局部應(yīng)用脂源性間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)瘺管的愈合的相關(guān)動(dòng)物研究 ①

朱曉文，倪 健，鄒玉梅，陳福軍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外四科， 黑龍江 佳木斯 154003)

肛瘺是一種慢性疾病，需要手術(shù)治療。如果同時(shí)伴有克羅恩病(CD)[1]，則治療更為困難和延長。保守治療的有效率低于40%，瘺管通常不會(huì)完全愈合。保守治療與手術(shù)治療相結(jié)合已被證實(shí)療效提高約40%～60%。最近相關(guān)研究報(bào)道，使用局部應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可能成為一種新的、更有效治療方法[2]。MSCs的特點(diǎn)是快速擴(kuò)張、多效性、免疫調(diào)節(jié)作用以及通過刺激局部修復(fù)過程和血管生成來支持愈合。最近的幾項(xiàng)研究評估了MSCs在克羅恩病(CD)患者小群體中應(yīng)用的效果。使用脂肪源干細(xì)胞(ADSCs)以及與骨髓分離的同種異體細(xì)胞。在干預(yù)后，治愈率在第24周達(dá)到85%。然而，在隨訪數(shù)年之后，只有37%～58%的患者出現(xiàn)了長期的影響[4,5]。在第一個(gè)大的多中心隨機(jī)試驗(yàn)(212例患者)中，短期內(nèi)在完成了ADSCs的異體應(yīng)用后46%的患者中病情得以緩解[7]。治療的臨床效果不僅受到肛周區(qū)域的局部檢查的影響，還受到臨近疾病活動(dòng)和保守治療反應(yīng)的影響[8,9]。

生物發(fā)光(BLI)成像技術(shù)是一種強(qiáng)大的技術(shù)，它允許在接受者的身體內(nèi)對移植的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)的非侵入性追蹤?；|(zhì)的管理(D -熒光素)在供體細(xì)胞中引發(fā)酶反應(yīng)，導(dǎo)致光子的發(fā)射。考慮到這種反應(yīng)只能發(fā)生在有活力的細(xì)胞中，故BLI可以識(shí)別出細(xì)胞的分布和數(shù)量[11]。這項(xiàng)研究的目的是評估ADSCs在動(dòng)物模型上應(yīng)用ADSCs對瘺管愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

32只250～350g的Lewis雄性大鼠。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前至少2周都在動(dòng)物中心的目標(biāo)設(shè)施的上進(jìn)行了馴化。在研究過程中，維持了12h的陽光和黑暗循環(huán)，并提供了大量的食物和液體。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物被安樂死，注射了致命劑量的硫噴妥鈉。

所有的實(shí)驗(yàn)都是在佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院所認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)工作場所進(jìn)行的，經(jīng)過倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并根據(jù)關(guān)于動(dòng)物使用的指導(dǎo)方針進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 瘺的模型建立

32只大鼠均于計(jì)劃干預(yù)前4周建立瘺管模型。用布爾特曼等方法描述了一種改進(jìn)的結(jié)腸造瘺術(shù)[10]。動(dòng)物通過肌內(nèi)注射鹽酸替利他胺，佐拉西泮和甲苯噻嗪混合麻醉藥物，用5mL的佐拉西泮+ 7mL的甲苯噻嗪和生理鹽水(8mL)在手術(shù)前30min用0.1mL/200g動(dòng)物體重的比例使用。在背部固定后，做了一個(gè)2～2.5cm的剖腹手術(shù)。盲腸區(qū)依次切開皮膚、筋膜和肌層進(jìn)入腹腔。通過皮下隧道從腹腔鏡下模擬瘺道暴露出盲腸。然后，打開腸壁，在它的邊緣固定有4個(gè)0的縫線直到皮膚。在這一端模擬了一個(gè)外部開口。在止血處理后，剖腹手術(shù)的所有層次都依次縫合關(guān)閉，動(dòng)物被放置在生物室。在隨機(jī)化之前，所有的瘺管都經(jīng)過證實(shí)有糞便分泌和探針檢查，可以自由地通過瘺道。此外，對前3只大鼠進(jìn)行了瘺管造影，以驗(yàn)證該技術(shù)的準(zhǔn)確性。

1.2.2 ADSCs的隔離和培養(yǎng)

自交供體Lewis大鼠脂肪組織中表達(dá)熒光素酶基因。采集腹股溝脂肪墊(0.5 1cm3)，同時(shí)使用2%異氟醚短時(shí)間吸入麻醉(異氟醚)。隨后將其切成小塊，在添加10%牛血清的H-MEM中消化一整夜，溶解于0.05%或0.1%的膠原酶溶液中。在5mL移液管中反復(fù)移液分離組織，用培養(yǎng)基稀釋懸浮液，800G離心8min。丟棄上清；將含有細(xì)胞的托盤接種到25cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基(含所有非必需氨基酸的H-MEM；2.5ng/mL表皮生長因子；0.12g/L丙酮酸鈉；1g/L nahco3；1g/L谷氨酰胺；10%牛血清；1%胎牛血清，200U/mL青霉素和100lg/mL鏈霉素)，在3.5%的CO2孵育箱中，設(shè)定溫度為37℃。培養(yǎng)基每2、3天更換一次。臺(tái)盼藍(lán)染色后，在B urker室檢測細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力。

1.2.3 分組、ADSCs治療及療效評估

瘺驗(yàn)證后，使用2%的異氟醚吸入性麻醉后，這些動(dòng)物隨機(jī)分組。治療組(A組)和對照組(B組)。A組(n=16), 2mL濃度為2×106細(xì)胞/mL的ADSCs懸液注入在瘺口周圍。B組(n=16),適量的鹽水(安慰劑)注入同一區(qū)域。然后將動(dòng)物放回容器中。

使用已建立的瘺管引流評估方法，在使用ADSCs后的第7、14、30天在同一短麻醉下內(nèi)對瘺管治療進(jìn)行評估。在輕度受壓后的外開口出現(xiàn)膿性或糞便樣分泌物，瘺管則被認(rèn)為是開放的[12]。此外，還使用了一個(gè)2mm的探針來驗(yàn)證整個(gè)瘺道是否閉合。

監(jiān)測ADSCs的可行性和分布情況情況則在第2、7、14和30天進(jìn)行。首先，用150mg/kg D-熒光素溶液給動(dòng)物注射。然后，老鼠被放置在攝像機(jī)的房間里-IVIS Lumina XR，在2min的曝光中檢測了酶反應(yīng)釋放的光子數(shù)量。隨后，BLI被量化到瘺管周圍的固定興趣區(qū)域。在一個(gè)直徑2.5cm的圓內(nèi)，以每秒每平方厘米每立體視界的光子數(shù)p(s·cm2·sr)使用生活圖像軟件(PerkinElmer)分析。在與BLI強(qiáng)度相關(guān)的基礎(chǔ)上，評估了可行ADSCs的相對含量。應(yīng)用程序后立即測量的信號(hào)作為參考(100%)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，檢測數(shù)據(jù)，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)方法，資料服從正態(tài)性和方差齊性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療效果分析

在A組或B組中使用ADSCs或安慰劑后無并發(fā)癥或不良反應(yīng)，無任何動(dòng)物死亡。這些動(dòng)物茁壯成長并獲得足夠的重量。干預(yù)后7天，A組5例(31%)瘺管和B組1例(6.3%)瘺管關(guān)閉。另有1只A組大鼠在第2周內(nèi)痊愈。干預(yù)后第30天, A組和B組分別有6只(38%)和1只(6.3%)大鼠瘺管被關(guān)閉,分別(P=0.033)。見圖1。

圖1 給藥后瘺管愈合的大鼠數(shù)量情況

2.2 BLI(熒光輻射強(qiáng)度)及干細(xì)胞存活比率變化

在應(yīng)用ADSCs后，BLI的高活性只被記錄在周圍區(qū)域。這種信號(hào)在動(dòng)物身體的任何其他部位都無法檢測到。A組的BLI值在植入后立即達(dá)到最高—31.2×104(6.09～111×104)p(s·cm2·sr)。信號(hào)強(qiáng)度下降最快的是在前兩天，數(shù)值下降了50.2%。在第30天，輻射強(qiáng)度為2.77×104(0.156～16.9×104)，代表其原始值的8.87%。見表1。B組BLI的水平在整個(gè)期間為零。比較A組大鼠愈合樣本和未愈合瘺管樣本之間的值，在A組中，從第7天開始，成功治療的動(dòng)物中BLI的趨勢逐漸升高。這一差異在第30天有顯著差異，分別為8.23×104(1.18～16.9×104)和1.74×104(0.156～6.88×104)p(s·cm2·sr)，分別為17.1%和5.54%(P=0.0393),見表2。

表1 A組大鼠(16只)隨訪期間BLI(熒光輻射強(qiáng)度)及干細(xì)胞存活比率變化

表2 A組大鼠隨訪期間愈合樣本(6只)與未愈合樣本(10只)間BLI(熒光輻射強(qiáng)度)及干細(xì)胞存活比率變化比較

3 討論

盡管目前進(jìn)行了聯(lián)合手術(shù)和保守藥物聯(lián)合治療的方法，但克羅恩病(CD)的肛周瘺管仍然是一種嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的破壞性疾病。有幾項(xiàng)研究報(bào)道了局部治療MSCs的療效。然而，發(fā)表的臨床結(jié)果具有很高的可變性，主要是由非隨機(jī)試驗(yàn)的小群體。因此，作者決定在實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證這種方法的可能性。

應(yīng)用ADSCs導(dǎo)致愈合率要明顯高于安慰劑(38%vs6.3%,P=0.033)。在僅有的一項(xiàng)類似的實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)了局部治療ADSCs的療效。它的主要目的不是治療瘺管病，而是減少腸經(jīng)皮瘺和改良的無瘺道的簡單盲腸造瘺的區(qū)域。在我們的研究中，在干預(yù)組中有38%的動(dòng)物被觀察到完全愈合。與臨床試驗(yàn)相比，這一成功率較低。然而，大多數(shù)試驗(yàn)都使用聯(lián)合治療報(bào)告結(jié)果。在局部應(yīng)用MSCs之前，可先切除或切除瘺道，或最終縫合內(nèi)部開口。最大的多中心隨機(jī)試驗(yàn)的初步結(jié)果(212例乳糜瀉患者)報(bào)告了異基因ADSC管理與第24周的安慰劑相比對瘺愈合的顯著影響49.5%。所有患者均繼續(xù)服用藥物，并在治療前進(jìn)行瘺道刮治術(shù)，這本身導(dǎo)致了安慰劑組34.3%的瘺管閉合 。我們的結(jié)果顯示了純細(xì)胞治療對瘺管愈合的真正影響。共使用了4×106個(gè)細(xì)胞(2mL懸浮)。在最初的人體試驗(yàn)中也使用了類似的劑量[3]。在先前提到的經(jīng)皮瘺大鼠的實(shí)驗(yàn)研究中，使用相同數(shù)量的細(xì)胞。高劑量不會(huì)導(dǎo)致更好的效果，這在國外的基礎(chǔ)試驗(yàn)中已經(jīng)被證實(shí)描述[6]。 使用了周圍的腹股溝脂肪組織作為MSCs的來源。然而，一些已發(fā)表的人體試驗(yàn)選擇了從骨髓中分離出來的細(xì)胞。骨髓源異基因細(xì)胞的優(yōu)勢在于，當(dāng)與年輕的健康捐贈(zèng)者分離時(shí)，可能會(huì)有冷凍保存和更高的再生和免疫調(diào)節(jié)的可能性。另一方面，皮下脂肪組織是MSCs的一種容易且不易侵入的來源。事實(shí)上，ADSCs保留了它們的多線性發(fā)育可塑性，根據(jù)一些研究，與從骨髓中分離出來的細(xì)胞相比，它們在免疫表型上的異質(zhì)性更小[13]。

由于光發(fā)射強(qiáng)度和活細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性，BLI技術(shù)提供了一種非侵入性的植入ADSCs體外監(jiān)測的可能性。在我們的研究中，BLI的動(dòng)力學(xué)顯示了在細(xì)胞質(zhì)量在前2d損失最大，約下降了一半。隨后，還原率趨于減慢，14和30d后，可檢測的細(xì)胞分別占其初始量的21%和8.87%。在對大鼠骨盆底損傷治療的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢。在前7d之后，只有1/4的應(yīng)用細(xì)胞在現(xiàn)場被檢測到。一個(gè)月后達(dá)到穩(wěn)定的細(xì)胞量，在隨訪2個(gè)月后仍維持在3%。這種快速減少的細(xì)胞質(zhì)量可能是由于在發(fā)炎的周圍組織中缺乏基質(zhì)或免疫反應(yīng)。

BLI信號(hào)只在應(yīng)用區(qū)域中檢測到，而細(xì)胞沒有遷移到其他區(qū)域或器官。一個(gè)可能的原因可能是ADSCs被由炎癥的周圍空間組織釋放的趨化因子所吸引。在我們的研究中，干預(yù)組A組的BLI和未愈合的動(dòng)物表現(xiàn)出在第一周內(nèi)具有較大變異性的可存活細(xì)胞的可比性降低。然而，從第14天開始，當(dāng)閉合和打開瘺管的數(shù)量穩(wěn)定后，在已愈合的大鼠中，BLI的值更高。這一差異在第30天具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果表明ADSCs分化為單個(gè)細(xì)胞株，并在愈合過程中融合，從而解釋了瘺管愈合與存在的相關(guān)性。在第14天的非顯著性差異也可以用少量的實(shí)驗(yàn)對象來解釋(6個(gè)愈合的和10個(gè)未愈合的動(dòng)物)。根據(jù)我們在接種后早期觀察到的快速細(xì)胞減少，可以通過重復(fù)的應(yīng)用來獲得更高數(shù)量的可行的ADSCs。這項(xiàng)措施可以提高治療效果，這應(yīng)該在臨床試驗(yàn)中得到反映和評估。應(yīng)用接種之間的最佳間隔時(shí)間似乎<7d。在相對較短的隨訪中，可能不會(huì)注意到最終的瘺管復(fù)發(fā)。這通常發(fā)生在克羅恩病(CD)患者的炎癥性腸活動(dòng)[5]?？紤]到我們模型中的瘺管是人工造成的，沒有慢性腸炎癥的背景，在最初愈合后，這種復(fù)發(fā)不太可能發(fā)生。關(guān)于術(shù)后并發(fā)癥及其他不良事件，30d的觀察期根據(jù)經(jīng)典定義是可以被接受的。

綜上所述，在動(dòng)物模型中，在瘺管周圍組織局部應(yīng)用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞后，瘺管閉合率明顯高于對照組。