益生菌聯(lián)合應用行為分析法治療兒童孤獨癥譜系障礙的前瞻性隨機對照研究

李玉勤 孫映紅 梁亞鵬 周凡 楊潔 金勝利

（江蘇大學附屬醫(yī)院1.兒科；2.急診科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是一種神經(jīng)發(fā)育廣泛障礙性疾病，其主要臨床特點包括言語及社交障礙、興趣狹窄、重復刻板行為等［1］。目前，ASD具體病因仍不十分明確，多認為由遺傳和環(huán)境兩方面因素共同作用引發(fā)［2］，其較高致殘率和較差預后造成了家庭及社會的沉重負擔［3］。

ASD患兒多在醫(yī)院康復訓練中心或特殊教育培訓機構(gòu)接受應用行為分析法（applied behavior analysis，ABA）干預，可以在一定程度上改善其行為表現(xiàn)［4］。較多ASD患兒伴有消化道癥狀，包括腹瀉、便秘、腹痛、嘔吐等［5］。研究證實，益生菌可通過改善ASD患者腸道微生態(tài)失衡減輕消化道癥狀［6］。作者前期研究已證實ASD患兒消化道癥狀與行為表現(xiàn)有一定的相關(guān)性［7］。作者推測，益生菌聯(lián)合ABA干預兒童ASD有可能比傳統(tǒng)ABA干預更好地改善其行為表現(xiàn)。

為論證以上推測，本研究對2019年5月至2020年12月經(jīng)江蘇大學附屬醫(yī)院兒童康復中心明確診斷為ASD的41例患兒進行隨機分組干預，觀察療效，以便為臨床治療兒童ASD提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究是前瞻性隨機對照研究。選取2019年5月至2020年12月在江蘇大學附屬醫(yī)院兒童康復中心明確診斷為ASD的患兒作為研究對象。納入標準：（1）年齡3～6歲；（2）符合《精神疾病診斷及統(tǒng)計手冊》第5版中關(guān)于ASD的診斷標準［8］；（3）監(jiān)護人文化程度在初中以上。排除標準：（1）伴有其他發(fā)育障礙性疾病；（2）患有其他急慢性疾?。唬?）監(jiān)護人不能配合完成相應評估。本研究已通過江蘇大學附屬醫(yī)院生物醫(yī)學研究倫理委員會審查（SWYXLL20200121-19），患兒監(jiān)護人均簽署知情同意書。最終有41例ASD患兒納入本研究，隨機分為觀察組（n=21）和對照組（n=20），分組人員不參與ASD患兒的評估和治療。

1.2 研究方法

所有納入本研究的觀察組和對照組ASD患兒均在江蘇大學附屬醫(yī)院兒童康復中心由專業(yè)康復治療師運用ABA進行訓練干預3個月，每周訓練28～35 h，包括語言、模仿、社交、自理、認知、大運動和精細動作等7個方面能力的訓練。觀察組除ABA干預治療外，同時給予雙歧桿菌三聯(lián)活菌散（上海上藥信誼藥廠有限公司；國藥準字：S10970105；產(chǎn)品 批號：08120200712-1；2 g/包，含長型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌活菌數(shù)分別應不低于2.0×107CFU）口服，每次0.5包，每天3次，連續(xù)服藥3個月。

在干預前、干預后3個月分別依據(jù)孤獨癥治療評估量表（Autism Treatment Evaluation Checklist，ATEC）對兩組患兒行為癥狀的嚴重程度進行評分。ATEC評分旨在對ASD患兒的治療效果進行動態(tài)評估，包括表達/語言溝通（14個項目）、社交能力（20個項目）、感知/認知能力（18個項目）和健康/生理/行為（25個項目）等4個部分總計77個項目評分［9］。在干預前、干預后3個月分別留取患兒的糞便標本，基于16s rRNA高通量測序分析兩組患兒的腸道菌群差異。

1.3 糞便標本采集

在干預前、干預后3個月分別采集觀察組和對照組ASD患兒的糞便，立即-80℃保存?zhèn)溆?。囑患兒先排空小便，防止尿液污染，影響檢測結(jié)果，使用專用無菌糞便采集盒留取糞便。取樣前洗手、戴口罩及無菌手套，取便棒深入糞便，取大約2 g糞便保存。同時，標記好標號、姓名、日期，經(jīng)核對確認無誤后建立數(shù)據(jù)庫。

1.4 腸道菌群檢測

腸道菌群檢測采用16s rRNA高通量測序技術(shù)，流程包括以下步驟：（1）基因組DNA提?。哼x用德國QIAGEN公司QIAamp?DNA Stool Mini Kit試劑盒對糞便標本的基因組DNA進行提取，之后采用Onedrop儀器和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。（2）PCR擴增：取2.5 ng稀釋后的基因組DNA，以此作為模板，使用帶有條形碼的16s V4通用引物（515F-806R）和美國Promega公司的GoTaq?Hot Start Colorless Master Mix高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。（3）PCR產(chǎn)物的均一化和純化：PCR產(chǎn)物使用Pico Green熒光定量檢測DNA濃度；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用德國Qiagen公司的QIAquick?PCR Purification Kit試劑盒純化回收產(chǎn)物。（4）文庫構(gòu)建和上機測序：回收產(chǎn)物后進行第二輪擴增，引入美國Illumina公司的橋式PCR兼容引物，擴增產(chǎn)物使用Pico Green熒光定量及Agilent 2200 TapeStation電泳工作平臺檢測，合格后使用MiSeq臺式測序儀進行上機測序。（5）測序結(jié)果處理：采用Illumina MiSeq測序平臺得到的下機數(shù)據(jù)存在一定的低質(zhì)量數(shù)據(jù)，會干擾分析的結(jié)果，因此在進一步分析前，需要對下機數(shù)據(jù)進行預處理，具體處理步驟如下：①對高通量測序的原始數(shù)據(jù)首先根據(jù)樣品條形碼的信息，將單個樣品數(shù)據(jù)拆分出來，取出引物序列，進行測序序列質(zhì)量控制；②通過質(zhì)量檢查的序列，應用Ribosomal Database Project數(shù) 據(jù) 庫Classifier 2.3，使 用Silva數(shù)據(jù)庫進行序列比對，確定每條序列的分類等級（界、門、綱、目、科、屬、種）；③應用Mothur軟件進行分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）劃分，以序列相似性97%為標準，將這些序列劃分為OTUs，并按照序列數(shù)量生成OTUs豐度譜。獲取每個糞便標本的OTUs和分類譜系的基本分析結(jié)果后，再進行OTUs豐度分析。屬水平某菌群相對豐度=某菌群基因拷貝數(shù)/總拷貝數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗或配對t檢驗。非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較行Mann-WhitneyU檢驗。兩組間腸道菌群構(gòu)成差異的比較采用主成分分析（principal component analysis，PCA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組ASD患兒一般資料的比較

觀察組ASD患兒21例，年齡3～6歲，男16例，女5例。對照組ASD患兒20例，年齡3～6歲，男15例，女5例。觀察組與對照組性別、年齡、身高/體重/體重指數(shù)Z評分的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 觀察組與對照組一般資料的比較（ˉx±s）

2.2 兩組ASD患兒ATEC評分的比較

干預前，觀察組與對照組ATEC總評分及各部分評分比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。干預后3個月，觀察組與對照組ATEC總評分及各部分評分均較干預前明顯下降（P＜0.05），且觀察組ATEC總評分及各部分評分均低于對照組（P＜0.05）。見表2～5。

表2 干預前觀察組與對照組ATEC評分的比較（±s）

表2 干預前觀察組與對照組ATEC評分的比較（±s）

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表3 干預后3個月觀察組與對照組ATEC評分的比較（±s）

表3 干預后3個月觀察組與對照組ATEC評分的比較（±s）

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表4 干預前、干預后3個月對照組ATEC評分的比較（±s）

表4 干預前、干預后3個月對照組ATEC評分的比較（±s）

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表5 干預前、干預后3個月觀察組ATEC評分的比較（±s）

表5 干預前、干預后3個月觀察組ATEC評分的比較（±s）

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2.3 兩組ASD患兒腸道菌群PCA分析

干預前，觀察組與對照組腸道菌群構(gòu)成情況無明顯差異，第一主成分對樣品差異的貢獻值為14.98%；第二主成分對樣品差異的貢獻值為12.67%。干預后3個月，觀察組與對照組腸道菌群構(gòu)成情況存在明顯差異，第一主成分對樣品差異的貢獻值為13.78%；第二主成分對樣品差異的貢獻值為12.19%。見圖1。

圖1 干預前后觀察組和對照組腸道菌群的PCA分析 圖中1個點代表1個標本，不同組標本點間離散程度越大，提示腸道菌群構(gòu)成差異越大，點間離散程度越小，提示腸道菌群構(gòu)成差異越小。干預前，觀察組與對照組腸道菌群構(gòu)成無明顯差異，PC1=14.98%，表示第一主成分對樣品差異的貢獻值；PC2=12.67%，表示第二主成分對樣品差異的貢獻值。干預后3個月，觀察組與對照組腸道菌群構(gòu)成存在明顯差異；PC1=13.78%，表示第一主成分對樣品差異的貢獻值；PC2=12.19%，表示第二主成分對樣品差異的貢獻值。

2.4 兩組ASD患兒腸道菌群的比較

干預后3個月，在腸道菌群門水平上顯示，觀察組和對照組腸道菌群均主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門及疣微菌門這5個菌門構(gòu)成，包含了所有樣本豐度98.54%的菌群，兩組之間優(yōu)勢菌門的相對豐度比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表6。

表6 干預后3個月觀察組與對照組在腸道菌群門水平上相對豐度的比較（±s，%）

表6 干預后3個月觀察組與對照組在腸道菌群門水平上相對豐度的比較（±s，%）

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干預后3個月，在腸道菌群屬水平上顯示，觀察組雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、糞桿菌屬、瘤胃菌屬、普雷沃菌屬、布勞特菌屬的相對豐度明顯高于對照組（P＜0.05），志賀氏菌屬、梭狀菌屬的相對豐度明顯低于對照組（P＜0.05），見表7。

表7 干預后3個月觀察組與對照組在腸道菌群屬水平上相對豐度的比較［M（P25，P75），%］

3 討論

ABA主要針對ASD患兒在語言、交流和感知運動等方面的缺陷，進行針對性教育訓練，以正強化技術(shù)加強其對訓練內(nèi)容的理解和服從，改善語言交流，糾正不當情緒及行為，有效改善其社會功能，提高生存、發(fā)展能力［10］。多數(shù)學者證實ABA是治療ASD兒童的一種非常有效的方法［11］。有學者證實ATEC評分具有較高的信度和效度，可以反映ASD患兒癥狀的嚴重程度，且對于ASD患兒治療后的癥狀變化比較敏感，對治療效果的評估明顯優(yōu)于孤獨癥兒童行為檢查量表和兒童孤獨癥評定量表［12-13］?？诜嫔筛纳艫SD患兒便秘、腹痛、嘔吐、腹瀉等消化道癥狀［6］，而ASD患兒消化道癥狀與行為表現(xiàn)有一定的相關(guān)性［7-14］。本研究結(jié)果顯示，觀察組口服益生菌聯(lián)合ABA干預ASD患兒3個月后，ATEC評分明顯低于僅采用ABA干預的對照組。這說明聯(lián)合益生菌治療可進一步改善傳統(tǒng)ABA干預兒童ASD的療效。

益生菌是可實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的活的微生物，適量口服對宿主健康有益，其所含微生物組分本身就是宿主腸道菌群的一部分，較多用于糾正腸道菌群失衡，改善腸道功能［15］。本研究中采用益生菌為雙歧桿菌三聯(lián)活菌散，包含長型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌。3種活菌定植部位不同，雙歧桿菌在結(jié)腸，乳桿菌在回盲部，腸球菌范圍廣泛，對人體腸道起到全面的保護作用［16］。腸道的正常功能維持由中樞神經(jīng)、腸神經(jīng)、自主神經(jīng)及下丘腦-垂體-腎上腺軸共同支配，大腦先將傳入信息整合，后通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)及自主神經(jīng)將調(diào)控信息傳出到腸神經(jīng)叢及腸道平滑肌細胞，產(chǎn)生一系列相關(guān)效應［17］。這種雙向神經(jīng)傳導通路被稱為腸-腦軸，而介導腦、腸發(fā)揮雙向作用的橋梁被認為是腸道菌群，因此又被稱為微生物-腸-腦軸［18］。研究表明，ASD的發(fā)生、發(fā)展極可能與腸道菌群失衡有關(guān)［19］，糾正腸道菌群失調(diào)則很可能在一定程度上阻止ASD的發(fā)生、發(fā)展。雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌可以產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸及乳酸等有機酸，競爭性抑制人體腸道有害細菌的生長，并促進腸蠕動防止便秘。雙歧桿菌還可以部分阻斷致病菌和毒素的結(jié)合位點，作用機制可能是通過胞外酶降解腸上皮細胞表面的多糖結(jié)構(gòu)［20］。嗜酸乳桿菌還能合成嗜酸乳菌素、嗜酸桿菌素及乳酸菌素，對腸道致病菌有拮抗作用。糞腸球菌可產(chǎn)生細菌素，有效抑制志賀氏菌和沙門氏菌等病原菌過度生長，對維持腸道微環(huán)境穩(wěn)定有重要作用。本研究中，干預前觀察組與對照組腸道菌群PCA分析無明顯差異，干預后3個月觀察組與對照組腸道菌群PCA分析存在明顯差異，提示口服益生菌可有效糾正ASD患兒的腸道菌群失調(diào)，從而明顯改善其相關(guān)癥狀。

本研究中，干預后3個月，觀察組和對照組兩組ASD患兒腸道菌群在門水平上均主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門及疣微菌門這5個菌門構(gòu)成，兩組之間優(yōu)勢菌門的相對豐度均無顯著性差異。既往有研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組兒童相比，ASD患兒腸道菌群中擬桿菌門比例升高，厚壁菌門比例降低，差異有統(tǒng)計學意義，其他菌門比例無明顯改變［21］。另一項研究表明，ASD患兒糞便中僅厚壁菌門比例顯著降低，其他菌門比例變化不明顯［22］。但也有研究顯示，ASD患兒與健康兒童在擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門等8個主要菌門上的比例差異均無統(tǒng)計學意義［23］，甚至有學者發(fā)現(xiàn)ASD患兒厚壁菌門比例升高而擬桿菌門比例降低的研究結(jié)果［24］。目前，國內(nèi)外研究主要集中在比較ASD患兒與正常兒童腸道菌群構(gòu)成的差異，而口服益生菌能否在菌門水平上改變ASD患兒的腸道菌群構(gòu)成還尚未見公開報道，有待更多的研究去證實。

本研究中，干預后3個月，在菌群屬水平上觀察組與對照組ASD患兒相比，雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、糞桿菌屬、瘤胃菌屬、普雷沃菌屬、布勞特菌屬的相對豐度明顯升高，而志賀氏菌屬、梭狀菌屬的相對豐度明顯降低。

雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、糞桿菌屬和瘤胃菌屬均可產(chǎn)生丁酸。丁酸屬短鏈脂肪酸，是腸道菌群無氧發(fā)酵的重要代謝產(chǎn)物，與腸道黏膜通透性、血腦屏障功能維持、大腦功能及行為密切相關(guān)［25］。丁酸是組蛋白脫乙酰酶-1抑制劑，可調(diào)節(jié)pH值高敏感雙孔鉀離子通道-1，促進腸道上皮黏膜屏障的功能恢復［26］。丁酸還可改善細胞氧化應激反應，增強線粒體功能［27］。ASD動物模型研究發(fā)現(xiàn)，丁酸還可以通過調(diào)控額葉腦皮質(zhì)興奮性/抑制性基因的轉(zhuǎn)錄過程從而改善其行為癥狀［28］。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸在ASD患兒腸道中的水平較正常兒童明顯降低［29］。糞桿菌屬主要定植在結(jié)腸，既可合成丁酸，又可抑制腸道上皮細胞NF-κB活化及IL-8生成，從而阻止炎癥反應，維護結(jié)腸黏膜屏障功能，減少有害物質(zhì)進入血循環(huán)和大腦［30］。普雷沃菌屬的主要發(fā)酵產(chǎn)物是乙酸和琥珀酸，可抑制腸道有害菌過度生長，而布勞特菌屬可以幫助清除腸道中的氣體，可能與腸易激綜合征相關(guān)［31］。調(diào)節(jié)腸道菌群，尤其是可產(chǎn)生丁酸鹽的細菌，可能是治療ASD的一個有效策略。以丁酸為代表的短鏈脂肪酸可能通過多種機制參與ASD的發(fā)生、發(fā)展，包括：（1）通過促進Ca2+依賴的5-羥色胺、谷氨酸及多巴胺的釋放，促進合成兒茶酚胺；（2）通過抑制γ-氨基丁酸受體活化短鏈脂肪酸-G蛋白偶聯(lián)受體，增加谷氨酸受體敏感性；（3）通過細胞內(nèi)酸化引起縫隙連接關(guān)閉及線粒體功能障礙［32］。志賀氏菌屬即痢疾桿菌，痢疾志賀氏菌群是導致典型細菌性痢疾的病原菌，在敏感人群中少數(shù)的細菌載量就可以發(fā)病。梭狀菌屬和脫硫弧菌是引起ASD患兒胃腸道癥狀及孤獨癥行為的常見細菌。有學者發(fā)現(xiàn)，ASD患兒糞便中梭狀菌屬比正常對照組高10倍，且用抗生素治療梭狀菌屬所致慢性腹瀉后，ASD患兒的行為評分顯著改善［33］。3-羥基苯基-3羥基丙酸是梭狀菌屬的一種代謝產(chǎn)物，可耗竭腦內(nèi)兒茶酚胺，產(chǎn)生ASD癥狀，提示梭狀菌屬與ASD病因具有相關(guān)性，梭狀菌屬還可產(chǎn)生對甲酚和神經(jīng)毒素，促進合成丙酸，誘發(fā)炎癥反應［34］。在腸道代謝過程中，腸道菌群產(chǎn)生5-羥色胺、兒茶酚胺、γ-氨基丁酸等神經(jīng)遞質(zhì)和短鏈脂肪酸等脂肪及氨基酸代謝產(chǎn)物，可通過腸上皮細胞及腸嗜鉻細胞的表面受體激活腸神經(jīng)系統(tǒng)的傳入神經(jīng)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)［35-36］。如果腸道菌群發(fā)生明顯異常，相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)和代謝產(chǎn)物的種類、數(shù)量也將發(fā)生異常，從而導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常及行為異常。本研究證實，口服益生菌可通過在屬水平上上調(diào)有益菌群并抑制有害菌群，糾正ASD患兒菌群失調(diào)，改善其臨床癥狀。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)益生菌可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群微生態(tài)進一步改善傳統(tǒng)ABA干預兒童ASD的療效，但其具體機制尚需腸道代謝組學等進一步研究證實。另外，本研究為單中心研究，并且樣本數(shù)較少，研究結(jié)論還需多中心大樣本研究進一步證實，為以后臨床廣泛應用益生菌聯(lián)合ABA干預兒童ASD提供更可靠的理論依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。