大鯢皮膚水溶性蛋白質(zhì)成分分析及活性鑒定

宋為嘉，楊 輝，王 慧，陳永慶，耿 碩，熊冬梅，楊 菁，李忠虎，王立新*

(1.西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100；2.揚州大學 動物科學與技術(shù)學院，江蘇 揚州 225007；3.三峽工程魚類資源保護湖北省重點實驗室，中國三峽長江三峽集團有限公司中華鱘研究所，湖北 宜昌 443100；4.陜西華鯢生物科技有限公司，陜西 城固723200)

大鯢(Andriasdavidianus)是中國特有的兩棲類動物，屬于兩棲綱有尾目隱鰓鯢科。大鯢體長可達1.5 m，最大體重可超過50 kg，是世界上現(xiàn)存最大的兩棲類[1]。由于環(huán)境污染和過度捕撈，致使野生大鯢數(shù)量急劇下降, 被列為國家二級保護動物, 并列入瀕臨絕種野生動植物國際貿(mào)易公約(CITES) 附錄 Ⅰ 中[2]。大鯢具有極高的食用價值，其肌肉富含水分，肉質(zhì)鮮美，肌肉中總氨基酸含量18.64%，并且其中含有大量必需氨基酸，符合人體需求[3]。從大鯢肌肉提取出的大鯢油中含有2種多不飽和脂肪酸，具有抗氧化活性，能夠提高機體免疫力，對人體具有保健功能[4]。大鯢作為藥材具有悠久的歷史，其藥用價值在《本草綱目》早有記載。大鯢身體多個部分均可入藥，包括皮膚及其分泌的黏液。中醫(yī)認為，大鯢具有生血、明目等功效；現(xiàn)代醫(yī)學認為，食用大鯢可以清除體內(nèi)自由基、減少對機體造成損傷，還能夠促進人體抗癌因子的產(chǎn)生，提高免疫力從而降低癌癥發(fā)生幾率[5]。

大鯢皮膚具有輔助呼吸、調(diào)節(jié)水分、抵御捕食者、抵抗微生物入侵、排泄、生殖等功能，是保護大鯢免受傷害、適應生存環(huán)境的重要器官。大鯢皮膚上的黏液主要由2種腺體分泌。一種是黏液腺，可分泌粘糖蛋白，這是大鯢皮膚黏液主要成分。黏液覆蓋在皮膚表面，形成一層天然的護盾，維持皮膚水平衡，從而保護皮膚不受外界環(huán)境傷害[6]。另一種是顆粒腺，能夠分泌出藥理活性物質(zhì)，抵御微生物和捕食者[7]，被稱作“毒腺”。皮膚黏液有多種作用。有研究表明，腹腔注射大鯢皮膚分泌物能夠使小鼠死亡，低劑量注射黏液到小鼠皮膚也能夠?qū)е滤[和疼痛，說明大鯢皮膚分泌物具有復雜的毒性作用[8]。此外，大鯢皮膚黏液具有抗氧化[9]、促進傷口愈合[10]、保護肝臟免受酒精[11]以及四氯化碳[12]等物質(zhì)的損傷以及抗菌[13]、抑制癌癥[14]等功能。此外，大鯢皮膚具有抗氧化、促進傷口愈合、保護肝臟免受酒精和四氯化碳等物質(zhì)損傷、抗菌、抑制癌癥等功能。

1 材料與方法

1.1 材料

供試大鯢購自陜西省留壩縣，所有樣本均為人工養(yǎng)殖的大鯢第二代。體重為508.4±10.5 g。試驗大鯢在室內(nèi)水箱中暫養(yǎng)，水箱內(nèi)水面略低于大鯢背部，以保證大鯢可順利浮出水面呼吸；水箱內(nèi)放少量泥鰍供大鯢自由采食；試驗期間定期換水，保持大鯢生存水質(zhì)良好。在采集皮膚黏液樣品期間大鯢身體狀態(tài)良好，體質(zhì)健康，無任何異樣。

1.2 黏液的采集

輕輕取出大鯢置于操作臺上，待大鯢穩(wěn)定下來，用沾濕毛巾或紗布蓋住大鯢頭部。用消毒針管吸75%酒精1 mL，輕輕噴灑于大鯢背部，噴灑2～3次，待大鯢背部皮膚產(chǎn)生白色分泌物并發(fā)出刺激性氣味時，用消毒的移液槍頭輕輕刮取分泌物，然后將槍頭與分泌物一同放到15 mL離心管中，收集的分泌物用滅菌水進行溶解，充分混勻。在4 ℃條件下，12 000 r/min離心15 min，收集上清，保存于-20 ℃。同一只大鯢不宜連續(xù)多次收集分泌物，以防造成損傷。

1.3 黏液樣品水溶性蛋白質(zhì)含量測定

配置1 mg/mL牛血清白蛋白標準溶液，用PBS稀釋至 0、20、40、60、80、100、120 μg/mL。添加5倍體積的考馬斯亮藍蛋白顯色液混合，室溫靜置5 min，檢測595 nm波長處吸光值，重復測量3次，取平均值，建立標準曲線和回歸方程，計算樣品濃度。

1.4 細菌凝集反應

采用大腸桿菌(E.coli)和嗜水氣單胞菌(A.hydrophlia)檢測大鯢皮膚黏液蛋白細菌凝集活性。37 ℃條件下培養(yǎng)大腸桿菌、嗜水氣單胞菌至對數(shù)生長期。6 000 r/min離心保留沉淀，使用無菌PBS稀釋細菌至3×107CFU/mL。將細菌與終濃度為150 μg/mL的樣品混合均勻涂布到無抗固體培養(yǎng)基中。對照組添加等體積PBS緩沖液。培養(yǎng)6 h后使用光學顯微鏡觀察細菌凝集情況。

1.5 大鯢皮膚黏液水溶性蛋白質(zhì)樣品抗氧化活性檢測

1.5.1 DPPH清除能力檢測 將1 mL濃度為1 mmol/L的DPPH與不同濃度的樣品混合，加入蒸餾水定容至5 mL，使樣品終濃度分別為10、50、100、200和400 μg/mL。在室溫下靜置30 min后，測定其在515 nm下的吸光值。添加等體積的PBS作為對照組。并使用公式(1-試驗組/對照組)×100%計算DPPH清除率。

1.5.2 ABTS清除能力檢測 準確稱取0.384 g ABTS與0.134 g過硫酸鉀于試管中，加入蒸餾水,定容至100 mL。輕輕搖晃混勻，在避光處放置過夜。取10 mL該溶液，用分光光度計測量其在734 nm下的吸光值，加入蒸餾水進行稀釋，將其稀釋為吸光值為0.7左右的溶液，記為A。取0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL濃度為400μg/mL的大鯢皮膚分泌蛋白溶液樣品，加入3 mL溶液A，加入蒸餾水定容至10 mL。室溫靜置15 min后，用分光光度計測定在734 nm下的吸光值。添加等體積PBS作為對照組。大鯢皮膚黏液蛋白對ABTS的清除率計算方式為(1-試驗組/對照組)×100%。

1.5.3 NO清除能力檢測 準確稱取0.2980 g SNP溶于純水中并定容至10 mL。量取1 mL SNP溶液，分別加入0.5、1、2、4 mL濃度為400 μg/mL的大鯢皮膚黏液蛋白樣品溶液，加入蒸餾水定容至5 mL，在25 ℃水浴鍋中保溫2.5 h，取出后立即加入等體積的Griess試劑，在540 nm下測定吸光值。添加等體積的PBS作為對照組。最終計算的清除率=[(A-B) /C-1]×100%。其中，A為SNP與樣品共存時的吸光值，B為樣品在540 nm下的吸光度，C為SNP在540 nm下的吸光值。

1.6 蛋白質(zhì)譜分析

將大鯢黏液水溶性蛋白質(zhì)樣品送至北京邦菲科技有限公司進行質(zhì)譜鑒定。使用Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫對基因的分子功能(Molecular Function, MF)、以及參與的生物過程(Biological Process, BP)進行鑒定和分析。隨后使用KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫進行分析確定蛋白質(zhì)參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE電泳結(jié)果

電泳結(jié)果顯示大鯢皮膚黏液樣品中含有多種蛋白質(zhì)，樣品在14～100 kDa分子量范圍內(nèi)得到一定的分離，其中在50 kDa分子量以上蛋白條帶較為豐富，100 kDa分子量以上有可見的較高豐度的蛋白條帶，小于14 kDa的蛋白質(zhì)含量較低(圖1)。

圖1 大鯢皮膚黏液樣品SDS-PAGE電泳結(jié)果M. Blue Plus Protein Marker(14 kDa-100 kDa);1. 大鯢皮膚黏液樣品Fig. 1 SDS-PAGE results of skin mucus samplesfrom Chinese giant salamanderM. Blue Plus Protein Marker(14 kDa-100 kDa);1. skin mucus samples of Chinese giant salamander

2.2 大鯢皮膚黏液水溶性蛋白質(zhì)樣品活性檢測

2.2.1 細菌凝集試驗結(jié)果 試驗結(jié)果表明，與對照組相比，大腸桿菌和嗜水氣單胞菌在大鯢皮膚黏液水溶性蛋白質(zhì)作用下發(fā)生明顯的凝集反應(圖2)，表明大鯢皮膚黏液水溶性蛋白質(zhì)對大腸桿菌及嗜水氣單胞菌具有抑制作用。

圖2 細菌凝集試驗結(jié)果Fig.2 Results of bacterial agglutination experiment between samples and control group

2.2.2 對NO、DPPH和ABTS清除結(jié)果 大鯢皮膚黏液水溶性蛋白質(zhì)對NO、DPPH和ABTS清除結(jié)果見圖3。大鯢皮膚黏液蛋白質(zhì)對DPPH與ABTS具有較強的清除能力，且清除率隨大鯢皮膚黏液蛋白質(zhì)的濃度升高顯著升高，到濃度增加到200 μg/mL后，清除率升高趨于平緩，到400 μg/mL其清除率已經(jīng)接近100%；樣品對NO也有一定的清除能力，但效果并不理想，當?shù)鞍踪|(zhì)濃度為400 μg/mL時清除率接近40%，并且濃度進一步升高清除率卻沒有顯著變化。

圖3 大鯢皮膚黏液水溶性蛋白質(zhì)對NO、DPPH、ABTS的清除效果Fig. 3 The NO, DPPH and ABTS scavenging activity

2.3 蛋白質(zhì)譜結(jié)果

大鯢皮膚黏液水溶性蛋白質(zhì)經(jīng)Q-Exacitve HF質(zhì)譜儀分析，共鑒定出66種蛋白質(zhì)，其中分子量最大的是蜷曲受體-8相關(guān)多區(qū)域蛋白(Frizzled-8)，達277.5 kDa，分子量最小的是動力蛋白輕鏈(Dynein light chain)，分子量僅10.3 kDa(表1)。以上蛋白經(jīng)GO功能鑒定，共發(fā)現(xiàn)20種免疫相關(guān)蛋白，包括熱休克蛋白70、硒結(jié)合蛋白、泛素、鈣調(diào)蛋白、泛素結(jié)合酶、鈣結(jié)合蛋白、小泛素化改性劑、Rab(Ras-like in rat barin)蛋白、泛素結(jié)合酶E2、泛素碳末端水解酶、ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor, ARF)、金屬蛋白酶抑制劑2、NEDD8-泛素綴合酶、GTP(三磷酸鳥苷)-結(jié)合蛋白、泛素綴合酶、白介素增強子結(jié)合因子、蜷曲受體-8相關(guān)多區(qū)域蛋白 Frizzled-8、鈣依賴膜結(jié)合蛋白、Rab GDPα分離抑制劑，占蛋白總數(shù)的30.3%；以及2種抗氧化相關(guān)蛋白，包括過氧化氫酶和過氧化物酶2等，占蛋白總數(shù)的3.03%。

表1 大鯢皮膚黏液蛋白鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of skin mucous water-soluble protein

(續(xù)表1)

以上蛋白經(jīng)蛋白GO Biological Progress注釋，發(fā)現(xiàn)66種蛋白參與30種生物學過程。其中參與糖酵解和小GTP酶介導信號轉(zhuǎn)導的蛋白最多，分別占總蛋白的15.91%和9.09%(表2)。KEGG 注釋結(jié)果顯示，66種蛋白主要參與30種生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑，其中主要包括氨基酸的生物合成(9.9%)、糖酵解(9.9%)、碳代謝(8.9%)、泛素介導的蛋白水解(7.9%)。

表2 大鯢皮膚黏液水溶性蛋白參與的生物學過程Table 2 Biological process of skin mucous water-soluble protein %

3 討 論

3.1 大鯢皮膚黏液水溶性蛋白的免疫功能

許多魚類及兩棲類皮膚具有一種非特異免疫系統(tǒng)，能夠抵御外來病原體的入侵，并且具有一定的廣譜性，可以對很多病原體起到抑制或殺滅的作用。大鯢皮膚是抵抗外源入侵的第一道防線，在抵抗病原體入侵中發(fā)揮重要功能[15]。大鯢皮膚中含有大量的活性物質(zhì)，包括生物胺、生物堿、類固醇、蛋白質(zhì)和多肽等[16]，這些物質(zhì)在皮膚功能發(fā)揮上扮演著重要角色，是寶貴的生物資源。

本試驗發(fā)現(xiàn)大鯢皮膚黏液水溶性蛋白能夠凝集大腸桿菌和嗜水氣單胞菌，可能具有抗菌功能。在大鯢皮膚水溶性蛋白的質(zhì)譜結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了20種免疫相關(guān)蛋白，很可能與大鯢皮膚抵御病原微生物入侵的功能有關(guān)。這些蛋白包含有很多泛素化相關(guān)蛋白，包括泛素、泛素結(jié)合酶、泛素碳末端水解酶、NEDD8-泛素綴合酶、泛素綴合酶等。蛋白泛素化是由泛素激活酶、泛素活化酶和泛素連接酶3種酶通過活化、結(jié)合和連接3步級聯(lián)反應對靶蛋白進行修飾進而降解靶蛋白的過程[17]。有研究顯示，當機體受到細菌等病原體侵襲時，泛素可以通過介導促凋亡蛋白Bcl-2的降解從而抑制巨噬細胞的凋亡，進而維持機體的免疫應答[18]，巨噬細胞會釋放泛素連接酶激活下游NF-κB信號通路促進炎癥因子的表達，從而清除病原微生物[19]。大鯢皮膚黏液中也有多種與小GTP酶信號轉(zhuǎn)導相關(guān)蛋白，包括Rab蛋白、ADP核糖基化因、GTP-結(jié)合蛋白、Rab GDPα分離抑制劑。小GTP酶包括Ras (Rat sarcoma viral oncogene homology)、Rho (Ras homolog gene family)、Arf、Ran(a small nuclear GTP-binding protein)和Rab等五個家族，參與調(diào)節(jié)細胞和細胞-基質(zhì)的相互作用、調(diào)節(jié)動態(tài)肌動蛋白重排、細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運等多種功能[20]。中性粒細胞作為先天免疫系統(tǒng)的一部分，是抵御病原體的第一道防線[21]，多種小GTP酶能夠調(diào)節(jié)其粘附、傳播、極化、趨化、富集、吞噬以及自噬[20]等多種功能。有研究表明，Rab27蛋白使中性粒細胞快速向感染處富集，釋放炎癥因子殺死病原微生物[22]，Rab5能夠調(diào)節(jié)中性粒細胞的吞噬活性清除入侵的細菌[23]。除此之外，熱休克蛋白在誘導先天免疫和適應性免疫都發(fā)揮著重要作用[24-25]。硒結(jié)合蛋白與口臭、癌癥和精神分裂癥的疾病有關(guān)[26]，鈣結(jié)合蛋白與腫瘤細胞遷移[27]、血管生成以及炎癥[28]有關(guān)。

3.2 大鯢皮膚黏液水溶性蛋白的抗氧化性能

大鯢皮膚黏液水溶性蛋白表現(xiàn)出顯著的氧化物的清除能力。本研究發(fā)現(xiàn)大鯢皮膚黏液分泌蛋白對DPPH、NO、ABTS等物質(zhì)具有較好的清除效果，說明其具有良好的抗氧化作用。根據(jù)蛋白質(zhì)譜結(jié)果，抗氧化性很可能是由過氧化氫酶和過氧化物酶2發(fā)揮的。除了這2種抗氧化酶，大鯢皮膚黏液水溶性蛋白中可能還有其它的抗氧化物質(zhì)，例如HSP70能夠抑制氧化后的蛋白積累并促進氧化蛋白質(zhì)的降解[29]以減少機體氧化損傷。有研究表明大鯢皮膚炮制酒能夠提高谷胱甘肽的含量及SOD活性，從而提升機體抗氧化能力，降低過度飲酒引起的氧化應激反應[30]。從不同育齡大鯢的皮膚黏液中提取出的低聚糖肽也具有良好的抗氧化性，對羥自由基和DPPH具有較高的清除率[31]?？寡趸钚晕镔|(zhì)去除的自由基等氧化物是機體代謝過程中產(chǎn)生的[32]，此外當機體收到病原體感染發(fā)生炎癥時，也會產(chǎn)生自由基[21]，這些自由基會對機體正常組織造成損傷，延緩組織愈合。大鯢皮膚黏液中的抗氧化物質(zhì)能夠清除這些自由基，這可能對大鯢傷口愈合和機體代謝有著重要作用。例如在紅瘰疣螈皮膚中發(fā)現(xiàn)一種短肽能夠促進傷口的愈合[33]，涂抹大鯢皮膚制作的藥膏能夠促進小鼠背部燒傷愈合[10]，這些都說明兩棲類有尾目的黏液能夠促進傷口愈合，而這些很可能與皮膚中的抗氧化活性物質(zhì)有關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗發(fā)現(xiàn)大鯢皮膚黏液水溶液中含有66種水溶性蛋白，其中20種蛋白與免疫抗病功能相關(guān)，2種蛋白與抗氧化活性相關(guān)，參與免疫和代謝在內(nèi)的多種生理過程，并且具有明顯的抗菌活性和抗氧化活性。