慢性乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Galectin-3基因水平對(duì)聚乙二醇干擾素α治療應(yīng)答的影響*

許政衡，黃 勇，柯海霞，李 南，馬乙云

流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球約20億人曾感染過(guò)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，目前仍有2.5億HBV攜帶者[1]。乙型肝炎慢性化的機(jī)制尚未完全明確，相關(guān)診治指南建議應(yīng)用聚乙二醇干擾素-α或長(zhǎng)期給予核苷(酸)類(lèi)似物治療慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)。相對(duì)于核苷(酸)類(lèi)似物，聚乙二醇干擾素-α治療CHB患者具有HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率高、停藥復(fù)發(fā)率低、不易產(chǎn)生耐藥性和病毒變異低等優(yōu)勢(shì)，但部分患者經(jīng)α-干擾素治療仍不應(yīng)答[2,3]。治療CHB的最終目標(biāo)是最大限度地抑制HBV復(fù)制。半乳糖凝集素-3(galectin-3)參與機(jī)體細(xì)胞的黏附和凋亡、促進(jìn)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化、新生血管的形成等多種生物學(xué)活動(dòng)，在維持HBV復(fù)制和促成HBV感染的活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用，與HBV感染的慢性化密切相關(guān)[4,5]。有研究[6]表明，血清Galectin-3水平與CHB和慢性丙型肝炎患者預(yù)后有關(guān)，可為疾病的臨床治療提供參考。免疫功能紊亂是CHB發(fā)病的重要病因之一，外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)參與機(jī)體的免疫功能，了解PBMCs的功能狀態(tài)對(duì)指導(dǎo)治療CHB患者具有重要的意義[7]。本研究檢測(cè)了CHB患者PBMCs galectin-3水平及其α-干擾素治療應(yīng)答的影響，為臨床治療CHB患者提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2016年12月～2019年12月我院收治的CHB患者106例，男性62例，女性44例；年齡為26～61歲，平均年齡為(42.6±7.3)歲。符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[8]診斷標(biāo)準(zhǔn)，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)未接受過(guò)免疫調(diào)節(jié)劑和抗病毒治療；(2)無(wú)精神類(lèi)疾病，依從性較好，能夠配合研究，連續(xù)使用聚乙二醇干擾素α-2a治療48周。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他類(lèi)型肝炎；(2)合并自身免疫性、遺傳性肝病或藥物性肝損傷；(3)合并嚴(yán)重的心肺功能損傷；(4)妊娠期或哺乳期女性。另選擇同期健康體檢者25例作為對(duì)照組，男17例，女8例；年齡為24～58歲，平均年齡為(41.7±6.8)歲。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療方法 給予所有患者聚乙二醇干擾素α-2a(上海羅氏制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20070055)180 μg皮下注射，1次/w，連續(xù)治療48 w。

1.3 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 參照《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[8]標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估療效，血清轉(zhuǎn)氨酶水平降至正常范圍，血清HBV DNA水平陰轉(zhuǎn)，血清HBeAg陽(yáng)性患者發(fā)生或不發(fā)生血清HBeAg陰轉(zhuǎn)，即為應(yīng)答者，否則視為未應(yīng)答。

1.4 PBMCs中g(shù)alectin-3 mRNA檢測(cè) 清晨空腹抽取靜脈血10 mL，加入EDTA抗凝管，置于-70℃冰箱保存待檢。取靜脈血1 ml，與等量磷酸緩沖鹽溶液混勻，加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(中國(guó)科學(xué)院天津試劑廠)3 ml，離心，使用無(wú)菌一次性滴管小心吸取Ficoll分離液與血漿交界處的灰白色層(PBMCs)，加入EP管中再次離心，棄去上清，即獲得白色細(xì)胞團(tuán)(PBMCs)。采用Trizol法提取PBMCs全基因組RNA，再使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FINNZYMES公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物由上海生工生物公司合成，Galectin-3正、反向引物序列分別為 5’-GCGGAAATGGCACAATT-3’和5’-CTTGAGGGTTTGGGTTTCCA-3’，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳加以驗(yàn)證，計(jì)算Galectin-3基因相對(duì)水平，采用2-△△Ct表示。

1.5 PBMCs中g(shù)alectin-3蛋白檢測(cè) 采用Westem blot法檢測(cè)，取外周血，以RIPA裂解液裂解，離心后取上清液，以BCA法測(cè)定蛋白濃度。取PBMCs總蛋白，電泳分離，經(jīng)硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移，0.1%麗春紅染色，使用適量的TBST緩沖鹽溶液在轉(zhuǎn)移脫色床上洗膜3次，每次15 min，再以含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，加入第一抗體(美國(guó)Millipore公司)，室溫震蕩孵育1 h，再與第二抗體(美國(guó)Millipore公司)結(jié)合，作用1 h，以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色法進(jìn)行顯色并攝像。

1.6 血清檢測(cè) 使用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)的AU5800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血生化指標(biāo)；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血清HBV DNA水平(上海恪敏生物)。

2 結(jié)果

2.1 療效情況 在治療24 w，本組CHB患者應(yīng)答27例(22.6%)；在治療48 w，應(yīng)答44例(67.0%)。

2.2 不同應(yīng)答患者血生化和HBV DNA 水平比較 在入組時(shí)，不同應(yīng)答組血清AST、ALT、TBIL和HBV DNA水平無(wú)顯著性差異(P>0.05，表1)。

表1 不同應(yīng)答組血生化和HBV DNA 水平比較

2.3 不同應(yīng)答組PBMCs galectin-3基因及其蛋白表達(dá)水平比較 24 w應(yīng)答患者PBMCs galectin-3基因及其蛋白表達(dá)水平顯著高于48 w應(yīng)答、不應(yīng)答或健康人(P<0.05)；48 w應(yīng)答患者PBMCs galectin-3 mRNA水平顯著高于不應(yīng)答組或健康人(P<0.05，表2)。

表2 不同應(yīng)答組PBMCs Galectin-3 mRNA及其蛋白表達(dá)比較

3 討論

聚乙二醇干擾素-α為常用的抗病毒治療的一線(xiàn)藥物，其治療療效可能會(huì)受到病毒基因型和宿主等因素的影響。目前，仍存在部分患者經(jīng)聚乙二醇干擾素-α治療并不產(chǎn)生應(yīng)答或不能獲得完全應(yīng)答，原因尚不明確[9]。CHB發(fā)病機(jī)制可能涉及Treg細(xì)胞與效應(yīng)T細(xì)胞之間的免疫失衡，并與HBV感染慢性化有關(guān)。細(xì)胞免疫應(yīng)答的活力和強(qiáng)度可以決定HBV感染是否是被清除或是持續(xù)，免疫應(yīng)答的減弱可能導(dǎo)致HBV很難被免疫系統(tǒng)清除，使HBV感染慢性化，轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)感染。因此，機(jī)體免疫狀態(tài)對(duì)α-干擾素治療CHB患者的結(jié)局具有重要的影響[10,11]。

Galectin-3是半乳糖凝集素家族的重要成員之一，廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)中，其生物學(xué)功能復(fù)雜，參與調(diào)控細(xì)胞黏附、遷移、增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)等過(guò)程[12]。既往臨床對(duì)于galectin-3的研究主要集中于參與癌癥發(fā)生機(jī)制方面，結(jié)果表明galectin-3可與相應(yīng)配體結(jié)合影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、分化和新生血管形成等過(guò)程，且可能成為癌癥治療的潛在靶點(diǎn)[13]。在肝癌方面的研究[14]表明，galectin-3表達(dá)后細(xì)胞增殖能力下降，并提示肝損傷的存在，影響患者的治療預(yù)后。還有針對(duì)肝癌和CHB患者的相關(guān)血清學(xué)研究[15]發(fā)現(xiàn)，galectin-3是鑒定HBV相關(guān)肝癌的潛在生物標(biāo)志物，能夠提高臨床診斷的效能，表明galectin-3在肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療預(yù)后方面發(fā)揮著重要的作用，而位于細(xì)胞內(nèi)的galectin-3具有抑制細(xì)胞凋亡作用，其抑制細(xì)胞凋亡作用可能影響HBV復(fù)制和HBV感染過(guò)程，從而對(duì)臨床肝臟疾病治療產(chǎn)生影響[16]。此外，galectin-3還被證實(shí)與肝細(xì)胞再生有關(guān)，且極有可能是通過(guò)激活調(diào)節(jié)肝細(xì)胞再生過(guò)程中的信號(hào)通路Wnt/β-catenin 通路實(shí)現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞再生的調(diào)節(jié)，從而對(duì)肝臟疾病的治療產(chǎn)生影響[17,18]。PBMC主要包含淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，是固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的共同參與者。PBMCs表達(dá)的相關(guān)因子與機(jī)體免疫應(yīng)答的啟動(dòng)有關(guān)。galectin-3基因表達(dá)能夠促進(jìn)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，在肝臟組織，PBMCs發(fā)揮抗原遞呈作用，激活體內(nèi)免疫應(yīng)答系統(tǒng)，對(duì)HBV的復(fù)制發(fā)揮抑制作用，實(shí)現(xiàn)抗病毒功能[19,20]，而galectin-3表達(dá)對(duì)機(jī)體清除HBV的影響可能會(huì)對(duì)治療CHB患者的療效產(chǎn)生影響，但目前關(guān)于這方面的臨床研究仍較少?；诖?，本研究分析了CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞galectin-3表達(dá)對(duì)α-干擾素治療應(yīng)答情況的影響，結(jié)果顯示，本組治療24 w應(yīng)答率為22.6%，治療48 w應(yīng)答率為67.0%。應(yīng)用聚乙二醇干擾素-α治療CHB患者仍存在部分患者不產(chǎn)生應(yīng)答或不能獲得完全應(yīng)答的現(xiàn)象。分析不同應(yīng)答情況患者外周血單個(gè)核細(xì)胞galectin-3表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，在治療24 w時(shí)，應(yīng)答組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞galectin-3基因及其蛋白表達(dá)水平相對(duì)于此時(shí)未應(yīng)答的、在治療48 w時(shí)才應(yīng)答組和始終未應(yīng)答組患者均顯著升高，而在治療48 w時(shí)，應(yīng)答組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞galectin-3基因及其蛋白表達(dá)水平也顯著高于不應(yīng)答患者。在聚乙二醇干擾素-α治療CHB患者過(guò)程中，應(yīng)答者機(jī)體外周血單個(gè)核細(xì)胞galectin-3基因及其蛋白均呈高表達(dá)，高表達(dá)的galectin-3基因及其蛋白在機(jī)體發(fā)揮抗病毒作用過(guò)程中可能起了關(guān)鍵作用，進(jìn)一步表明聚乙二醇干擾素-α可能通過(guò)上調(diào)galectin-3基因及其蛋白表達(dá)發(fā)揮抗病毒作用的，但具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞galectin-3基因及其蛋白表達(dá)水平與聚乙二醇干擾素α治療療效密切相關(guān)。galectin-3基因及其蛋白均高表達(dá)提示患者對(duì)治療應(yīng)答，但本研究分析galectin-3基因及其蛋白表達(dá)情況應(yīng)用的數(shù)據(jù)為相對(duì)表達(dá)量，且觀察時(shí)間點(diǎn)較少，在后續(xù)研究應(yīng)考慮采取多點(diǎn)采樣檢測(cè)以獲取更為準(zhǔn)確地galectin-3基因及其蛋白表達(dá)水平資料，動(dòng)態(tài)分析galectin-3基因及其蛋白表達(dá)在CHB患者接受α-干擾素治療過(guò)程中的變化。另外，我們并不知道肝組織galectin-3基因及其蛋白表達(dá)變化的規(guī)律，它們與肝組織炎癥、纖維化和病毒載量的關(guān)系等，都需要認(rèn)真研究。在α-干擾素治療過(guò)程中，可觀察的項(xiàng)目比較多，如何整合有價(jià)值的指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)，可能對(duì)更好地預(yù)測(cè)抗病毒治療的效果有幫助。深入分析α-干擾素通過(guò)調(diào)節(jié)galectin-3基因及其蛋白表達(dá)發(fā)揮抗病毒作用的具體機(jī)制也很有必要。