(shí)，50%的耳聾患兒與遺傳因素相關(guān)，其中70%的遺傳性耳聾以耳聾外不伴隨其他臨床癥狀即非綜合征耳聾。在我國(guó)，大部分耳聲發(fā)射不合格的非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾新生兒的突變基因?yàn)镚JB2、GJB3、SLC26A4及mtDNA12s rRNA等，而以上突變基因?yàn)槎暟l(fā)射不合格的非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾新生兒的基因篩查及診斷提供了理論依據(jù)。現(xiàn)臨床常采用直接測(cè)序、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、酶切、DHPLC等常規(guī)基因診斷方法，但由于上述方法存在價(jià)格昂貴、耗時(shí)費(fèi)力及不能定性等局限性，且無(wú)法檢測(cè)不同基因的多個(gè)突變位點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)臨床快速檢測(cè)，急需建立一種精準(zhǔn)的基因突變檢測(cè)法。而耳聾基因芯片法是一種耳聾基因篩查工具，其主要檢測(cè)特點(diǎn)為其固有的高效平行，其高度與耳聾基因高遺傳異質(zhì)性的特點(diǎn)相契合，且具有極高的檢測(cè)耳聾基因的潛力。但關(guān)于耳聾基因芯片在耳聲發(fā)射不合格的非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾新生兒篩查中的應(yīng)用甚少。基于此，本研究將探討耳聾基因芯片法在耳聲發(fā)射不合格的非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾新生兒篩查中的應(yīng)用價(jià)值，以期為臨床提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月至2020年2月于我院出生的70例耳聲發(fā)射不合格的非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾新生兒為研究對(duì)象。其中男39例，女31例；年齡3～27 d，平均(12.83±3.21)d；體重2500～3990 g，平均(2760±30)g。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合聽力檢查診斷標(biāo)準(zhǔn)：新生兒出生3 d后采用耳聲發(fā)射法(Otoacousticemisson,OAE)和自動(dòng)聽性腦干反應(yīng)法(Automatic auditory brainstem response,AABR)進(jìn)行聽力篩查，判定結(jié)果為“refer”或“pass”，若初次篩查未通過(guò)則需在新生兒42 d時(shí)再次復(fù)查，兩者均未通過(guò)即為耳聲發(fā)射不合格的非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾。②臨床資料完整；③均采集靜脈血進(jìn)行；④足月、單胎患兒；⑤本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且患兒家屬均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不完整；體重過(guò)低或巨大兒；早產(chǎn)兒。

1.2 研究方法

1.2.1 耳聾基因芯片法檢測(cè)：①試劑及儀器：北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的小量基因組DNA提取試劑盒；博奧生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的基因擴(kuò)增儀(BIOERTC-96/G/H)、芯片掃描儀(Lux-ScanTM10 k/B)、芯片洗干儀(Slide-WasherTM8)、芯片雜交儀(BiomixerTMⅡ)、PCR儀(Cycler96)。②DNA提?。翰捎煤蹤此徕c抗凝劑的真空采血管收集患兒的足跟血3滴，采用試劑盒提取DNA，其操作步驟需嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行操作，DNA定量和純度采用BECKMAN DU800紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。③PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)體系為25 μl，將其A、B兩個(gè)反應(yīng)體系，多重PCR擴(kuò)增采用BIOER TC-96/G/H。④雜交：在芯片的點(diǎn)樣區(qū)域內(nèi)加入PCR變性產(chǎn)物混合液，將雜交盒密閉，在水平位快速放進(jìn)50 ℃預(yù)熱的雜交儀中雜交1 h。⑤洗片、甩干及掃描：經(jīng)SLidewasher8芯片洗干儀與按照規(guī)程配置好洗滌液Ⅰ和洗滌液Ⅱ相連接，搖床洗滌2 min。在干倉(cāng)內(nèi)放入芯片，置入離心機(jī)以1600 r/min離心2 min甩干。芯片采用Lux-ScanTM10 k/B微陳列芯片掃描儀，激光掃描強(qiáng)度設(shè)置為90和激發(fā)波長(zhǎng)為532 nm。⑥檢測(cè)SLC26A4基因、GJB2編碼區(qū)序列及線粒體DNA 12SrDNA A1555G點(diǎn)突變：設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增及直接測(cè)序。其中SLC26A4基因序列：對(duì)突變熱點(diǎn)區(qū)域第7+8、第19外顯子進(jìn)行篩查，若發(fā)現(xiàn)單雜合突變則需對(duì)第10、15、17及3外顯子進(jìn)行篩查，并對(duì)其余下外顯子進(jìn)行篩查，直至出現(xiàn)另一個(gè)突變或?qū)ζ淙客怙@子進(jìn)行篩查；若發(fā)現(xiàn)復(fù)合雜合突變或純合則可停止檢測(cè)。Prev-DAF藥物性耳聾基因診斷試劑盒檢測(cè)線粒體DNA 12SrDNA A1555G 點(diǎn)突變。

1.2.2 酶切或測(cè)序法：于15 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入3 μl的酶切緩沖液(10×)、1 μl的Taq Ⅰ酶，補(bǔ)充蒸餾水到30 μl，即總體系30 μl。65 ℃水浴箱酶切過(guò)夜，酶切產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物送至諾和生物科技有限公司測(cè)序，具體步驟見該公司操作手冊(cè)。

1.2.3 結(jié)果評(píng)定：DNA序列為兩列(a、b)，若探針檢測(cè)同個(gè)位點(diǎn)a列出現(xiàn)陰性信號(hào)，b列為陽(yáng)性信號(hào)，則判讀該位點(diǎn)為突變純合型；若探針檢測(cè)同個(gè)位點(diǎn)a列出現(xiàn)陽(yáng)信號(hào)，b列為陽(yáng)性信號(hào)，則判讀該位點(diǎn)為雜合突變型；若探針檢測(cè)同個(gè)位點(diǎn)a列出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，b列為陽(yáng)性信號(hào)，則判讀該位點(diǎn)為野生型；若在不同位點(diǎn)出現(xiàn)以上多種情況，則判讀該位點(diǎn)為復(fù)合突變型。

2 結(jié) 果

2.1 70例新生兒檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)耳聾基因芯片檢測(cè)70例患兒的陽(yáng)性率為50.00%；經(jīng)酶切或測(cè)序法70例患兒的陽(yáng)性率為54.29%，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 70例新生兒檢測(cè)結(jié)果 [例(%)]

2.2 不同檢測(cè)方法對(duì)GJB2基因突變等基因檢測(cè)結(jié)果 對(duì)176del16、35delG、299-300delAT、235delC的GJB2基因突變位點(diǎn)的芯片點(diǎn)陣，其中測(cè)序法分別檢出0個(gè)、1個(gè)、59個(gè)、9個(gè)；基因芯片法分別檢出等位基因突變0個(gè)、1個(gè)、57個(gè)及9個(gè)；后3個(gè)的等位基因突變檢出率，測(cè)序法與基因芯片法的符合率依次為100%(1/1)、100%(9/9)及96.61%(57/59)。由于235delC點(diǎn)位在芯片結(jié)果中采用肉眼觀察被誤判為單雜合突變，故符合率為96.61%。

2.3 不同檢測(cè)方法對(duì)SLC26A4等位基因突變檢測(cè)結(jié)果 IVS7-2A>G、2168A>G的SLC26A4等位基因突變的芯片點(diǎn)陣，其中測(cè)序法分別檢出等位基因突變6個(gè)和27個(gè)；基因芯片法的分別檢出等位基因突變6個(gè)和27個(gè)。測(cè)序法與基因芯片法的等位基因突變的符合率為100%(6/6、27/27)。

2.4 隨訪結(jié)果 70例患兒均被告知于3個(gè)月齡時(shí)到門診進(jìn)行常規(guī)聽力診斷及隨訪，其中4例mtDNAA155G及23例GJB2基因突變的患兒被稱為中度耳聾，11例SLC26A4突變患兒被稱為重度耳聾。其余31例耳聲發(fā)射不合格的新生兒非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾患兒被診斷為聽力未見異常及1例IVS7-2A>G和299-300delAT雙雜合突變者為正常，且后期每半年對(duì)其進(jìn)行聽力檢測(cè)一次。見表2。

表2 70例患兒隨訪結(jié)果

3 討 論

2005年據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球聽力障礙患者可高達(dá)2.78億。而我國(guó)約有2780萬(wàn)人為聽力障礙患者，約占障礙群體的33.5%。其中新生兒耳聲發(fā)射不合格的發(fā)生率約為1%～3%，是臨床最為常見的先天缺陷之一[5]。新生兒聽力篩查可及早發(fā)現(xiàn)聽力存在不合格的患兒，進(jìn)而在語(yǔ)言發(fā)育期給予有效干預(yù)，避免損傷語(yǔ)言發(fā)育[6-7]。由于耳聾的遺傳異質(zhì)性較高，大部分耳聲發(fā)射不合格的新生兒相關(guān)基因及位點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)，但常規(guī)檢測(cè)方法對(duì)多突變位點(diǎn)不敏感。而遺傳性耳聾基因診斷芯片針對(duì)遲發(fā)性耳聾、藥物性耳聾等4個(gè)基因中的9個(gè)突變位點(diǎn)具有極高的敏感性，其主要特點(diǎn)為操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化及通量高等[8]。故本研究將探討耳聾基因芯片在耳聲發(fā)射不合格的新生兒非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾患兒中的應(yīng)用價(jià)值，從基因水平對(duì)耳聲發(fā)射不合格的新生兒非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾患兒的發(fā)病原因進(jìn)行明確，以便為其提供及時(shí)的治療及指導(dǎo)。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)耳聾基因芯片法檢測(cè)70例耳聲發(fā)射不合格的非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾新生兒的陽(yáng)性率為50.00%，經(jīng)酶切或測(cè)序法檢測(cè)70的陽(yáng)性率為54.29%，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但單雜合突變的患者提示可能為遺傳性耳聾，可建議進(jìn)一步進(jìn)行耳聾基因篩查。與前人研究結(jié)果相似[9-10]。同時(shí)在本研究結(jié)果中，未檢測(cè)出707T>C和167delT突變，間接提示了耳聲發(fā)射不合格的新生兒非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾患兒的種族異質(zhì)性。GJB2基因編碼連接蛋白常表達(dá)于人體內(nèi)的耳蝸及皮膚組織內(nèi)，該基因突變后K+進(jìn)入機(jī)體淋巴液內(nèi)致使淋巴液循環(huán)受到影響，引發(fā)感音神經(jīng)性耳聾[11-12]。SLC26A4基因突變會(huì)引發(fā)Pendred和DFNB4綜合征常染色體隱性耳聾[13-15]。而非綜合性常染色體隱性遺傳耳聾中最為常見的致病基因?yàn)樯鲜鰞煞N基因突變[16-18]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)176del16、35delG、299-300delAT、235delC的GJB2基因突變位點(diǎn)的芯片點(diǎn)陣，酶切或測(cè)序法與基因芯片法的符合率依次為100%、100%及96.61%。由于235delC點(diǎn)位在芯片結(jié)果中采用肉眼觀察易被誤判為單雜合突變。IVS7-2A>G、2168A>G的SLC26A4等位基因突變的芯片點(diǎn)陣，酶切或測(cè)序法與基因芯片法的等位基因突變的符合率為100%，說(shuō)明液相酶促反應(yīng)具有極高的特異性，在耳聾基因芯片法進(jìn)行讀片時(shí)出現(xiàn)肉眼誤判，這與芯片標(biāo)簽(Tag)探針與帶熒光PCR產(chǎn)物的非特異性雜交導(dǎo)致增強(qiáng)信號(hào)，故被判為陽(yáng)性，對(duì)此點(diǎn)陣的Tag序列進(jìn)行優(yōu)換，可避免降低出現(xiàn)同樣的錯(cuò)誤[19]。并且統(tǒng)計(jì)本次研究中芯片檢測(cè)結(jié)果中的突變型及野生型的平均熒光信號(hào)值，對(duì)兩者間的CUT-OFF進(jìn)行設(shè)定，并采用自動(dòng)判讀軟件，可避免出現(xiàn)肉眼觀察出現(xiàn)的錯(cuò)誤，且可更直觀、快捷?；蛐酒繌埿酒赏瑫r(shí)檢測(cè)多個(gè)個(gè)體，且每次能同時(shí)檢測(cè)多張芯片，對(duì)儀器要求不高、試劑價(jià)格低廉，相比傳統(tǒng)方法耗時(shí)短、通量高、成本低，能更有效的滿足臨床需求。

本次研究中隨訪結(jié)果顯示，4例mtDNAA155G及23例GJB2基因突變的患兒被稱為中度耳聾，11例SLC26A4突變患兒被稱為重度耳聾。對(duì)12例SLC26A4突變患兒的父母進(jìn)行檢測(cè)其父母均為新生兒相應(yīng)突變基因位點(diǎn)的雜合攜帶者，為避免再次生出耳聾患者，建議再次懷孕時(shí)應(yīng)進(jìn)行產(chǎn)前耳聾常見基因檢測(cè)。由于同一基因的雜合或純和突變會(huì)出現(xiàn)疊加效應(yīng)，故4例mtDNAA155G及23例GJB2基因突變患兒的聽力也會(huì)受到一定程度的影響。如今，經(jīng)本次研究的38例耳聲發(fā)射不合格的新生兒非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾患兒均已佩戴助聽器，聽力效果良好。國(guó)內(nèi)學(xué)者蔡超嬋等[20]研究提示，采用人工耳蝸植入術(shù)治療GJB2基因突變的非綜合性感音神經(jīng)性耳聾患兒，術(shù)后效果理想，在對(duì)其進(jìn)行制定最佳方案時(shí)可采用基因診斷。另外經(jīng)筆者總結(jié)，針對(duì)GJB2基因突變的患兒在成長(zhǎng)過(guò)程中需注意保護(hù)患兒頭部，防止患兒頭部受傷、遠(yuǎn)離噪音、用力咳嗽、憋氣及擤鼻，若發(fā)現(xiàn)聽力發(fā)生異常后需及時(shí)就醫(yī)。其余31例耳聲發(fā)射不合格的新生兒非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾患兒被診斷為聽力未見異常及1例IVS7-2A>G和299-300delAT雙雜合突變患兒，且后期每半年對(duì)其進(jìn)行聽力檢測(cè)一次。這可能是由于該部分新生兒外耳道有羊水或胎脂致使聽力篩查時(shí)耳聲發(fā)射不合格造成結(jié)果為“不合格”假陽(yáng)性，但避免出現(xiàn)漏檢，故針對(duì)該部分患兒每隔半年再次進(jìn)行聽力篩查，以達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早治療，并對(duì)其進(jìn)行隨訪至成年。

總而言之，相比酶切或測(cè)序法，耳聾基因芯片法成本低、準(zhǔn)確性高、操作簡(jiǎn)單快速且更具標(biāo)準(zhǔn)化，能滿足臨床對(duì)常見耳聾基因檢測(cè)需求，值得臨床推廣使用。