PAICS基因促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長及其可能分子機制 ①

夏 偉，沈 旋，李彤彤，莊 瑩，趙小芳，張 虎，杜欣娜

(1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究院，江蘇 鹽城 224005；2.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，江蘇 鹽城 224005)

乳腺癌(Breast cancer, BC)是一種常見的危害女性健康的惡性腫瘤，自20世紀(jì)70年代末開始全球乳腺癌發(fā)病率一直呈上升趨勢[1]。2020年全球最新癌癥報告顯示，全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬例，超過了肺癌的220萬例，乳腺癌取代肺癌，成為全球第一大癌。中國雖不是乳腺癌的高發(fā)國家，但乳腺癌發(fā)病率卻位列女性惡性腫瘤之首[2～4]。尤其是近年，我國乳腺癌發(fā)病率的增長速度高出高發(fā)國家1～2個百分點，且呈現(xiàn)發(fā)病年輕化的趨勢，嚴(yán)重威脅女性的身體健康和生活質(zhì)量。

目前乳腺癌的病因尚未完全清楚，腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移仍是癌癥患者發(fā)生死亡的主要原因，這也使得乳腺癌成為難以治愈的惡性腫瘤之一。開發(fā)新的乳腺癌治療的靶點為乳腺癌治療開辟了新的治療途徑，由于它可以高效選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，減少對正常組織的損傷，提高患者生存質(zhì)量，極大地提高腫瘤的治療效果，對于臨床具有重要意義[5,6]。

磷酸核糖氨基咪唑羧化酶和磷酸核糖氨基咪唑琥珀酰酰胺合酶(Phosphoribosylaminoimidazole Carboxylase And Phosphoribosylaminoimidazolesuccinoc-

arboxamide Synthase, PAICS)是一種編碼雙功能酶的嘌呤生物合成基因，其N-末端含有磷酸核糖氨基咪唑羧化酶活性，C-末端含有磷酸核糖氨基咪唑琥珀酰胺合成酶活性[7]，是一種新的抗凋亡癌基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白。Goswami等報道PAICS表達(dá)下調(diào)可以抑制卵巢癌的生長、增殖和遷移，增強細(xì)胞凋亡[8]。Chakravarthi等報道PAICS在前列腺癌中的表達(dá)顯著上調(diào)，且在前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲中發(fā)揮重要作用，可作為有效的治療靶點[9]，然而其在乳腺癌中的作用尚未得到研究。本研究通過腫瘤數(shù)據(jù)庫大數(shù)據(jù)分析PAICS基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞生的影響，并通過KEGG和GO分析其促癌潛在分子機制。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

乳腺癌中PAICS基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床特征數(shù)據(jù)均來源于腫瘤基因組圖譜計劃(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫。TCGA數(shù)據(jù)庫中收錄了1085例乳腺癌患者的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)和臨床隨訪數(shù)據(jù)。包括乳腺癌在內(nèi)的癌癥細(xì)胞生長依賴基因數(shù)據(jù)來源于DepMap數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫收錄了全基因組CRISPR-Cas9敲除文庫篩選的包括乳腺癌細(xì)胞在內(nèi)的700多種癌細(xì)胞的生長依賴基因。

1.2 分析方法

1.2.1 PAICS基因表達(dá)與臨床特征相關(guān)性數(shù)據(jù)分析

登錄癌癥多組學(xué)和臨床數(shù)據(jù)庫LinkedOmics平臺(http://www.linkedomics.org/)[10]，打開數(shù)據(jù)庫搜索界面，癌癥類型選擇“TCGA_BRCA”，檢索數(shù)據(jù)集選擇“HiSeq_RNA”，基因名稱輸入“PAICS”，數(shù)據(jù)類型選擇“Clincal”，PAICS統(tǒng)計方法選擇“Non-parametric T test”，提交分析，下載結(jié)果。

1.2.2 PAICS基因敲除對乳腺癌細(xì)胞生長的影響

打開CRISPR-Cas9[11]全基因組敲除文庫篩選數(shù)據(jù)(https://score.depmap.sanger.ac.uk/ downloads)，下載數(shù)據(jù)“broad_essentiality_matrices_190724.zip”，選擇乳腺癌細(xì)胞系，分析PAICS基因敲除對乳腺癌細(xì)胞生長的影響，Graphpad Prism 7.0繪圖。

1.2.3 泛癌分析PAICS對細(xì)胞生長的影響

登錄DepMap[12]首頁(https://depmap.org/po-

rtal/)，輸入基因名稱“PAICS”，數(shù)據(jù)集選擇“CRISPR (Avana) Public 20Q1”，下載結(jié)果，Adobe Illustrator CC 2015處理圖片。

1.2.4 PAICS共表達(dá)基因富集分析

下載乳腺癌組織中PAICS共表達(dá)基因：登錄LinkedOmics首頁，癌癥類型選擇“TCGA_BRCA”，數(shù)據(jù)集選擇“HiSeq_RNA”，輸入基因名稱“PAICS”，靶向數(shù)據(jù)類型選擇“HiSeq_RNA”，統(tǒng)計方法選擇“Spearman correlation test”提交分析，下載PAICS共表達(dá)基因列表。

P<0.01，F(xiàn)DR<0.01，r>0.3的基因視為PAICS表達(dá)正相關(guān)基因,P<0.01，F(xiàn)DR<0.01，r<-0.3的基因為PAICS表達(dá)負(fù)相關(guān)基因。打開DAVID 6.8在線工具(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)，分別輸入PAICS表達(dá)相關(guān)基因列表，進(jìn)行KEGG信號通路和GO分析，下載結(jié)果，Image GP軟件 (http://www.ehbio.com/ImageGP/)繪制可視化富集分析圖形。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌中PAICS基因表達(dá)與臨床特征關(guān)聯(lián)性分析

大數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，腫瘤純度、PAM50分子亞型、組織學(xué)類型影響PAICS基因的表達(dá)(P<0.001)，且PAICS基因表達(dá)差異與患者總體生存率相關(guān)聯(lián)(P<0.01)。見表1。

表1 乳腺癌患者PAICS mRNA表達(dá)與臨床特征關(guān)聯(lián)性分析

2.2 PAICS基因敲除抑制乳腺癌細(xì)胞的生長

Behan及其研究團(tuán)隊于2019年進(jìn)行了全基因組CRISPR-Cas9敲除文庫篩選癌癥細(xì)胞生存依賴基因的大規(guī)模實驗，該實驗篩選了源自30種癌癥類型的324種細(xì)胞系的生長或生存依賴基因[11]。本研究挖掘上述實驗研究數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)敲除PAICS基因可以抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF7、CLA-51和MDA-MB-415的生長，見圖1。

圖1 PAICS基因敲除對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

2.3 泛癌分析PAICS基因敲除對細(xì)胞生長的影響

本研究通過癌癥生存依賴基因數(shù)據(jù)庫DepMap分析了PAICS基因敲除對癌細(xì)胞生長的影響，結(jié)果顯示PAICS基因敲除可以影響包括多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病和乳腺癌等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的生長，見圖2。

圖2 泛癌分析PAICS基因敲除對細(xì)胞生長的影響

2.4 PAICS共表達(dá)基因GO和KEGG分析

利用TCGA搜索乳腺癌中PAICS共表達(dá)基因，并進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。GO-BP分析表明，PAICS共表達(dá)基因參與多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞分裂(cell division)、DNA復(fù)制啟動(DNA replication initiation)、微管運動(microtubule-based movement)、胞質(zhì)分裂的正調(diào)控(positive regulation of cytokinesis)、細(xì)胞周期調(diào)控(regulation of cell cycle)等；GO-CC分析顯示，PAICS共表達(dá)基因涉及的細(xì)胞定位包括細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)、驅(qū)動蛋白復(fù)合體(kinesin complex)、胞漿核周區(qū)(perinuclear region of cytoplasm)、胞外間隙(extracellular space)等；GO-MF分析表明，PAICS共表達(dá)基因涉及的分子功能包括ATP結(jié)合(ATP binding)、單鏈DNA結(jié)合(single-stranded DNA binding)、poly(A)RNA結(jié)合(poly(A) RNA binding)、微管運動活性(microtubule motor activity)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性(signal transducer activity)等。參與PAICS共表達(dá)基因的KEGG信號通路包括：細(xì)胞周期(cell cycle)、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟(progesterone-mediated oocyte maturation)、P53信號通路(P53 signaling pathway)、RNA聚合酶(RNA polymerase)、同源重組(homologous recombination)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)等[12，13]。以上生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，PAICS的下調(diào)在乳腺癌相關(guān)的生物學(xué)過程中起著重要作用，為乳腺癌生物標(biāo)志物的研究提供了線索。見圖3。

圖3 PAICS共表達(dá)基因GO和KEGG分析PAICS

3 討論

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤之一，盡管以手術(shù)、放化療、分子靶向治療使乳腺癌的預(yù)后取得了很大發(fā)展，但腫瘤復(fù)發(fā)和遷移仍導(dǎo)致大量患者預(yù)后不良[11]。PAICS作為一種已被報道的抑癌基因，其高表達(dá)能夠促進(jìn)前列腺癌和卵巢癌的發(fā)展。但到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)PAICS在乳腺癌中表達(dá)的表型特征，其對乳腺癌發(fā)生和侵襲的影響以及相關(guān)分子機制尚不清楚。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫Linkedomics、TCGA 數(shù)據(jù)庫 和 cBioPortal等，綜合分析了乳腺癌患者PAICS表達(dá)水平與臨床意義的關(guān)系，明確與之相關(guān)的調(diào)控基因。從而為乳腺癌的臨床診斷和預(yù)后判斷發(fā)現(xiàn)新靶點提供理論依據(jù)，對進(jìn)一步改善乳腺癌的治療將具有重要意義。

研究結(jié)果顯示PAICS表達(dá)與乳腺癌患者的腫瘤純度、PAM50分子亞型、組織學(xué)類型和總生存率等臨床病例特征均具有相關(guān)性，說明PAICS參與了BRCA疾病進(jìn)展。進(jìn)一步生物信息學(xué)實驗表明，敲除PAICS可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7、CLA-51、MDA-MB-415的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。Depmap數(shù)據(jù)庫顯示敲除或沉默PAICS基因，也能限制抑制乳腺癌細(xì)胞系的增殖。共表達(dá)分析顯示這些差異表達(dá)基因主要是影響乳腺癌的上調(diào)和下調(diào)基因。在GO和KEGG分析中，這些差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞外基質(zhì)區(qū)域和刺激反應(yīng)。據(jù)報道，從頭嘌呤途徑以及核糖體和核仁的生物發(fā)生是維持腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和細(xì)胞分裂。而PAICS正是一種關(guān)鍵的從頭嘌呤代謝酶，可產(chǎn)生N-琥珀酸酰胺-6-氨基咪唑核苷酸(SAICAR)。本研究發(fā)現(xiàn)，與PAICS共表達(dá)的基因主要集中在細(xì)胞增殖相關(guān)的過程中，如細(xì)胞分裂、有絲分裂核分裂、DNA結(jié)合等[14]。以上諸多證據(jù)表明，PAICS在促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要作用，可能成為抗腫瘤治療的有力靶點[15,16]。

本研究主要通過生物信息學(xué)軟件驗證乳腺癌與PAICS表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果提示敲低PAICS基因可能影響乳腺癌的增殖，但是PAICS在乳腺癌復(fù)發(fā)中的調(diào)控機制還未明確，PAICS高表達(dá)的基因富集分析結(jié)果有待深入研究，同時本研究仍缺乏相關(guān)實驗驗證，接下來我們會通過體外實驗進(jìn)一步驗證PAICS是否能夠成為抗腫瘤治療的新靶點。