膠霉毒素菌渣的抗菌活性及其應用的研究

韓立霞，魏圣可，馮文娟

（1黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東濱州 256500;2山東京博控股集團有限公司，山東濱州 256500）

0 引言

膠霉毒素菌渣是木霉在液體或固體培養(yǎng)基上發(fā)酵后經(jīng)有機溶劑提取膠霉毒素后留下的固體物質(zhì)，是膠霉毒素發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種廢棄物，其主要成分是木霉菌絲體及未利用完的培養(yǎng)基成分。膠霉毒素菌渣長期堆置會發(fā)生二次發(fā)酵，使其保存非常困難，而且還會產(chǎn)生惡臭味，污染環(huán)境，從而限制了它的下一步應用。因此，如何解決菌渣的再利用成為木霉發(fā)酵過程中必須解決的問題。土傳病害是中國目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主要病害之一，會導致作物減產(chǎn)，甚至絕收。目前，國內(nèi)外對膠霉毒素在真菌和病毒抑制作用的研究較多[1-2]，而膠霉毒素菌渣對土傳病菌的抑菌研究和應用報道較少。Weindling and Emerson 1936年首次將膠霉毒素從Trichodermalignorum中分離出來[3]，后來越來越多的研究人員對膠霉毒素在抗菌[4-5]、抗病毒[6]、抗腫瘤[7]、誘導細胞凋亡和調(diào)節(jié)免疫力等作用及作用機理[8-9]進行了一系列研究，以及木霉或膠霉毒素對土傳病的防治研究[10-11]。本實驗室為了開發(fā)一種高效的生物農(nóng)藥，對綠色木霉發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化和高產(chǎn)膠霉毒素菌株的篩選等開展大量的工作[12-13]，在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中，產(chǎn)生了大量的菌渣有待處理。為了解決木霉發(fā)酵完成后的菌渣處理問題，開展了膠霉毒素菌渣對5種土傳病菌的抗菌效果的研究，并把菌渣作為氮源再次利用來發(fā)酵木霉，希望開拓膠霉毒素菌渣在生物有機肥領域的應用，提高經(jīng)濟效益，實現(xiàn)菌渣的循環(huán)利用和資源的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干菌渣：取經(jīng)板框過濾后的膠霉毒素菌渣，55℃烘干，含水量為7%，粉碎后過20目篩備用。

受試菌株：辣椒炭疽病菌、水稻紋枯病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌、蘋果腐爛病菌，濱州學院提供。綠色木霉(Trichodermaviride)：菌株代碼為JBSH-002，保藏號為CGMCC，本公司提供。

1.2 儀器與設備

液相色譜儀：LC-20AT，日本島津公司。超凈工作臺：W-CJ-1D型，蘇州凈化設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠；搖床：HZQ-R，常州諾基儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱：250B，金壇市中大儀器廠；高速中藥粉碎機：YF系列，江陰偉翔機械制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制 PDA培養(yǎng)基：去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂16 g，蒸餾水1000 mL。土豆去皮后切成小塊加入蒸餾水中煮沸20 min，用4層紗布過濾，濾液中加入葡萄糖和細菌瓊脂，邊加熱邊攪拌，溶解后冷卻至室溫，補充蒸餾水至1000 mL，混勻后分裝到4個500 mL的三角瓶中，棉塞封口后置于滅菌鍋中121℃滅菌20 min。

木霉種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、土豆汁200 g/L。

木霉固體培養(yǎng)基：設空白對照組、陽性對照組、實驗組，空白對照組添加70 g棉籽殼和30 g玉米粉；陽性對照組添加10 g豆粕、60 g棉籽殼和30 g玉米粉；實驗組添加10 g菌渣、60 g棉籽殼和30 g玉米粉。

1.3.2 真菌的活化 將辣椒炭疽病菌、水稻紋枯病菌、蘋果腐爛病菌、油菜菌核病菌和棉花枯萎病菌5種真菌分別從試管中轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5天，備用。

1.3.3 菌渣平板的制備 分別稱取0、2、5、10 g菌渣于小燒杯中，加入10 mL 75%的乙醇混勻，封口膜封口，在超凈工作臺上放置10 min。將滅好菌的菌渣分別加入到50℃的250 mL培養(yǎng)基中，混勻，制成菌渣含量為0、8、20、40 mg/mL的平板，備用。

1.3.4 菌渣對菌絲生長的影響 用打孔器在5種真菌菌落邊緣打取6 mm的菌餅，將菌餅接種到菌渣平皿（直徑9 cm）的中央，菌餅面朝上，每皿1片，每個處理重復3次，用透氣封口膜封好后置于25℃培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7天，用十字交叉法從3天后開始測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。

1.3.5 木霉種子培養(yǎng) 用接種鏟從斜面試管中挖一塊木霉種子轉(zhuǎn)入裝液量200 mL的500 mL種子瓶，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床28℃振蕩培養(yǎng)2天。

1.3.6 木霉固體發(fā)酵培養(yǎng) 將已經(jīng)培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)接到固體發(fā)酵瓶中，接種量20%，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)5天。

1.3.7 木霉孢子計數(shù) 取1 g（干重）固體培養(yǎng)基于100 mL 0.85%的氯化鈉溶液中，振蕩1 h，取1 mL加入到9 mL無菌水中，依次稀釋5個梯度，取第4、5支管100 μL均勻涂在含0.1%脫氧膽酸鈉的PDA培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)36 h后計數(shù)。

1.3.8 蛋白質(zhì)的測定 采用凱氏定氮法。

1.3.9 膠霉毒素的測定 采用HPLC法，取20 g固體發(fā)酵培養(yǎng)基于三角瓶中，加入100 mL乙酸乙酯振蕩40 min，離心，取5 mL上層萃取液旋蒸干，加入1 mL甲醇溶解后過0.2 μm的有機膜后進行高效液相色譜分析。

色譜條件：洗脫液：甲醇:水=50:50，檢測波長：254nm，柱溫：30℃，流速：l.0 mL/min，進樣量：20 μL，色譜柱：Hypersil BDS C18柱(200 mm×4.0 mm，5 μm)。

2 結果與分析

2.1 菌渣成分分析

經(jīng)凱氏定氮法測定干菌渣中蛋白質(zhì)含量為21.32%，經(jīng)高效液相色譜法測定干菌渣中膠霉毒素含量為1.87 mg/g。

2.2 菌渣對土傳病菌菌絲生長的影響

由表1可以得到，8 mg/mL的菌渣對辣椒炭疽病菌菌絲的生長無抑制作用，20、40 mg/mL的菌渣對辣椒炭疽病菌菌絲的生長均有抑制效果，其中40 mg/mL的菌渣的抑制效果最好，達到35%以上。

表1 膠霉毒素菌渣對辣椒炭疽病菌菌絲的影響

由表2可以得到，8、20、40 mg/mL的菌渣對水稻紋枯病菌菌絲的生長均有抑制效果，其中40 mg/mL的菌渣對水稻紋枯病菌菌絲的生長的抑制率達到100%。

表2 膠霉毒素菌渣對水稻紋枯病菌菌絲的影響

由表3可以得到，8、20 mg/mL的菌渣對蘋果腐爛菌菌絲的生長無抑制作用，40 mg/mL的菌渣對其抑制率達到100%。

表3 膠霉毒素菌渣對蘋果腐爛菌菌絲的影響

由表4可以得到，8 mg/mL的菌渣對油菜菌核病菌的抑制率在70%以上，20、40 mg/mL的菌渣對其抑制率達到100%。

表4 膠霉毒素菌渣對油菜菌核病菌菌絲的影響

由表5可以得到，8、20 mg/mL的菌渣對棉花枯萎病菌菌絲的生長的抑制效果無顯著性差異，40 mg/mL的菌渣對其抑制率達到100%。

表5 膠霉毒素菌渣對棉花枯萎病菌菌絲的影響

綜上所述，膠霉毒素菌渣對辣椒炭疽病菌、水稻紋枯病菌、蘋果腐爛病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌具有一定的抑制效果。膠霉毒素菌渣的濃度不同，抑菌效果不同，濃度越大，抑菌效果越好。同濃度的膠霉毒素菌渣對這5種土傳病菌的抑菌效果不同。膠霉毒素菌渣之所以具有抑菌效果，可能與膠霉毒素菌渣中含有少量的膠霉毒素殘留有關。

2.3 菌渣對木霉生長和膠霉毒素含量的影響

膠霉毒素菌渣中少量的膠霉毒素殘留為木霉的代謝產(chǎn)物，對木霉的生長無抑制作用，因此，考慮將菌渣作為氮源培養(yǎng)綠色木霉。從表6可以看出，與空白對照組相比，添加菌渣的培養(yǎng)基培養(yǎng)木霉得到的干重孢子數(shù)和產(chǎn)生的膠霉毒素顯著增多；與陽性對照組相比，添加菌渣的培養(yǎng)基培養(yǎng)木霉得到的干重孢子數(shù)和產(chǎn)生的膠霉毒素含量無顯著差異。因此，膠霉毒素菌渣可以作為氮源用于木霉的培養(yǎng)。

表6 膠霉毒素菌渣對木霉孢子和膠霉毒素含量的影響

2.4 不同菌渣添加量對木霉孢子的影響

菌渣、棉籽殼、玉米粉的總量保持一致，在改變菌渣添加量的同時，增加棉籽殼和玉米粉的添加，棉籽殼和玉米粉添加比例2:1保持不變。

由圖1可以得到，木霉固體培養(yǎng)中菌渣添加量不同，培養(yǎng)7天后干重孢子數(shù)存在差異，其中菌渣添加量30%時，干重孢子數(shù)最多；當菌渣添加量高于30%時，隨著菌渣添加量的增加，干重孢子數(shù)呈下降趨勢?？赡苁蔷桥囵B(yǎng)基經(jīng)過木霉發(fā)酵之后的殘渣，木霉發(fā)酵過程中分泌大量的胞外降解酶類，破壞培養(yǎng)基的結構，使得蛋白質(zhì)和糖類更易利用[14]。

圖1 菌渣添加量對木霉孢子的影響

3 討論

菌絲生長速率法[15-16]是將供試藥劑與培養(yǎng)基混合，根據(jù)菌落的生長速度來評價供試藥劑的毒性大小，該方法是農(nóng)藥生物測定最常用的方法之一。但是，由于不同微生物的菌絲生長速度不同，盡量每天對菌絲進行測量，以免菌絲生長速度過快，因測量不及時而影響實驗結果。

目前，食用菌菌渣[17-18]、醬醋渣[19-20]的綜合利用的研究較多，而膠霉毒素菌渣的綜合利用報道較少。但是，膠霉毒素生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的菌渣，即木霉菌絲體、未利用完的培養(yǎng)基、各種代謝產(chǎn)物、殘留的有機溶劑等，每生產(chǎn)1 t膠霉毒素約產(chǎn)生10 t的菌渣，不僅污染環(huán)境還造成嚴重的資源浪費。本論文研究發(fā)現(xiàn)膠霉毒素菌渣對辣椒炭疽病菌、水稻紋枯病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌、蘋果腐爛病菌均有一定的抑制效果，開辟了一種膠霉毒素菌渣利用途徑。

由于膠霉毒素菌渣中含有膠霉毒素和有機溶劑殘留，且蛋白質(zhì)含量較高，因此，將膠霉毒素菌渣作為培養(yǎng)基或生物肥料循環(huán)再利用是一種很好的選擇。同時，也是因為膠霉毒素菌渣中含有膠霉毒素和有機溶劑殘留，限制了其在飼料方面的應用，今后如果想要將膠霉毒素菌渣應用于飼料方向，需要尋找一種去除膠霉毒素和有機溶劑殘留的即有效又安全的方法。

4 結論

膠霉毒素菌渣對5種土傳病菌均有一定的抑制效果，菌渣濃度越大，抑菌效果越好。培養(yǎng)基中添加膠霉毒素菌渣對辣椒炭疽病菌、水稻紋枯病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌、蘋果腐爛病菌培養(yǎng)7天后，40 mg/mL的膠霉毒素菌渣能夠完全抑制水稻紋枯病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌和蘋果腐爛病菌的生長，對辣椒炭疽病菌的抑制效果不明顯，抑制率僅為39.02%。

膠霉毒素菌渣作為氮源培養(yǎng)綠色木霉，菌渣添加量為30%時，木霉干重孢子數(shù)達到22億/g，發(fā)酵水平比空白對照組提高了7.24倍。