USP9X在乳腺癌中的表達與EGFR相關性的研究 ①

金 堃，周 昱，張赫男

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

乳腺癌是乳腺外科常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，據統(tǒng)計2015年乳腺癌的發(fā)病率位居女性惡性腫瘤首位。其作為一種復雜的異質性腫瘤，臨床上仍然需要根據它的病理學分級、臨床分期以及分子分型制定因人而異的系統(tǒng)的治療方案[1]。探索乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程仍顯得尤為重要,將為乳腺癌患者提供精準的臨床診斷和治療[2]。USP9X是最大的泛素特異性蛋白酶家族的一員，文獻報道USP9X在一些惡性腫瘤中高表達[3,4]，且表達程度與預后呈負相關，因其去泛素化作用，可能對EGFR激活后的正常降解起一定作用，促使EGFR激活后持續(xù)異常表達。EGFR除了在肺癌、腸癌中表達外，在部分乳腺癌中也呈現(xiàn)陽性表達甚至高表達，在三陰性乳腺癌中的陽性表達尤為突出，循證醫(yī)學Meta分析表明，EGFR影響三陰性乳腺癌的預后。本實驗檢測USP9X和EGFR在乳腺癌中的表達，分析其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的意義，為乳腺癌的發(fā)生機制和治療提供一定的借鑒意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從佳木斯大學附屬第一醫(yī)院病理科調取2018-12～2019-07經病理學確診的乳腺浸潤性導管癌和癌旁正常組織蠟塊各50例，性別為女性，排除經過術前治療的病理資料，患者住院病歷資料均在本院病案室及病理科存檔，并且確認臨床病歷資料完整(住院病歷完整，病理標本及其免疫組化結果完整)。

1.2 方法

兔抗人USP9X多克隆抗體購于affinity，兔抗人EGFR即用型抗體購于北京中杉金橋；與一抗相匹配的二抗、山羊血清、Tween 20、DAB顯色劑 、抗原修復液、蘇木素染液等；實驗器材及圖文系統(tǒng)等均由本院病理科提供。

標本按理想實驗要求切片；60℃烤箱烘烤1h；二甲苯分梯度脫蠟；再用梯度酒精脫去二甲苯；PBS和蒸餾水沖洗；置于EDTA抗原修復液pH 9.0高溫高壓抗原修復；切片至Tween 20,浸泡震蕩沖洗去污；切片至于3%的H2O2中滅活內源性酶及封閉內源性生物素，山羊血清抗原封閉；滴加1:25濃度的USP9X一抗、滴加即用型EGFR一抗，常規(guī)孵育；滴加與一抗相匹配的二抗，再次孵育；每一步之間用PBS沖洗3次，每次3min；滴加顯色劑，顯微鏡下控制顯色時間,用蒸餾水充分沖洗；蘇木精復染細胞核；封片，光學顯微鏡下觀察結果。陽性結果判定由本院兩位病理科資深醫(yī)師在高倍鏡視野下，進行陽性結果判定；最終結果分為：陽性表達、高表達和低表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗；相關性采用Spearman相關分析,r值正數為正相關，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 USP9X在乳腺癌和癌旁組織中的表達

USP9X與EGFR染色定位于細胞質及細胞膜，在癌組織中高表達(見圖1A、B),在正常組織中低表達或者不表達(見圖1C、D)。在乳腺癌中USP9X和EGFR蛋白陽性表達率與正常組織相比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05 )。見表1。

表1 乳腺癌癌組織及正常組織中USP9X和EGFR蛋白陽性表達率比較[n=50,n(%)]

圖1 USP9X和EGFR蛋白的表達(×400)

2.2 USP9X和EGFR表達與乳腺癌臨床病理因素的關系

在乳腺癌中，USP9X、EGFR蛋白的表達與患者的年齡及腫瘤大小差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與臨床分期、組織學分級，淋巴結轉移差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；EGFR蛋白的表達與是否為三陰性乳腺癌差異有統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 USP9X和EGFR表達與乳腺癌臨床病理因素的關系

2.3 USP9X與EGFR 蛋白表達的相關性

相關性分析表明，在乳腺癌組織中USP9X與EGFR蛋白的表達水平呈正相關性(r=0.311,P<0.05)。見表3。

表3 乳腺癌組織中USP9X和EGFR表達的相關性分析結果

3 討論

眾所周知，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，是多基因、多機制、多步驟、多階段的，連續(xù)過程。其中周期性作用蛋白及信號傳導蛋白完成作用后未能正常降解，使得廢棄的蛋白以及應該被降解的信號傳導通路蛋白未被降解，導致細胞持續(xù)生長以及分裂，因而導致腫瘤的形成。這其中去泛素化的高表達，作用其底物蛋白，使底物蛋白本身，或者中間途徑的相關蛋白受到其調節(jié)，最終未能進入泛素—蛋白酶體途徑或者溶酶體途徑被降解，最終導致疾病的發(fā)生。

人類基因組大約編碼有95個DUB家族，最大的去泛素化酶家族是泛素特異性蛋白酶家族(USP)。USP9X由N端的核定位序列和蛋白樣結構域組成，C末端具有催化USP特異性半胱氨酸和組氨酸催化殘基。它屬于USP家族，調節(jié)參與細胞內各種蛋白質的胞吞胞吐作用、穩(wěn)定性 、細胞粘附、細胞的生長和遷移、自噬、以及細胞凋亡等。泛素化酶USP9X能通過活性硫醇位點將泛素與靶蛋白拆分開來[5]。解除和分離底物蛋白上的多聚泛素鍵，防止泛素在底物蛋白聚集，起到去泛素化作用[6]。USP9X表達的遺傳突變和異常調節(jié)涉及多種人類疾病，包括神經障礙和癌癥 ，例如肝癌和肺癌[7,8]。有研究報道，USP9X通過抑制MCL-1泛素化和蛋白酶體降解與MCL-1蛋白相互作用并穩(wěn)定MCL-1蛋白，而USP9X的敲低和化學抑制均已顯示出有效促進癌細胞凋亡。腫瘤細胞的增殖，凋亡，耐藥和轉都與USP9X緊密相關[9～11]。到目前為止，已有大約40種蛋白質被鑒定為USP9X相互作用蛋白質，其中超過20種蛋白質被鑒定為USP9X去泛素化底物。

EGFR是一種存在于人體多種細胞膜上的糖蛋白，屬于表皮生長因子家族，又名HER-1。目前在非小細胞肺癌、頭頸部和宮頸鱗癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了EGFR的表達。在通常情況下，EGFR以單體的形式存在，當其與配體發(fā)生結合后，將優(yōu)先與HER-2結合形成異源二聚體，同時也可以與另一HER-1結合形成同源二聚體，但是與HER-2結合形成的異源二聚體功能遠強于其與HER-1結合形成的同源二聚體，最關鍵的是異源二聚體相比較同源二聚體在細胞膜上停留的時間較長，而且不容易被泛素化正常降解，并且發(fā)生再循環(huán)，因而延長了生長信號。當配體與受體結合后即可觸發(fā)內吞作用，泛素化連接酶Cbl在觸發(fā)受體介導的內吞作用中起重要作用，有研究報道最終歸于溶酶體降解途徑[12]。但是，也有研究報道EGFR與配體相結合后可以同時發(fā)生內化和泛素化，即也可以同時通過泛素-蛋白酶體途徑降解。USP9X能夠通過去泛素化多個內吞E3連接酶來調控蛋白質轉運。E3連接酶Itch通過促進細胞內吞蛋白和Cbl(E3連接酶)的蛋白酶體降解來拮抗活化的EGFR向溶酶體的內化和運輸[13～15]。

結合本實驗結果，USP9X和EGFR的表達水平與乳腺癌的臨床分期、組織學分級、淋巴結轉移密切相關，并且兩者在統(tǒng)計學上呈正相關性；兩者不僅各自在一定程度上參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展及預后，同時USP9X通過去泛素化多個內吞E3連接酶促進在觸發(fā)受體介導的內吞作用的Cbl在蛋白酶體的降解，最終使EGFR不能通過溶酶體途徑降解；同時也推斷USP9X具有直接去泛素化EGFR的作用，使其不被泛素—蛋白酶體途徑降解；最終增強信號傳導，延長信號傳導時間。結合研究報道并且推斷，兩者的高表達及相關性有可能是三陰性乳腺癌化療耐藥的潛在機制。最終得出結論：USP9X和EGFR與乳腺癌的發(fā)生、進展、治療及預后相關，為乳腺癌的研究提供新的方向。