功能化核酸適體的篩選及分子識別應(yīng)用

吉采靈，程 興，談 潔，袁 荃

（湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,化學(xué)生物學(xué)與納米醫(yī)學(xué)研究所,化學(xué)生物傳感與計量學(xué)國家重點實驗室,長沙410082）

核酸適體是一類通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）在體外篩選獲得的單鏈寡核苷酸序列［1，2］.核酸適體能夠折疊形成眾多高級三維空間結(jié)構(gòu)［3，4］.通過與靶標(biāo)分子間的空間結(jié)構(gòu)匹配以及分子間相互作用，核酸適體可以實現(xiàn)針對靶標(biāo)分子的特異性識別和檢測［5，6］.與分子量約150 kDa的抗體相比，核酸適體的分子量小（約15 kDa），組織穿透能力強(qiáng)，易進(jìn)入細(xì)胞實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的分子識別［7，8］.核酸適體不僅能與金屬離子和氨基酸等小分子結(jié)合，還能特異性識別蛋白質(zhì)、細(xì)胞及組織等，靶標(biāo)范圍十分廣泛［6，9］.此外，核酸適體可以通過化學(xué)方法精準(zhǔn)合成，其化學(xué)和物理性質(zhì)穩(wěn)定，易于修飾和批量生產(chǎn)［10］.基于上述優(yōu)勢，核酸適體被廣泛應(yīng)用于疾病診斷、靶向治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［11~13］.

核酸適體具有優(yōu)異的分子識別能力，然而天然核苷酸的種類有限（僅有AUCTG 5種），導(dǎo)致核酸適體的識別對象和功能具有局限性［14］.功能化核酸適體是指在核酸分子中引入天然核苷酸中不存在的特定化學(xué)官能團(tuán)，使核酸序列具有更豐富的構(gòu)象和功能，以增強(qiáng)適體的分子識別能力［15］.近年來，已經(jīng)報道了一系列經(jīng)過化學(xué)修飾的核酸，修飾后的核酸具有天然核酸無法實現(xiàn)的特定功能［16］.因此，經(jīng)過合理設(shè)計，功能化核酸適體有望展現(xiàn)出新的特性和功能，促進(jìn)其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用［14］.然而，功能化核酸適體很難與核酸適體擴(kuò)增方法兼容，因而難以使用傳統(tǒng)篩選方法進(jìn)行功能化核酸適體的篩選［17，18］.目前，在傳統(tǒng)適體篩選方法SELEX的基礎(chǔ)上，已經(jīng)發(fā)展了多種不同的技術(shù)路線，開發(fā)出多種獲得功能化核酸適體的新型篩選方法［19，20］.近年來，關(guān)于功能化核酸適體新型篩選技術(shù)的綜述報道較多，但鮮見從擴(kuò)增兼容與否的角度介紹篩選技術(shù)的綜述.本文將從該角度對功能化核酸適體篩選及其分子識別應(yīng)用進(jìn)行綜述.首先從擴(kuò)增兼容和擴(kuò)增不兼容兩方面對功能化核酸適體的篩選方法進(jìn)行闡述，而后從生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域概括了功能化核酸適體的分子識別應(yīng)用能力，最后對功能化核酸適體的篩選和應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)與展望.

1 功能化核酸適體的篩選

傳統(tǒng)SELEX技術(shù)的基本流程主要包括文庫構(gòu)建、篩選富集、擴(kuò)增、反篩、克隆測序和序列分析［21］.首先，通過體外化學(xué)合成技術(shù)構(gòu)建出一個單鏈寡核苷酸文庫，將隨機(jī)文庫與靶標(biāo)分子混合孵育，形成靶標(biāo)-核酸的復(fù)合物；然后洗脫與靶標(biāo)分子未結(jié)合的核酸，分離出與靶標(biāo)分子結(jié)合的核酸；接著將這些核酸分子作為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增，擴(kuò)增的序列作為下一輪篩選的文庫再進(jìn)行新一輪的篩選［22］.隨后，將所獲得的篩選文庫再與對照分子孵育，孵育后收集未結(jié)合的核酸序列.后續(xù)通過多輪重復(fù)篩選、分離和擴(kuò)增的步驟，逐步淘汰低親和力的核酸序列，富集與靶標(biāo)分子高特異性結(jié)合的核酸序列.最后，通過對所得的核酸序列進(jìn)行克隆和測序，得到具體的序列信息，挑選出最優(yōu)序列，進(jìn)行特異性和親和力考察，最終確定目標(biāo)核酸適體［23］.為了增強(qiáng)核酸適體的分子識別能力，大量研究通過對天然核苷酸進(jìn)行功能化來擴(kuò)大核酸適體的化學(xué)多樣性［24，25］.經(jīng)過功能化的核酸適體能夠展現(xiàn)出新的性質(zhì)和功能，提高核酸適體的分子識別能力，促進(jìn)其分子識別應(yīng)用［26，27］.然而，在功能化核酸適體的篩選過程中，由于大多數(shù)功能化核苷酸不能被SELEX中傳統(tǒng)的聚合酶所識別，阻礙了功能化核酸的擴(kuò)增，從而限制了功能化核酸適體的篩選［18］.為此，大量針對擴(kuò)增程序的研究用來克服功能化核酸適體的篩選限制.本節(jié)從擴(kuò)增兼容和擴(kuò)增不兼容兩方面總結(jié)了功能化核酸適體的篩選技術(shù).

1.1 擴(kuò)增兼容的功能化核酸適體篩選

為了克服功能化核酸適體的篩選限制，研究者通過合理設(shè)計功能化核苷酸分子獲得了與擴(kuò)增相兼容的功能化核苷酸.通過設(shè)計特殊的功能化核苷酸分子，使其保留天然核苷酸的結(jié)構(gòu)特征從而適應(yīng)天然聚合酶，實現(xiàn)有效的擴(kuò)增.1994年，Latham等［28］開發(fā)了第一個堿基修飾的功能化核酸適體.他們使用Pd/Cu介導(dǎo)的1-碘-戊炔和5-碘-2′-脫氧尿苷偶聯(lián)制備出5-（1-戊基）-2′-脫氧尿苷［圖1（A）］.首先運(yùn)用化學(xué)合成技術(shù)構(gòu)建了包含20個隨機(jī)堿基的寡核苷酸文庫.隨后，在5-（1-戊基）-2′-脫氧尿苷存在下擴(kuò)增該模板以構(gòu)建初始核酸文庫，其中胸腺嘧啶被修飾堿基完全取代.經(jīng)過6輪選擇和PCR擴(kuò)增后，篩選得到特異性識別凝血酶的功能化核酸適體.通過硝酸纖維素濾膜結(jié)合實驗測定含不同數(shù)量修飾堿基的克隆序列與凝血酶之間的結(jié)合能力［圖1（B）］，功能化核酸適體與凝血酶之間的親和力與核酸適體中5-（1-戊基）-2′-脫氧尿苷的含量呈正相關(guān).利用胸苷置換序列中的5-（1-戊基）-2′-脫氧尿苷后，發(fā)現(xiàn)核酸適體與凝血酶之間無法結(jié)合［圖1（B）中Clone 5 w/T］，表明修飾堿基對于核酸適體和凝血酶之間的相互作用至關(guān)重要.盡管與天然核酸適體相比，所合成的功能化核酸適體與凝血酶的結(jié)合親和力較低，但這無疑是為擴(kuò)增兼容功能化核酸適體的篩選開辟了新的途徑.

Fig.1 Chemical structures of 5?(1?pentynyl)?2′?deoxyuridine(A)and the interaction between radiolabelled aptamers and thrombin evaluated by itrocellulose filter binding(B)[28]

功能化的核苷酸分子不是傳統(tǒng)PCR聚合酶的天然底物，因此要使修飾后的核苷酸在功能化核酸適體的開發(fā)中得到有效應(yīng)用，需要設(shè)計開發(fā)能與天然聚合酶相兼容的功能化核苷酸分子.受到Latham等［28］研究發(fā)現(xiàn)的鼓舞，此后關(guān)于修飾核苷酸的研究越來越多.研究者對不同種類核苷酸的糖環(huán)、磷酸或堿基進(jìn)行修飾，通過天然聚合酶擴(kuò)增，篩選出了相應(yīng)的功能化核酸適體［29］.對糖環(huán)的修飾，如2′-核糖修飾（2′-deoxy，2′-hydroxyl，2′-fluoro和2′-O-methyl），可以優(yōu)化核酸適體的抗核酸酶降解能力，增加核酸適體的穩(wěn)定性.對磷酸的修飾（如硫代磷酸）和對堿基的修飾（如嘧啶側(cè)鏈修飾氨基酸），可以增強(qiáng)核酸適體與靶標(biāo)分子的結(jié)合親和力.Bharat等［14］對胞嘧啶和尿嘧啶上的疏水芳香側(cè)鏈進(jìn)行雙重修飾（圖2）.據(jù)報道，KOD DNA聚合酶來自耐熱古生菌，可以與多種修飾的嘧啶脫氧核苷酸相兼容［30］.基于此，研究者利用KOD DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出與前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9/kexin9型（PCSK9）選擇性結(jié)合的功能化核酸適體.PCSK9屬于前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族，參與多種機(jī)體重要的功能，與膽固醇血癥、炎癥和糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)［31，32］.篩選得到的功能化核酸適體能夠有效結(jié)合并影響PCSK9蛋白的活性，展現(xiàn)出治療活性.與未功能化的核酸適體相比，這種功能化核酸適體對底物的親和力更高，代謝穩(wěn)定性更好，在診斷和治療等方面具有巨大的研究潛力.

天然聚合酶一般僅限于結(jié)合單一的非天然核苷酸或非相鄰的非天然核苷酸對，而對于連續(xù)的非天然核苷酸序列，其效果并不盡如人意［17，33］.盡管通過設(shè)計保留天然核苷酸結(jié)構(gòu)可以得到與傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增相兼容的功能化核酸適體，但是使用該方法獲得的功能化核酸適體的種類和功能有限［34］.因此，研究者通過對PCR過程中聚合酶識別過程進(jìn)行研究，開發(fā)了與傳統(tǒng)聚合酶兼容的非天然堿基對.Joyce和Steitz［35］提出了小溝掃描假說，認(rèn)為聚合酶是通過識別4種天然核苷酸基團(tuán)向雙螺旋小溝呈遞的電子密度進(jìn)行序列擴(kuò)增的.然而一般的非天然核苷酸缺乏這種電子密度，因此無法利用天然聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增.基于此，Yang等［33］開發(fā)了含掃描電子密度的第五堿基Z［6-amino-5-nitro-3-（1-β-D-2-deoxyribofu?ranosyl）-2（1H）-pyridone］和第六堿基P｛2-amino-8-（1-β-D-2-deoxyribofuranosyl）-imidazo［1，2-a］-1，3，5-triazin-4（8H）one｝，同時氫鍵重排使它們只與彼此配對［圖3（A）］.從分子結(jié)構(gòu)上看，人工堿基P和Z在結(jié)構(gòu)上是互補(bǔ)的，除了Z中的硝基外，其余都與DNA中的天然堿基相似.P-Z堿基對與天然DNA高度兼容，為核酸適體提供了更豐富的構(gòu)象.隨后，研究者發(fā)現(xiàn)了可以很好地與含有P和Z的核苷酸相兼容的HS Takara Taq DNA天然聚合酶，并且該聚合酶可以支持含有4個連續(xù)非天然核苷酸的序列的PCR擴(kuò)增.此后，許多研究者使用含有P和Z的核酸文庫來獲得功能化核酸適體.Tan等［15］分別選擇了可配對的P-Z堿基對、二茂鐵堿基和氟堿基來建立人工擴(kuò)展的篩選體系，其中二茂鐵堿基可引入蛋白-金屬離子絡(luò)合作用，氟堿基可引入疏水作用，P-Z堿基對可引入蛋白-硝基相互作用，提供核酸序列更豐富的構(gòu)象.他們利用這3種類型的核酸文庫，以三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231為靶標(biāo)，篩選出可以抑制整合素α3β1（Alpha3beta1 integrin）生物學(xué)相關(guān)性能的核酸適體ZAP-1［圖3（B）］.ZAP-1可以減少α3β1與配體的結(jié)合，從而減少腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移.這些研究表明，通過對核苷酸分子進(jìn)行合理的設(shè)計，可以篩選得到擴(kuò)增兼容功能化核酸適體.

Fig.2 Chemical structures of modified deoxycytidine(Mod?dC)and modified deoxyuridine(Mod?dU)bearing a 5?(N?substituted?carboxamide)functional group R1 and R2,respectively

1.2 擴(kuò)增不兼容的功能化核酸適體篩選

對于可兼容PCR擴(kuò)增的功能化核苷酸，可以實現(xiàn)與傳統(tǒng)篩選過程相兼容的功能化核酸適體篩選，然而這種方法只能對于少數(shù)可被天然聚合酶識別的功能化核苷酸有效［17］.對于無法被天然聚合酶識別的功能化核苷酸，研究者嘗試通過改進(jìn)擴(kuò)增程序來實現(xiàn)核酸擴(kuò)增，包括設(shè)計新的可識別功能化核苷酸的聚合酶或使用替換PCR擴(kuò)增方法來進(jìn)行功能化核酸適體的篩選.

1.2.1 設(shè)計新的聚合酶 由于在PCR擴(kuò)增時，修飾后的核酸序列難以被天然DNA聚合酶識別.為了解決這一問題，Chen等［36］開發(fā)了Taq DNA聚合酶變體SFM4-3（Stoffel fragment mutant 4-3），它是一種可用于DNA和RNA擴(kuò)增的新型工程聚合酶.首先誘導(dǎo)Taq聚合酶突變構(gòu)建酶庫，利用噬菌體展示技術(shù)從噬菌體顯示的酶庫中分離出具有所需特性的聚合酶變體，經(jīng)過4輪篩選得到具有擴(kuò)增C2位修飾的寡核苷酸能力的聚合酶SFM4-3.他們利用SFM4-3聚合酶對含糖環(huán)修飾如2′-甲氧基和2′-氟修飾的核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出抗人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（HNE）的核酸適體.此后，研究者進(jìn)一步研究了SFM4-3聚合酶的使用范圍.目前，SFM4-3聚合酶的底物已擴(kuò)展到2′-氯、2′-氨基和2′-疊氮化物修飾的核酸文庫（表1）［36~41］.SFM4-3聚合酶的開發(fā)和應(yīng)用為利用修飾的核酸文庫篩選功能化核酸適體提供了重要基礎(chǔ).

Fig.3 GACTZP artificial genetic system(A)[33],schematic diagram of molecular design of aptamers containing P?Z pairs and the conformational regulation of integrinα3β1(B)[15]

Table 1 Modified substrates of SFM4-3 polymerase

1.2.2 替換PCR 除設(shè)計新的聚合酶來應(yīng)對非傳統(tǒng)PCR兼容的功能化核酸適體篩選，還可根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原理，先利用天然核苷酸將富集文庫中的功能化核苷酸替換，進(jìn)行PCR后再將人工堿基替換回原來的位置，從而實現(xiàn)目標(biāo)序列的擴(kuò)增［42］.這種方法稱為替換PCR.

通過引入非天然堿基對，可以直接增加核酸文庫的化學(xué)多樣性［43］.目前，除P-Z之外，疏水性非天然堿基對Ds｛7-（2-thienyl）imidazo［4，5-b］pyridine｝-Px（2-nitro-4-propynylpyrrole）也已廣泛應(yīng)用于DNA適體的生成［44］.Ds堿基高度疏水，它的引入可以加強(qiáng)核酸適體與靶標(biāo)蛋白疏水空腔間的相互作用，增加核酸適體的結(jié)合親和力.由于Ds堿基中含有分子量較大的噻吩，無法與天然堿基進(jìn)行配對.Px堿基主鏈為五元吡咯環(huán)，與天然堿基相比空間位阻較小，能與Ds堿基進(jìn)行配對.因此，Ds-Px常作為第三堿基對共同被引入PCR過程，從而得到具有高保真度的擴(kuò)增產(chǎn)物.Hamashima等［45］提出了一種含Ds的DNA測序方法，通過將Ds堿基替換為天然堿基進(jìn)行PCR（替換PCR），用于常規(guī)的深度測序，從而確定DNA中的Ds位置.Kimoto等［20，45，46］根據(jù)特定的測序策略開發(fā)了一種含非天然堿基對的功能化核酸適體的篩選方法，其核酸文庫包含4個天然核苷酸和1個含Ds堿基的非天然核苷酸的［圖4（A）］.Ds堿基能與靶標(biāo)蛋白的疏水空腔間產(chǎn)生強(qiáng)相互作用，為了促進(jìn)核酸適體與靶標(biāo)蛋白間的相互作用，核酸文庫中沒有包含與Ds堿基配對的Px堿基，以防止Ds堿基核酸適體結(jié)構(gòu)中形成Ds-Px堿基對從而阻礙了Ds的作用.此外，文庫中未配對的Ds還能增加核酸適體的結(jié)構(gòu)多樣性，進(jìn)一步增強(qiáng)核酸適體的結(jié)合親和力.如圖4（B）所示，Kimoto等［46］通過使用Ds預(yù)置庫來解決篩選過程后確定富集文庫中每個含Ds序列位置的問題.Ds預(yù)置庫包含有限數(shù)量的子庫，每個子庫中在天然堿基隨機(jī)序列區(qū)域的特定位置嵌入1個、2個或3個Ds堿基，并添加由2個或3個天然堿基組成的不同識別標(biāo)簽來識別每個子庫.由于Ds堿基在DNA復(fù)制過程中只與Px堿基配對，因此Px堿基僅在PCR擴(kuò)增過程中引入，實現(xiàn)核酸文庫的有效擴(kuò)增.利用Ds-預(yù)置文庫篩選后，將Ds堿基替換成天然堿基，在不含Ds和Px底物的情況下，使用Taq聚合酶對富集的文庫進(jìn)行替換PCR擴(kuò)增.最后，通過深度測序確定序列，利用識別標(biāo)簽定位每個序列中Ds的位置，再將Ds替換回原來的位點.Kimoto等［20］利用該篩選方法，篩選出了特異性靶向2種人類靶蛋白血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-165和干擾素-γ的功能化DNA適體，平衡解離常數(shù)（KD）分別為0.65 pmol/L和0.038 nmol/L，親和力比僅含天然堿基的核酸適體提高了100倍以上.相比于傳統(tǒng)的SELEX，這種獨特的篩選方法能夠在不改變天然聚合酶的基礎(chǔ)上獲得功能化核酸適體，進(jìn)一步提高了一些傳統(tǒng)核酸適體的穩(wěn)定性和親和力.

Fig.4 Chemical structures of base pairs in DNA libraries containing hydrophobic Ds bases(A)[45]and scheme of the SELEX procedure using DNA libraries with five different bases(B)[46]

2 功能化核酸適體的分子識別應(yīng)用

分子識別在自然界中起著至關(guān)重要的作用［47］.生物系統(tǒng)中存在著具有較高的結(jié)合強(qiáng)度和特異性的多種生物分子對，如抗原和抗體、酶和底物等［48，49］.這些自然產(chǎn)生的生物分子被廣泛應(yīng)用于生物傳感等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［50］.基于DNA、抗體等生物分子的生物傳感器的開發(fā)在臨床疾病診斷中發(fā)揮著重要的作用［51］.然而，許多生物分子的功能結(jié)構(gòu)十分脆弱，在非理性條件的環(huán)境中易發(fā)生變性從而喪失功能，限制了它們的應(yīng)用［52］.因此，探索既能識別目標(biāo)分子，又具有優(yōu)異穩(wěn)定性的分子識別工具非常重要.

核酸適體具有靶分子范圍廣、穩(wěn)定性好、尺寸小、易于合成和修飾等天然抗體所沒有的獨特特性，在分子識別方面具有巨大的潛力［53，54］.目前，核酸適體作為分子識別工具已在生物傳感、醫(yī)學(xué)診斷和治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用［55，56］.然而，天然核酸文庫的化學(xué)組成有限，使得傳統(tǒng)的核酸適體不僅容易被核酸酶降解，而且缺乏化學(xué)和結(jié)構(gòu)多樣性，限制了其在生物分析中的應(yīng)用［14］.核酸適體的結(jié)合能力是化學(xué)多樣性和結(jié)構(gòu)多樣性共同作用的結(jié)果，通過優(yōu)化傳統(tǒng)的篩選方法引入天然核苷酸不存在的化學(xué)基團(tuán)，能夠增強(qiáng)核酸酶抗性，提高結(jié)合親和力，獲得具有更高選擇性和強(qiáng)識別能力的功能化核酸適體，從而促進(jìn)基于核酸適體的分子識別應(yīng)用［23，57］.本節(jié)將從生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與檢測和腫瘤治療藥物的識別與開發(fā)兩方面，對功能化核酸適體的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)行概述.

2.1 生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與檢測

生物標(biāo)記物是正常生物學(xué)過程、病理過程或治療干預(yù)藥理學(xué)反應(yīng)的標(biāo)志性分子［30，58］.生物標(biāo)志物如蛋白質(zhì)、激素和酶等，存在于患者的體液、細(xì)胞或組織中，這些標(biāo)志物會在疾病發(fā)生和發(fā)展過程中異常地表達(dá)［58］.因此，生物標(biāo)志物檢測可用于臨床診斷、預(yù)后和風(fēng)險預(yù)測［59］.目前，已經(jīng)建立了核酸、血清蛋白、多肽及抗體等分子標(biāo)記，然而，對疾病特異性生物標(biāo)記的有效利用仍然很少，阻礙了疾病的早期診斷和有效治療［60］.因此，生物標(biāo)記物的識別與發(fā)現(xiàn)仍然是分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個緊迫挑戰(zhàn).核酸適體能夠特異性識別靶標(biāo)分子，具有檢測疾病的潛力.然而，一些生物標(biāo)志物無法通過僅含4種天然核苷酸的核酸文庫找到相應(yīng)的核酸適體.由于化學(xué)基團(tuán)的引入，功能化核酸適體具有更豐富的空間構(gòu)象，增加了篩選所需核酸適體的可能性.

胰腺癌是消化道常見惡性腫瘤之一，大多數(shù)胰腺癌患者在晚期才被診斷出來，確診后的手術(shù)切除率低，術(shù)后五年生存率約10%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一［61］.因此，開發(fā)一種靈敏的胰腺癌早期檢測的方法具有重要意義.為了識別胰腺癌的生物標(biāo)志物親環(huán)素B（CypB），Ray等［62］將2′-氟修飾的嘧啶引入ssRNA文庫，設(shè)計了一種正負(fù)篩選法，篩選出一種功能化核酸適體M9-5（圖5）.該功能化核酸適體具有較高的敏感性和特異性，可以用于區(qū)分癌變和非癌變的人胰腺細(xì)胞.他們使用市售的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒在同一組癌癥患者與健康志愿者血清中測量CypB水平，發(fā)現(xiàn)與健康志愿者血清相比，胰腺癌患者血清中CypB水平顯著提高.此外，M9-5結(jié)合實驗結(jié)果顯示，與青年志愿者組相比，胰腺癌患者組M9-5適體與未稀釋血清結(jié)合的比例顯著升高，這與酶聯(lián)免疫吸附試驗的檢測結(jié)果一致.作者認(rèn)為這種功能化核酸適體能夠特異性結(jié)合胰腺癌的生物標(biāo)志物，可以作為胰腺癌早期檢測的工具.甘聚糖3（GPC3）是肝細(xì)胞系表面生物標(biāo)志物［63］.Zhang等［64］利用GPC3作為蛋白靶點，通過六字母的GACTZP文庫進(jìn)行基于細(xì)胞的體外篩選實驗，篩選出含P-Z堿基對的功能化核酸適體.這些功能化核酸適體可以用來區(qū)分細(xì)胞是否含GPC3蛋白，因此可能對肝癌的治療產(chǎn)生一定的作用.以上研究表明，核酸適體的功能化可以豐富核酸適體的結(jié)構(gòu)和功能，增強(qiáng)核酸適體與靶標(biāo)分子間的結(jié)合親和力.因此，利用功能化核酸適體可以有效識別和檢測生物標(biāo)志物.

腫瘤相關(guān)細(xì)胞膜蛋白靶點的識別對于了解腫瘤進(jìn)展、開發(fā)新的診斷工具以及識別新的治療靶點具有重要意義［64，65］.細(xì)胞膜表面表達(dá)異常的蛋白可作為腫瘤診斷、治療和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物，然而目前由于缺少有效的技術(shù)，細(xì)胞表面生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)仍處于初期階段［66~68］.隨著核酸適體篩選技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等的不斷發(fā)展，研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些新的腫瘤細(xì)胞表面生物標(biāo)記物，如黏集素C、免疫球蛋白M（IgM）等.Mallikaratchy等［69］在對B細(xì)胞白血病的研究中，發(fā)現(xiàn)了一種能特異性識別Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系Ramos細(xì)胞的功能化核酸適體TD05.首先引入光活性尿嘧啶衍生物對TD05進(jìn)行功能化，使其細(xì)胞膜上的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行共價交聯(lián)，增強(qiáng)核酸適體與靶標(biāo)蛋白間的結(jié)合親和力.接著利用鏈霉親和素磁珠結(jié)合核酸適體捕獲并富集靶標(biāo)蛋白，最后將收集的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，確定了TD05的靶蛋白是IgM重鏈區(qū).IgM是Burkitt淋巴瘤中表達(dá)的B細(xì)胞受體復(fù)合物的主要成分，是Burkitt淋巴瘤的潛在標(biāo)志物.這項研究表明，開發(fā)高質(zhì)量的適體探針并鑒定其靶蛋白可用于發(fā)現(xiàn)新的與疾病相關(guān)的潛在標(biāo)志物，從而提高腫瘤的診斷和治療水平.

Fig.5 Schemeo of“positive/negative”SELEX strategy

2.2 腫瘤治療藥物識別與開發(fā)

目前，腫瘤是危害人類健康的主要殺手.雖然已經(jīng)開發(fā)出各種腫瘤治療藥物，但仍因藥物成本高、多藥耐藥等問題阻礙其進(jìn)一步應(yīng)用.因此，有必要開發(fā)更安全、更有效的治療藥物［70，71］.核酸適體能與靶標(biāo)分子選擇性結(jié)合，進(jìn)一步封閉靶標(biāo)的活性位點從而抑制其生物學(xué)功能，可作為腫瘤治療的有效藥物［15，72］.功能化核酸適體可進(jìn)一步豐富其識別對象，增強(qiáng)與靶標(biāo)間的結(jié)合親和力，因此功能化核酸適體有很大潛力通過識別藥物分子指示藥物設(shè)計，甚至作為治療新藥用于腫瘤治療.

喜樹堿是一種植物抗癌藥物，對腸胃道和頭頸部癌等有較好的療效［73］.Imaizumi等［74］針對喜樹堿衍生物1（CPT1）進(jìn)行了2個獨立的SELEX實驗，一個使用天然DNA文庫篩選得到天然的核酸適體作為對照，另一個使用修飾的DNA文庫，其中利用N-［2-（N6腺嘌呤基）乙基］氨基甲?；蚁┗揎椀哪蜞奏ぬ娲叵汆奏ぃM(jìn)行篩選得到相應(yīng)的功能化核酸適體.在尿嘧啶的C5位上引入化學(xué)官能團(tuán)N-［2-（N6腺嘌呤基）乙基］氨基甲?；蚁┗?，有望增加分子間和分子內(nèi)氫鍵及堆積相互作用的形成，進(jìn)一步增強(qiáng)核酸適體的識別能力.與篩選得到的天然核酸適體相比，功能化核酸適體對CPT1具有更高的結(jié)合親和力，證明了堿基修飾對親和力增強(qiáng)的卓越功效，以及非天然核酸文庫在開發(fā)小分子適體方面的實用性.該功能化適體可以有效識別CPT1這一有效的抗腫瘤藥物，具有巨大的應(yīng)用潛力.

近來的研究表明，功能化核酸適體可直接用于腫瘤治療，且具有優(yōu)異的治療效果［75，76］.AS1411是一種能夠特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面核仁蛋白的DNA適體，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而不影響正常細(xì)胞的生理活性.然而，AS1411的穩(wěn)定性較差，限制了其在腫瘤治療上的應(yīng)用.Yang等［77］通過插入2′-脫氧肌苷（2′-dI）提高了適體AS1411的穩(wěn)定性［圖6（A）和表2］.功能化的AS1411適體可以通過阻斷DNA復(fù)制來抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，從而達(dá)到治療腫瘤的目的［圖6（B）和（C）］.基于此，Yang等［78］還進(jìn)行了更深入的研究，發(fā)現(xiàn)在AS1411中插入D-/L-異胸苷（D-/L-isoT）能進(jìn)一步提高AS1411的穩(wěn)定性，表現(xiàn)出更強(qiáng)的腫瘤抑制能力（表3）.干擾素-γ是一種抗腫瘤細(xì)胞因子，但易引起自身的不良免疫反應(yīng)，因此有必要開發(fā)與干擾素-γ結(jié)合的物質(zhì)來中和抗體［79，80］.Matsunaga等［81］利用Ds-Px非天然堿基對修飾的DNA適體靶向干擾素-γ，抑制干擾素-γ的生物活性.功能化DNA適體增強(qiáng)了適體的相容性和穩(wěn)定性，可減少治療時的不良免疫反應(yīng)，有利于實現(xiàn)溫和的腫瘤治療.綜上所述，功能化核酸適體能夠顯著提高其與靶標(biāo)分子間的親和力和選擇性，可作為有效、安全的腫瘤治療藥物.

Fig.6 The structure diagram of 2′?deoxynucleosides and AS1411(A),photographs of the dissected tumors after treated with AS1411 or functionalized AS1411(B)and average tumor volume after treated with AS1411 or functionalized AS1411(C)[77]

Table 2 Sequences of AS1411 and 2′-dI modified AS1411s

Table 3 Binding parameters for the affinity of D-/L-isoT(TD/TL)and/or 2′-dI modified AS1411 for nucleolin

3 總結(jié)與展望

自SELEX技術(shù)開發(fā)以來，已通過該技術(shù)篩選得到了能特異性結(jié)合小分子和生物大分子等靶標(biāo)的核酸適體.這些核酸適體作為新型的分子識別工具，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)的研究中.近年來，由于天然核酸適體的功能多樣性有限，人們對功能化核酸適體進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)將功能結(jié)構(gòu)單元整合到核酸適體中有望賦予其新的結(jié)構(gòu)和更多的功能.基于此，進(jìn)化出人工擴(kuò)展遺傳系統(tǒng)的SELEX方法，并將篩選得到的功能化核酸適體應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域.本文主要介紹了功能化核酸適體的篩選方法及其在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用，盡管目前已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但仍有諸多問題需要解決：（1）SELEX是一項復(fù)雜的技術(shù)，篩選過程中會受到多種因素的影響，如溫度、緩沖液和離子強(qiáng)度等.有時即使經(jīng)過多輪篩選，最終文庫中的高豐度序列還是無法特異性結(jié)合目標(biāo)分子.針對目前核酸適體篩選效率較低這一問題，有必要進(jìn)一步研究核酸適體的篩選機(jī)理，從根本上推動篩選技術(shù)的進(jìn)步.由于SELEX過程涉及核酸序列和靶標(biāo)分子間復(fù)雜的相互作用，使用機(jī)器學(xué)習(xí)算法可以幫助評估核酸適體在篩選過程中受到的多種因素的綜合影響，對于提高篩選效率具有一定的指導(dǎo)意義.（2）在核酸中引入新的功能基團(tuán)、開發(fā)非天然核苷酸對于功能化核酸適體的發(fā)展和應(yīng)用具有重要意義.然而，目前用于功能化核酸適體的功能基團(tuán)以及非天然堿基或堿基對的種類十分有限，所研究的功能化核酸適體的種類和數(shù)量也很少.設(shè)計新的功能基團(tuán)，或嘗試結(jié)合多種不同的功能基團(tuán)對核酸適體進(jìn)行功能化，有望進(jìn)一步增加核酸適體的結(jié)構(gòu)和功能多樣性，提高其應(yīng)用潛力.（3）功能化核酸適體在活細(xì)胞和活體動物模型中已經(jīng)取得良好的應(yīng)用結(jié)果，然而在實際應(yīng)用中仍缺乏結(jié)構(gòu)生物學(xué)的理論支持和大量臨床樣本的數(shù)據(jù)支撐.因此，對于核酸適體未來的實際應(yīng)用還需要進(jìn)一步的深入研究.總之，功能化核酸適體篩選技術(shù)的發(fā)展使其在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出前所未有的優(yōu)勢，在未來的生命分析科學(xué)中將成為不可或缺的分子識別工具.