黑曲霉固體發(fā)酵黃芪工藝及其在蛋雞上的應(yīng)用研究

宋予震，史洪濤，范明夏，盧建洲，邊傳周，喬宏興

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

中藥作為飼料添加劑在畜牧業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛，但因細(xì)胞壁的阻礙導(dǎo)致部分有效成分不能被動物吸收利用。黑曲霉(Aspergillusniger)是一種產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶等酶的真菌，纖維素酶能夠分解植物細(xì)胞壁，充分釋放營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)動物消化吸收[1]。張帥等[2]將16 g橘皮添加到黑曲霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量15%，發(fā)酵時間60 h，纖維素酶活力達(dá)1 816 U/g；胡偉等[3]采用正交試驗研究黑曲霉固體發(fā)酵三七殘渣產(chǎn)淀粉酶，結(jié)果顯示淀粉酶活力約為84 U/g。利用黑曲霉對中藥進(jìn)行發(fā)酵能夠提高中藥藥效，改善動物腸道健康，從而提高生產(chǎn)性能。Sun等[4]研究證明，用黑曲霉發(fā)酵銀杏葉可改善蛋雞的生長性能、蛋品質(zhì)、脂質(zhì)代謝和免疫力。黑曲霉在固體發(fā)酵研究中也存在一些問題，如理論研究上缺乏動力學(xué)支持導(dǎo)致生產(chǎn)上停留在經(jīng)驗化生產(chǎn)水平。此外，黑曲霉為需氧型真菌，在固體發(fā)酵過程中存在參數(shù)不易檢測、無菌操作難以實現(xiàn)、過程不易控制、勞動強(qiáng)度大等問題。本研究通過對黑曲霉固體發(fā)酵黃芪產(chǎn)酶特性進(jìn)行條件優(yōu)化，并研究其在蛋雞上的應(yīng)用情況，旨在為新型酶制劑的開發(fā)提供數(shù)據(jù)參考，同時為黃芪的綜合利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃芪飲片購于河南省禹州市中藥材專業(yè)市場；黑曲霉菌(保藏編號3.316)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 黑曲霉固體發(fā)酵黃芪條件優(yōu)化

1.2.1 菌種活化及麩曲種子制備 用接種環(huán)挑取黑曲霉菌種，接種到PDA斜面培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g, 蒸餾水1 000 mL)上，于28 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。待孢子長滿后，采用同樣的方法將活化后的黑曲霉孢子接入麩曲培養(yǎng)基(市售麩皮:蒸餾水=2:1，拌勻后高壓滅菌備用)，于28 ℃培養(yǎng)8～10 d，麩曲菌種接種前將黑曲霉孢子用無菌水稀釋成1×108cfu/mL的孢子懸液備用。

1.2.2 黑曲霉發(fā)酵黃芪培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.2.1 接種量 以0.1%、0.5%、1%、3%、5%(W/W)的麩曲菌種接種量分別接種于含水量為35%(V/W)已滅菌的黃芪固體粉末中，28 ℃培養(yǎng)9 d。

1.2.2.2 時間 以1%(W/W)的麩曲菌種接種量接種于含水量為35%(V/W)已滅菌的黃芪固體粉末中，28 ℃分別培養(yǎng)0、3、6、9、12 d。

1.2.2.3 含水量 制備含水量為25%、30%、35%、40%、45%、50%(V/W)的黃芪固體粉末。以1%(W/W)的麩曲菌種接種量接種于已滅菌的不同含水量的黃芪固體粉末中，28 ℃培養(yǎng)9 d。

1.2.2.4 溫度 以1%(W/W)的麩曲菌種接種量接種于含水量為35%(V/W)已滅菌的黃芪固體粉末中，20、24、28、32、37 ℃分別培養(yǎng)9 d。

1.2.2.5 正交試驗優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果及正交試驗設(shè)計原則，選取溫度(A)、接種量(B)、含水量(C)3個因素，通過3因素3水平(L9(34))進(jìn)行正交試驗，見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factor level

1.2.3 發(fā)酵過程 將黃芪粉培養(yǎng)基置于1 000 mL三角瓶中，瓶口覆蓋過濾透氣封口膜，高壓滅菌后在無菌操作臺中進(jìn)行接種，然后置于霉菌培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每天晃動培養(yǎng)基防止結(jié)塊。

1.3 酶活力及黃芪多糖檢測方法

1.3.1 黃芪固體發(fā)酵物纖維素酶活力測定 采用羧甲基纖維素酶法測定纖維素酶活力[5]，在一定條件下，將1 g固體樣品每分鐘催化纖維素水解生成葡萄糖的微克數(shù)定義為1個酶活力單位，以固體樣品所含的酶活力單位(U/g)表示。

1.3.2 黃芪固體發(fā)酵物淀粉酶活力測定 淀粉酶活力測定參考食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.3.3 黃芪固體發(fā)酵物黃芪多糖提取測定 多糖含量的測定用苯酚硫酸法[7]。

1.4 動物試驗及試驗日糧

試驗采用單因子試驗設(shè)計，選擇280日齡海蘭褐蛋雞72只，由河南炎黃生物工程有限公司提供，隨機(jī)分為4組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)6只雞，預(yù)飼期3 d，試驗期28 d。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，黃芪組在對照組基礎(chǔ)上添加0.2%的黃芪，黑曲霉組在對照組基礎(chǔ)上添加0.2%的黑曲霉，發(fā)酵黃芪組在對照組基礎(chǔ)上添加0.2%的黑曲霉發(fā)酵黃芪，發(fā)酵制劑于37 ℃干燥箱內(nèi)烘干至恒重后添加到蛋雞日糧中，孢子數(shù)≥1×108cfu/g，添加量以日糧的質(zhì)量百分比計算?；A(chǔ)日糧參考NRC (1994)[8]蛋禽營養(yǎng)需要量配制, 詳細(xì)配方組成和營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)成分Table 2 Basic diet composition and nutritional composition

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 生產(chǎn)性能測定 試驗期間，每天以重復(fù)為單位記錄產(chǎn)蛋數(shù)(截止每天21:00)、總蛋重，計算1～14 d、15～28 d的產(chǎn)蛋率和料蛋比。

1.5.2 血清抗氧化指標(biāo)測定 試驗第14、28天，每個重復(fù)隨機(jī)選1只雞進(jìn)行心臟采血5 mL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置分層，分離血清，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｓ肊LISA檢測試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)檢測血清中過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。利用SPSS 24.0軟件按3因子3水平(3×3)有重復(fù)程序?qū)φ辉囼灨黜棓?shù)據(jù)進(jìn)行K值分析，確定最優(yōu)組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉酶活力檢測結(jié)果

淀粉酶活力檢測結(jié)果如圖 1a所示。淀粉酶活力隨黑曲霉接種量增加逐漸升高，在接種量為1%時酶活力達(dá)到最大值，為0.96 U/g(圖1)；淀粉酶活力隨黃芪含水量的升高逐漸升高，在含水量達(dá)45%時酶活力達(dá)到最大值0.99 U/g，之后逐漸下降(圖1b)；淀粉酶活力隨發(fā)酵溫度升高逐漸升高，當(dāng)溫度達(dá)28 ℃時達(dá)到最大值0.95 U/g，之后緩慢下降(圖1c)；隨發(fā)酵時間的增加淀粉酶活力逐漸升高，第9天達(dá)到最大值，為0.93 U/g，之后逐漸下降并趨于穩(wěn)定(圖1d)。

圖1 不同發(fā)酵條件對淀粉酶活力的影響Fig.1 Effect of different fermentation conditions on amylase activity

2.2 纖維素酶活力檢測結(jié)果

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 利用DNS法[9]進(jìn)行還原糖含量的測定，并以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，540 nm條件下的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得葡萄糖的濃度和吸光度的關(guān)系。回歸方程為Y=1.3511x-0.0676、R2=0.9997，葡萄糖濃度在0.1～0.7 mg/mL 間具有良好的線性關(guān)系(圖2)。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of glucose

2.2.2 不同發(fā)酵條件對纖維素酶活力的影響 纖維素酶變化規(guī)律如圖3所示。纖維素酶活力隨接種量的增加逐漸升高，在接種量為1%時達(dá)到最大值51.33 U/g，之后逐漸下降(圖3a)；纖維素酶活力隨黃芪含水量升高緩慢升高，當(dāng)接種量達(dá)45%時達(dá)到最大值71.00 U/g，之后趨于下降(圖3b)；隨發(fā)酵溫度升高纖維素酶活力呈現(xiàn)先升高后下降再逐漸升高的趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到37 ℃時酶活力最高為73.33 U/g(圖3c)；纖維素酶活力隨著發(fā)酵時間增加逐漸升高，在第9天達(dá)到最大值60.67 U/g，之后趨于穩(wěn)定(圖3d)。

圖3 不同發(fā)酵條件對纖維素酶活力的影響Fig.3 Effect of different fermentation conditions on cellulase activity

2.3 多糖含量檢測結(jié)果

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)苯酚硫酸法[10]進(jìn)行多糖含量的測定，并以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，490 nm吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得葡萄糖濃度與吸光度的關(guān)系?；貧w方程為Y=13.076x-0.0004、R2=0.9996，葡萄糖濃度在0～0.5 mg/mL 間具有良好的線性關(guān)系(圖4)。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of glucose

2.3.2 不同發(fā)酵條件對多糖得率的影響 黃芪多糖得率測定結(jié)果如圖5所示。隨接種量增加多糖得率呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在接種量為1 %時多糖得率最低，為4.12%(圖5a)；多糖得率隨黃芪含水量升高逐漸降低，當(dāng)接種量為40%時多糖得率最低，為3.10%，之后隨含水量增加緩慢上升(圖5b)；多糖得率隨發(fā)酵溫度升高而降低，當(dāng)溫度達(dá)到28 ℃時多糖得率最低，為4.62%，之后逐漸趨于穩(wěn)定(圖5c)；多糖得率隨發(fā)酵時間延長呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢，第9天最低，為4.57%(圖5d)。

圖5 不同發(fā)酵條件對多糖得率的影響Fig.5 Effect of different fermentation conditions on polysaccharide yield

2.4 正交工藝優(yōu)化

通過正交試驗優(yōu)化發(fā)酵過程中的溫度、接種量、含水量等條件對纖維素酶活力的影響，結(jié)果如表3顯示，通過R值選擇各因素對纖維素酶活力的影響效果為溫度>接種量>含水量，考慮到黑曲霉發(fā)酵黃芪中纖維素酶活力指標(biāo)的重要性，確定其最佳工藝為A3B2C2，即溫度37 ℃，接種量1%，含水量45%時為最佳發(fā)酵條件。通過試驗驗證，在該條件下，纖維素酶活力可達(dá)82.26 U/g。

表3 纖維素酶活力正交試驗直觀分析表Table 3 Visual analysis of orthogonal test for cellulase activity

2.5 蛋雞的生產(chǎn)性能及血清抗氧化指標(biāo)

2.5.1 不同處理對蛋雞生產(chǎn)性能的影響 如表4所示，1～14 d各組間的產(chǎn)蛋率和料蛋比差異不顯著(P>0.05);15～28 d發(fā)酵黃芪組產(chǎn)蛋率最高，與對照組、黃芪組、黑曲霉組相比分別提高了18.79%、9.21%、12.85%，差異顯著(P<0.05);黃芪組與對照組相比提高了8.77%，差異顯著(P<0.05)。同時，發(fā)酵黃芪組料蛋比最低，與對照組、黃芪組、黑曲霉組相比分別降低了19.71%、9.49%、20.62%，差異顯著(P<0.05);黃芪組與對照組、黑曲霉組相比分別降低了9.33%、10.17%，差異顯著(P<0.05)。

表4 不同處理對蛋雞產(chǎn)蛋性能的影響Table 4 Effect of different treatments on laying performance of laying hens

2.5.2 不同處理對蛋雞抗氧化指標(biāo)的影響 如表5所示。在第14 d，發(fā)酵黃芪組CAT 活性最高，與黃芪組差異顯著(P<0.05)；發(fā)酵黃芪組MDA含量最低，與對照組和黑曲霉組相比差異顯著(P<0.05)，但與黃芪組相比差異不顯著(P>0.05)；發(fā)酵黃芪組T-AOC活性高于其他組，差異顯著(P<0.05)。在第28天，發(fā)酵黃芪組CAT、GSH-Px、SOD活性均高于其他組且差異顯著(P<0.05)。

表5 不同處理14 d和28 d對蛋雞抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effect of different treatments on the quality of eggs for 14 days and 28 days

3 討 論

3.1 不同發(fā)酵條件對黑曲霉產(chǎn)酶活力的影響

王曉嬌[11]研究發(fā)現(xiàn)含水量、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等是影響固體發(fā)酵的重要因素。本研究利用這4個條件對黑曲霉固體發(fā)酵黃芪產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶進(jìn)行了單因素優(yōu)化試驗。結(jié)果表明：接種量較低時，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分沒有被充分利用，產(chǎn)酶量較低；接種量過大時黑曲霉生長迅速，黃芪中營養(yǎng)成分供應(yīng)不足，菌體快速生長導(dǎo)致溶氧不足，產(chǎn)生大量熱，使培養(yǎng)基溫度過高，從而對菌絲生長和酶活力都有影響，這與張家慶等[12]的研究一致。在固體發(fā)酵中，含水量是制約菌體生長和產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素。含水量過低，一方面無法滿足菌體正常的生長代謝，另一方面影響黃芪粉末顆粒的吸水膨脹，阻礙其中營養(yǎng)成分的溶解與傳遞，導(dǎo)致產(chǎn)酶量下降；含水量過高，黃芪顆粒易結(jié)成塊狀物，降低培養(yǎng)基透氣性，阻礙氧氣的輸送及熱量的擴(kuò)散，不利于菌體的生長和孢子的產(chǎn)生，從而影響產(chǎn)酶量。在優(yōu)化發(fā)酵時間方面，發(fā)酵時間較短時，黑曲霉菌體處于生長調(diào)整期，隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)酶量逐漸增多，之后趨于平穩(wěn)，達(dá)到產(chǎn)酶穩(wěn)定期。在優(yōu)化發(fā)酵溫度方面，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高會加快黑曲霉的生長代謝，產(chǎn)酶量增加；當(dāng)溫度過高時，黑曲霉機(jī)體內(nèi)的某些核酸、蛋白質(zhì)遭到破環(huán)，菌體易衰老，同時還會影響培養(yǎng)基的物理性質(zhì)和溶氧，從而間接影響酶的合成[13]。因此在發(fā)酵過程中，含水量、接種量、發(fā)酵時間和溫度等條件對菌體生長和產(chǎn)酶極其關(guān)鍵，控制好條件是發(fā)酵過程的重要環(huán)節(jié)。本研究在單因素條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，通過正交試驗確定了黑曲霉固體發(fā)酵黃芪產(chǎn)纖維素酶的最佳優(yōu)化條件為溫度37 ℃、接種量1%、含水量45%、發(fā)酵時間9 d。這為后期研究及工藝生產(chǎn)應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

3.2 不同發(fā)酵條件對多糖得率的影響

黃芪多糖作為黃芪重要的活性物質(zhì)，在許多情況下是機(jī)體貯存能量和結(jié)構(gòu)支撐的主要物質(zhì)，在機(jī)體代謝過程中被修飾轉(zhuǎn)化，發(fā)揮著提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)的功能。本研究結(jié)果表明，在黑曲霉固體發(fā)酵黃芪過程中優(yōu)化接種量、含水量、發(fā)酵時間、溫度等因素條件下，多糖得率呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢，隨溫度變化多糖得率先降低后趨于平穩(wěn)，這與劉超等[14]的研究不完全一致。分析原因，一可能是由于本試驗所用的發(fā)酵培養(yǎng)基沒有添加額外的營養(yǎng)成分，而在菌體發(fā)酵過程中碳源對于黑曲霉的生長代謝具有重要影響[15]，而多糖作為黃芪中重要的碳水化合物，在發(fā)酵過程中很可能被菌體消耗利用，并進(jìn)行自我繁殖；二是本研究采用固體發(fā)酵，與液體發(fā)酵有所區(qū)別。目前有關(guān)黑曲霉固體發(fā)酵黃芪的研究報道甚少，黃芪經(jīng)黑曲霉菌發(fā)酵后多糖、黃酮、皂苷等活性成分的變化規(guī)律尚不明確。此外，黃芪粒徑、pH等條件對發(fā)酵過程有何影響等都需要未來進(jìn)一步的研究和探討。

3.3 發(fā)酵黃芪對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

黃芪作為傳統(tǒng)的補(bǔ)益類中藥，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血糖、抗腫瘤和延緩衰老等功效[16]。因雞體內(nèi)缺乏內(nèi)源性纖維素酶，在黃芪的利用過程中由于細(xì)胞壁的存在嚴(yán)重阻礙其活性成分的釋放[17]，同時日糧中占相當(dāng)比例的纖維營養(yǎng)成分不能有效被利用。黃芪經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，產(chǎn)生的纖維素酶能有效降解黃芪細(xì)胞壁，使活性成分得以充分釋放，從而提高藥效，同時纖維素酶能促進(jìn)日糧飼料中纖維素和半纖維素降解成更多的葡萄糖及揮發(fā)性脂肪酸，產(chǎn)生獨特的香甜味，提高飼料的適口性，促進(jìn)纖維營養(yǎng)成分的消化與吸收，進(jìn)而提高蛋雞采食量[18-19]。本試驗在蛋雞基礎(chǔ)日糧中添加0.2%發(fā)黑曲霉發(fā)酵黃芪制劑，顯著提高了15～28 d的蛋雞產(chǎn)蛋率，同時料蛋比顯著降低。有研究人員報道，在基礎(chǔ)日糧中添加一定量的發(fā)酵黃芪能明顯促進(jìn)動物生長，提高生產(chǎn)性能[20-21]。李岑曦等[22]研究表明添加纖維素酶可在一定程度上增加肉雞日增重，提高肉雞飼料轉(zhuǎn)化率。李文斌等[23]研究表明飼料中添加復(fù)合纖維素酶，提高蛋雞的產(chǎn)蛋率和蛋重，降低料蛋比。這些研究結(jié)果與本試驗結(jié)果一致。

3.4 發(fā)酵黃芪對蛋雞抗氧化指標(biāo)的影響

動物機(jī)體的抗氧化酶主要包括過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)等，他們在平衡動物機(jī)體氧化和抗氧化方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉發(fā)酵黃芪制劑能提高不同飼喂階段蛋雞的血清抗氧化水平。分析原因，可能是由于黃芪中甲苷、黃酮類等活性成分增加[24-25]，而且黃芪發(fā)酵后會產(chǎn)生其他具有抗氧化作用的成分。阮鳴等[26]研究表明，黃芪甲苷在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化生成6-O-B-D-葡萄糖基-環(huán)黃芪醇，其具有顯著的抗氧化及增強(qiáng)藥效的作用。夏素銀等[27]研究發(fā)現(xiàn)苜蓿草粉和纖維素酶能顯著提高蛋雞的SOD活性，降低MDA含量。值得注意的是，第28天各組的MDA含量均有所升高，但差異不顯著，這可能與試驗周期延長、氨濃度的積累有關(guān)。有研究報道稱不同氨氣濃度能刺激動物機(jī)體相關(guān)的免疫基因下調(diào)，從而誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激和損傷等[28-29]。

4 結(jié) 論

本研究通過對黑曲霉發(fā)酵黃芪過程中酶活力和多糖得率進(jìn)行單因素優(yōu)化，初步確定淀粉酶最優(yōu)發(fā)酵條件為溫度28 ℃，接種量1%，含水量45%，發(fā)酵時間9 d；纖維素酶最優(yōu)發(fā)酵條件為溫度37 ℃，接種量1%，含水量45% ，發(fā)酵時間9 d。在單因素試驗基礎(chǔ)上通過正交試驗確定黃芪固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的條件在溫度為37 ℃，接種量為1%，含水量為45%時纖維素酶活力達(dá)到最高。本試驗以纖維素酶活力為指標(biāo)對黑曲霉發(fā)酵黃芪工藝進(jìn)行條優(yōu)化后，在蛋雞基礎(chǔ)日糧中添加0.2%的發(fā)酵黃芪制劑，能顯著提高蛋雞的產(chǎn)蛋率，降低料蛋比，同時提高血清抗氧化能力。綜上所述，黑曲霉發(fā)酵黃芪有望成為一種新型綠色的促生長飼料添加劑應(yīng)用到動物生產(chǎn)中。