RNA切割型脫氧核酶在致病菌檢測中的研究進(jìn)展

毛 瑜，瞿 昊，鄭 磊

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,合肥230009）

致病菌在環(huán)境中幾乎無處不在，給公共衛(wèi)生帶來巨大威脅，是造成人類疾病或死亡的主要元兇之一［1，2］.為避免致病菌引起的疾病暴發(fā)和盡量減少其持續(xù)流行所帶來的影響，早期發(fā)現(xiàn)并在現(xiàn)場快速高效檢測致病菌非常重要［3］.傳統(tǒng)的分析方法在對致病菌的檢測和預(yù)防方面做出了很大的貢獻(xiàn).然而，每種技術(shù)都存在其固有的缺陷.如，細(xì)菌培養(yǎng)方法雖然準(zhǔn)確率高且成本低，但耗時(shí)很長且需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室條件才能進(jìn)行［4］.基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的檢測技術(shù)可以在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)菌的高靈敏定量檢測，但其檢測結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性，且需要相對昂貴的儀器和復(fù)雜的操作，不能在現(xiàn)場進(jìn)行檢測［5］.基于抗體的檢測方法［6］如酶聯(lián)免疫吸附測定法和膠體金免疫層析試紙條等，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)菌的快速現(xiàn)場檢測，但抗體的穩(wěn)定性較差，反應(yīng)過程易受環(huán)境因素影響，容易造成漏檢或假陽性結(jié)果.近年來，基于基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas的致病菌檢測技術(shù)得到快速發(fā)展［7~18］，此類技術(shù)可在常溫下快速、特異、靈敏地對致病菌進(jìn)行檢測，但檢測過程需要對細(xì)菌的核酸進(jìn)行提取，且Cas蛋白在常溫下不能長時(shí)間保存.因此建立可在復(fù)雜生物樣品中快速、可靠且簡便地檢測致病菌的分析方法仍然是一個(gè)重大的挑戰(zhàn).

以DNA為基礎(chǔ)的脫氧核酶將分子識別元件和催化信號放大元件雙重功能集成于一體，對致病菌的高效快速檢測極具吸引力［19~21］.脫氧核酶是一類通過體外篩選技術(shù)［22，23］獲得的具有催化功能的單鏈DNA分子，其能夠折疊成特定的二維或三維空間結(jié)構(gòu)以催化某些特定的化學(xué)反應(yīng)，如RNA切割［24，25］、DNA/RNA連接［26，27］、DNA磷酸化［28］等.與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)酶相比，脫氧核酶具有穩(wěn)定性高，相對分子質(zhì)量小，易化學(xué)合成與修飾，受pH值等環(huán)境因素影響小等諸多優(yōu)勢［29］.而與核糖酶相比，脫氧核酶具有相似的催化活性，某些脫氧核酶的催化活性甚至比核糖酶還要強(qiáng)，如10~23 RNA切割型脫氧核酶的催化活性可達(dá)109min-1，比具有相同催化功能的核糖酶的活性強(qiáng)約100倍［30］，脫氧核酶還具有合成價(jià)格更低廉以及在生物體中穩(wěn)定性更高等優(yōu)勢［31］.這些優(yōu)勢推動了其在生物傳感、生物成像和基因治療等領(lǐng)域的發(fā)展與應(yīng)用.其中細(xì)菌響應(yīng)型RNA切割作用的脫氧核酶（RCD）在與特定靶標(biāo)結(jié)合時(shí)也被激活催化底物分子的磷酸二酯鍵水解，可結(jié)合適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器進(jìn)行信號輸出，也可同時(shí)結(jié)合鏈置換、滾環(huán)擴(kuò)增等核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對檢測信號進(jìn)行放大，在構(gòu)建特異性識別檢測致病菌的分子探針等研究上具有很大潛力.

本文綜述了近年來細(xì)菌響應(yīng)型RCD體外篩選技術(shù)的發(fā)展，細(xì)菌響應(yīng)型RCD的結(jié)構(gòu)與切割機(jī)制，以及基于RCD的致病菌檢測生物傳感器的構(gòu)建及其在食品安全、環(huán)境檢測和疾病監(jiān)控等方面的應(yīng)用進(jìn)展，并對其面臨的問題和未來發(fā)展前景進(jìn)行了展望.

Fig.1 In vitro selection scheme[38]

1 細(xì)菌響應(yīng)型RCD

1.1 細(xì)菌響應(yīng)型RCD體外篩選策略

1994年，Breaker和Joyce［22］利用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)首次篩選得到了RCD，這也是報(bào)道的第一個(gè)脫氧核酶.此后，隨著在RCD的研究上不斷深入，對不同靶標(biāo)（金屬離子［32~36］、中性分子［37］、細(xì)菌［38~43］和細(xì)胞［44，45］等）特異性響應(yīng)的脫氧核酶被相繼開發(fā)，無論在生物檢測還是臨床治療上都受到了廣泛關(guān)注.

活菌在營養(yǎng)條件下生長時(shí)，會不斷地與環(huán)境交換物質(zhì)，留下小分子和大分子的混合物，這是每個(gè)細(xì)菌具有高度特異性的物質(zhì)，這些混合物也被稱為細(xì)菌粗提代謝混合物（Crude Extracellular Mixture，CEM）.2011年，Li等［38］首次提出利用細(xì)菌CEM進(jìn)行RCD的篩選，并建立了相應(yīng)的體外篩選策略，并以大腸桿菌作為細(xì)菌模型，成功獲得了特異性感應(yīng)大腸桿菌的RCD.該策略可在分子靶標(biāo)未知的前提下，直接以目標(biāo)細(xì)菌的CEM作為篩選對象，與負(fù)向篩選相結(jié)合，得到針對該細(xì)菌的RCD，為致病菌特異性分子探針的開發(fā)提供了強(qiáng)有力的工具.細(xì)菌響應(yīng)型RCD的體外篩選步驟如圖1所示.（1）核酸文庫的制備，該核酸文庫由隨機(jī)序列區(qū)、引物結(jié)合區(qū)以及一個(gè)RNA切割位點(diǎn)構(gòu)成，一般包含1013~1015個(gè)隨機(jī)序列；（2）將核酸文庫與非目標(biāo)菌株的CEM共孵育，此時(shí)發(fā)生RNA切割的序列為非特異性序列；（3）去除發(fā)生RNA切割的DNA序列，分離收集未發(fā)生RNA切割的序列；（4）通過PCR對收集到的序列進(jìn)行擴(kuò)增；（5）將RNA切割位點(diǎn)重新連接到上一步富集出的序列中，形成次級核酸文庫；（6）將次級核酸文庫與目標(biāo)菌株的CEM共孵育，此時(shí)與目標(biāo)菌株CEM特異性響應(yīng)的序列會發(fā)生RNA切割；（7）分離發(fā)生RNA切割的DNA序列；（8）利用PCR對其進(jìn)行擴(kuò)增用于下一輪的篩選.在篩選過程中，可通過縮短孵育時(shí)間以及降低靶標(biāo)濃度等方式施加篩選壓力，對靶標(biāo)細(xì)菌具有特異性響應(yīng)的核酸序列逐漸被富集.通常上述步驟進(jìn)行6~20個(gè)連續(xù)循環(huán)后，對篩選出的核酸文庫進(jìn)行測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行分析以獲得所需的RCD.

這種體外篩選技術(shù)的優(yōu)勢在于：首先，無需預(yù)先知道特定的靶標(biāo)分子即可獲得特異性感應(yīng)目標(biāo)菌株的RCD，為解決特異識別靶標(biāo)不明確的生物樣本的檢測難題提供了高效的解決方案；其次，以CEM為篩選對象可以確保所篩選出的RCD在復(fù)雜生物樣品中仍具備催化功能，無需對樣品進(jìn)行任何預(yù)處理，為現(xiàn)場即時(shí)檢測提供了良好的分子識別工具；此外，該篩選策略中采用的負(fù)向篩選可以去除非目標(biāo)菌株CEM獨(dú)有分子對RCD的響應(yīng)，很大程度地提高了RCD對目標(biāo)菌株識別的特異性；同時(shí)，通過在RNA切割位點(diǎn)兩側(cè)引入一對熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，即標(biāo)記熒光的RNA切割酶（RNA-cleaving Fluorogenic DNAzyme，RFD）［46~53］，可實(shí)現(xiàn)每一輪篩選切割信號的可視化.

此后，Li等［39］利用該方法又篩選出了另一種細(xì)菌響應(yīng)的脫氧核酶探針RFD-CD1，此探針不僅對艱難梭菌具有細(xì)菌種類特異性，更是對其耐藥菌株BI/027具有菌株特異性.Zhao等［40］利用相同的體外篩選策略，獲得了特異性識別肺炎克雷伯菌的脫氧核酶探針RFD-KP6，并將其應(yīng)用于96孔紙基熒光傳感器中.Brennan和Li等［41］使用此篩選策略分離出了可以被幽門螺桿菌特異性激活的脫氧核酶探針DHp3T4，并進(jìn)一步應(yīng)用于檢測幽門螺旋桿菌的紙基傳感器中.Li等［42］近期篩選得到了特異性識別嗜肺軍團(tuán)菌的脫氧核酶探針LP1，該探針在不同來源的冷卻塔水中依然能夠保持良好的活性.另外，Liu等［43］篩選獲得了一種名為VAE-2的RCD，用于識別一種致病性海洋細(xì)菌鰻弧菌.VAE-2與上述所有RCD的不同之處在于，其是從一個(gè)沒有包含熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)標(biāo)記的核酸文庫中篩選得到的，避免了RCD在催化過程中對標(biāo)記基團(tuán)的依賴.

值得注意的是，待測細(xì)菌CEM的制備對整個(gè)體外篩選過程和后期生物傳感器的應(yīng)用都十分重要.蛋白質(zhì)和小分子的表達(dá)譜在細(xì)菌的不同生長階段有所不同，因此，要根據(jù)需要在特定細(xì)菌生長階段收集CEM.如Li等［39］在制備艱難梭菌CEM的時(shí)候，選擇在艱難梭菌的穩(wěn)定生長期收集CEM.因?yàn)樵谶@個(gè)階段，艱難梭菌產(chǎn)生的導(dǎo)致其致病性的毒素相關(guān)蛋白最多.這為成功篩選獲得特異性針對艱難梭菌耐藥菌株的RCD提供了更高的可能性.

初步研究表明，激活上述6個(gè)RCD的分子靶點(diǎn)是蛋白質(zhì)，其中RFD-CD1的靶點(diǎn)被進(jìn)一步確定為艱難梭菌BI/027株獨(dú)有的TcdC（一種轉(zhuǎn)錄因子）的截短版本［38~43］.盡管目前除RFD-CD1外，大多數(shù)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的身份還沒有被破譯，但這并不影響RCD對其靶標(biāo)細(xì)菌的特異性檢測.同時(shí)，對識別激活這些RCD的靶點(diǎn)進(jìn)行探索研究，不僅可以加深對此類RCD識別功能和催化機(jī)制的研究，也給新型生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了新的途徑.

1.2 細(xì)菌響應(yīng)型RCD的結(jié)構(gòu)與切割機(jī)制

細(xì)菌響應(yīng)型RCD既包含用于目標(biāo)識別的適體結(jié)構(gòu)域，又包含用于催化RNA裂解的脫氧核酶結(jié)構(gòu)域，因此這類RCD也被稱為適體酶［55］.其中，用于催化RNA裂解的脫氧核酶結(jié)構(gòu)域由催化區(qū)域和底物區(qū)域組成.底物區(qū)域包含一個(gè)RNA切割位點(diǎn)以及兩側(cè)的結(jié)合臂.催化區(qū)域包含催化功能區(qū)和兩側(cè)的結(jié)合臂，此區(qū)域與底物區(qū)域的結(jié)合臂通過堿基互補(bǔ)配對，拉近催化功能區(qū)和RNA底物之間的距離，適體結(jié)構(gòu)域與細(xì)菌CEM中可激活RCD的分子相互結(jié)合，促使催化功能區(qū)折疊形成特定的三維結(jié)構(gòu)，催化底物區(qū)域RNA堿基上的2′-OH作為親核試劑攻擊鄰近磷酸二酯鍵上的5′-O，從而切斷底物區(qū)域中RNA的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生含有2，3-環(huán)磷酸的5′-裂解片段和含有5′-OH的3′-裂解片段（圖2）［56］.雖然這些RCD的催化過程也需要金屬離子的參與，但其裂解活性主要依賴于適體結(jié)構(gòu)域與非金屬靶標(biāo)的相互作用.

Fig.2 Chemical transformation of RNA cleavage[56]

根據(jù)催化區(qū)域和底物區(qū)域的連通性，可將RCD分為順式和反式兩種類型.在順式RCD中，催化區(qū)域和底物區(qū)域連接成一個(gè)序列.相反，反式RCD由催化鏈和底物鏈組成.順式和反式RCD的一個(gè)重要區(qū)別是，順式RCD雖然具有催化活性，但只能完成單次催化，而反式RCD在底物鏈裂解脫離催化鏈以后，可以繼續(xù)與另一個(gè)底物鏈結(jié)合催化其裂解，因此可以進(jìn)行多次循環(huán)催化.在反式RCD的催化過程中，結(jié)合臂的長度和堿基組成對其效率會產(chǎn)生影響.在單個(gè)催化反應(yīng)中，較強(qiáng)的雜化才能使RCD較好地與底物鏈結(jié)合，從而高效地完成催化反應(yīng)；但較強(qiáng)的雜化作用使反應(yīng)完成的底物鏈難以從催化鏈上脫落，成為阻止催化鏈繼續(xù)捕獲未反應(yīng)的底物鏈以催化多重催化反應(yīng)的障礙，從而導(dǎo)致催化反應(yīng)速率的降低.常用的RCD兩側(cè)結(jié)合臂分別由7~9個(gè)堿基組成［57］.

2 RCD在致病菌檢測中的應(yīng)用

近年來，研究者們提出諸多基于細(xì)菌響應(yīng)型RCD的生物傳感策略［38~43，58~78］，這些生物傳感器具有檢測時(shí)間短、操作簡便及檢測成本低等優(yōu)勢，其靈敏度和特異性也基本滿足常規(guī)需求，有望進(jìn)一步應(yīng)用于對致病菌的現(xiàn)場即時(shí)檢測.

2.1 基于細(xì)菌響應(yīng)型RCD的熒光生物傳感器

Li等［38］開發(fā)的RFD熒光探針可同時(shí)承擔(dān)分子識別和信號生成的作用，已經(jīng)被用于實(shí)時(shí)檢測致病菌.其檢測機(jī)理為：將一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)猝滅基團(tuán)通過化學(xué)修飾，分別標(biāo)記在RFD中RNA的兩端，在無目標(biāo)細(xì)菌時(shí)，探針保持低背景的熒光狀態(tài)（圖3）.當(dāng)RFD與其特異性靶向的目標(biāo)結(jié)合后，RFD構(gòu)象轉(zhuǎn)變成具有切割RNA活性的構(gòu)象，并催化其底物鏈上的RNA發(fā)生裂解，使得熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分離，熒光信號顯著增強(qiáng).通過細(xì)菌CEM篩選得到的RFD會在特定細(xì)菌CEM存在的環(huán)境中被激活產(chǎn)生熒光信號，從而用于細(xì)菌的定性和定量檢測.基于該策略，已經(jīng)分別實(shí)現(xiàn)了對大腸桿菌［38］、艱難梭菌［39］、肺炎克雷伯菌［40］、幽門螺桿菌［41］、嗜肺軍團(tuán)菌［42］和鰻弧菌［43］的高特異性檢測.其中，RFD-EC1在無細(xì)菌培養(yǎng)步驟的情況下，即可達(dá)到103CFU/mL的檢測限，且4 h的培養(yǎng)步驟可以檢測到單個(gè)CFU.篩選得到的DHp3T4能夠在無細(xì)菌培養(yǎng)步驟下，檢測到濃度低至104CFU/mL的幽門螺桿菌.而特異性識別嗜肺軍團(tuán)菌的脫氧核酶探針LP1，在無細(xì)菌培養(yǎng)步驟的情況下，檢測限可低至10 CFU/mL.另一例RCD熒光探針VAE-2在最佳條件下可檢測4×103CFU/mL的鰻弧菌.Zhao等［58］利用大腸桿菌特異性響應(yīng)的RFD，結(jié)合液滴微流體和高通量3D粒子計(jì)數(shù)器系統(tǒng)，開發(fā)了一種集成式綜合液滴數(shù)字檢測的技術(shù)平臺用于致病菌的超靈敏檢測.該技術(shù)能夠在1.5~4 h內(nèi)，以單細(xì)胞靈敏度，直接從毫升稀釋的血液中檢測大腸桿菌.

Fig.3 Conceptual design of fluorescent DNAzymes fluorescing upon contact with the CEM produced by living bacterial cells[38]

為了將這種基于溶液的檢測轉(zhuǎn)化為易于使用的傳感器裝置，幾種簡單且穩(wěn)定的基于RCD的紙基生物傳感器已被報(bào)道用于致病菌檢測.Filipe和Brennan等［59］創(chuàng)建了一種簡單的用于檢測大腸桿菌的一體化紙基傳感器（圖4）.該傳感器利用具有低熒光背景的硝化纖維素紙作為基底，在紙上做微孔，將RFD-EC1固定在由普魯蘭聚糖和海藻糖組成的薄膜中，這使RFD-EC1具有長期穩(wěn)定性.在大腸桿菌存在下，RFD-EC1自我催化裂解，微孔區(qū)顯示出強(qiáng)烈的熒光信號，可以用熒光掃描儀進(jìn)行檢測.該傳感器在5 min內(nèi)即可產(chǎn)生顯著的熒光信號，對大腸桿菌的檢測限低至100 CFU/mL，而不需要樣品富集或信號擴(kuò)增.基于同樣的原理，Zhao等［40］開發(fā)了檢測肺炎克雷伯菌的96孔紙基熒光傳感器，可直接檢測105CFU/mL肺炎克雷伯菌，并且可實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣本的同時(shí)檢測.研究表明，這類紙基生物傳感器可以顯著延長RCD熒光探針的壽命，可在常溫下長期保存至少180 d，并且使用簡單、成本低廉，可用于水、牛奶等食品中致病菌的快速檢測.Li，Brennan和Liu等［60］研究了微米大小的功能核酸超結(jié)構(gòu)，稱為3D DNA，用于制作紙基傳感器.滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）在高鹽濃度下產(chǎn)生直徑超過1μm的3D DNA，其中包含RFD-EC1的重復(fù)序列.這些非常大的DNA結(jié)構(gòu)在打印到纖維素紙上時(shí)，會被紙張表面物理吸收并被固定［61］.這些含RCD的3D DNA結(jié)構(gòu)與單體RCD相比具有更高的表面負(fù)載密度，對核酸酶的降解具有很強(qiáng)的抗性，并且顯著降低了非特異性蛋白的吸附.這些特性使得3D DNA非常適合用于開發(fā)紙基生物傳感器.Li和Filipe等［62］報(bào)道了另一種基于RCD的生物傳感系統(tǒng)，包括附著在瓊脂糖磁珠上的順式作用的致病菌響應(yīng)型RCD和打印有捕獲DNA探針的紙條用于捕獲攜帶熒光基團(tuán)的裂解產(chǎn)物.此設(shè)計(jì)可以將反應(yīng)集中在較小的預(yù)定表面積上，以提高檢測的靈敏度.使用RFD-EC1作為檢測模型探針，能夠檢測10 CFU/mL的大腸桿菌.此外，還設(shè)計(jì)了一種使用RFD-EC1和RFD-KP6同時(shí)檢測大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的方法，每個(gè)RCD的裂解產(chǎn)物被打印在紙條圓形區(qū)域上的匹配DNA探針捕獲.

Didar和Filipe等［63］設(shè)計(jì)了一種食品包裝袋上的生物傳感器，旨在將細(xì)菌特異性響應(yīng)的RFD組裝到食品包裝袋上，以提供食品包裝袋上細(xì)菌污染情況的實(shí)時(shí)評估.如圖5所示，該傳感器通過將RFDEC1與透明的環(huán)烯烴聚合物薄膜共價(jià)連接，結(jié)合其分子識別和信號生成的雙重功能，實(shí)現(xiàn)食品包裝袋上大腸桿菌的即時(shí)檢測［63］.研究證明，這種生物傳感器在各種pH（pH=3~9）條件下能在14 d甚至更長時(shí)間保持穩(wěn)定，并且還能在肉和蘋果汁中實(shí)現(xiàn)大腸桿菌的即時(shí)檢測，檢測限低至103CFU/mL，為預(yù)防和降低食源性疾病對公共衛(wèi)生的負(fù)面影響帶來了新的思路和方法.

Fig.4 Schematic illustration of the envisioned paper device with the DNAzyme sensor[59]

Fig.5 Illustration of highly sensitive DNAzyme sensors cleaving in the presence of live E.coli cells[63]

檢測極低濃度細(xì)菌的能力對于疾病的早期診斷也尤其重要.為了達(dá)成這一目標(biāo)，通常需要結(jié)合信號放大策略.RCD中RNA的切割會導(dǎo)致兩個(gè)較短核酸片段的分離，為偶聯(lián)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)平臺提供了方便的途徑.RCA能在短時(shí)間等溫?cái)U(kuò)增大量DNA分子［64~67］，并且不需要特殊設(shè)備.因此，Li等［68］將大腸桿菌作為模型細(xì)菌，利用RCA放大RFD-EC1的裂解作用，用于大腸桿菌的超靈敏檢測.如圖6（A）所示，檢測體系包括特異性識別大腸桿菌的RFD-EC1和兩個(gè)機(jī)械互鎖拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的環(huán)狀核酸，其中一個(gè)環(huán)包含RFD-EC1的裂解位點(diǎn).在大腸桿菌存在的時(shí)候，包含RFD-EC1裂解位點(diǎn)的環(huán)發(fā)生線性化，成為RCA的引物，另一個(gè)環(huán)成為RCA的模板，從而實(shí)現(xiàn)RCA.該傳感系統(tǒng)能夠快速檢測10 CFU/mL的大腸桿菌［68］.RCD與RCA還能組成交叉放大系統(tǒng)，如圖6（B）所示，該系統(tǒng)依賴于兩個(gè)DNA復(fù)合物（復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ）的預(yù)組裝.復(fù)合物Ⅰ由一個(gè)DNA引物和一個(gè)包含RCD反義序列的環(huán)狀DNA模板組成.復(fù)合物Ⅱ包含相同的環(huán)狀DNA和RCD的底物.該過程始于復(fù)合物Ⅰ上的RCA，產(chǎn)生大量的RCD，這些RCD繼續(xù)裂解復(fù)合物Ⅱ的RCD底物，裂解產(chǎn)物隨后又轉(zhuǎn)化為RCA的引物.這種新的放大系統(tǒng)被稱為反饋擴(kuò)增，成功實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌的超靈敏檢測，在無細(xì)菌培養(yǎng)步驟的情況下，檢測限低至10 CFU/mL［69］.近期，Li等［70］還報(bào)道了一種雙脫氧核酶功能的全DNA傳感系統(tǒng)，用于大腸桿菌的超靈敏檢測.如圖6（C）所示，該傳感系統(tǒng)包括了RCD介導(dǎo)的RNA裂解（DRC）、組裝介導(dǎo)的鏈釋放（ASR）、催化發(fā)夾組裝（CHA）和裂解G4重組（SGR）.在沒有靶標(biāo)的情況下，含有RNA的DNA底物可以與特殊設(shè)計(jì)的DNA結(jié)合形成4WJ結(jié)構(gòu)，釋放出DNA5，使其成為CHA的觸發(fā)器，用于信號放大，產(chǎn)生許多具有過氧化物酶活性的G4脫氧核酶，它們與原卟啉Ⅸ結(jié)合產(chǎn)生熒光信號.在靶標(biāo)細(xì)菌存在的情況下，包含RNA的DNA底物被裂解，從而在DRC過程中終止整個(gè)反應(yīng).這種RCD與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RCA，CHA）相結(jié)合的方法能夠在恒溫條件下快速地生成大量的DNA擴(kuò)增子，實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)的快速靈敏檢測［70］.

Fig.6 DNAzyme sensors coupled with isothermal amplification strategies for bacteria detection

除了上述由全DNA構(gòu)成的生物傳感器以外，無機(jī)納米材料作為催化劑也融入到了致病菌生物傳感器的構(gòu)建中.Zhang和Qi等［71］研究了一種以細(xì)菌響應(yīng)型RCD為識別元件，DNA模板銀納米團(tuán)簇為熒光信號輸出元件用于大腸桿菌檢測的DNA傳感器系統(tǒng).如圖7（A）所示，RCD在大腸桿菌裂解液中被激活，產(chǎn)生含有乙酰膽堿酯酶的裂解片段，磁性分離以后，將其轉(zhuǎn)移到含有DNA模板銀納米團(tuán)簇和乙酰膽堿的溶液中，乙酰膽堿被催化生成膽堿，通過膽堿中硫原子與銀原子形成的Ag―S鍵與DNA模板銀納米團(tuán)簇反應(yīng)，顯著增強(qiáng)DNA模板銀納米團(tuán)簇的熒光，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)細(xì)菌的超靈敏檢測，檢測限低至60 CFU/mL，并且可用于環(huán)境樣品中大腸桿菌的檢測.Xu等［72］開發(fā)了一種結(jié)合磁珠、RCD和銅納米團(tuán)簇的熒光生物傳感器，用于檢測大腸桿菌O157∶H7.如圖7（B）所示，RCD與鏈霉親和素磁珠連接，被大腸桿菌裂解液激活進(jìn)行裂解反應(yīng).裂解片段引起RCA反應(yīng).在硫酸銅和抗壞血酸鈉的存在下，Cu2+可以與堿基上的特定位點(diǎn)結(jié)合，生成銅納米團(tuán)簇.在紫外光照射下，銅納米團(tuán)簇可發(fā)出紅光實(shí)現(xiàn)快速檢測，檢測限低至1.57 CFU/mL.該傳感器對純飲用水和蘋果汁中的大腸桿菌檢測均有較好的實(shí)用性，在致病菌檢測方面具有很大的應(yīng)用價(jià)值和潛力.

Fig.7 DNAzyme?based fluorescent sensors for bacteria detection

2.2 基于細(xì)菌響應(yīng)型RCD的比色生物傳感器

由于RCD具有催化活性，且易于修飾，因此可以將能夠?qū)崿F(xiàn)比色信號轉(zhuǎn)換的分子與RCD偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)催化反應(yīng)過程中的視覺信號轉(zhuǎn)換.如Tram等［73］將尿素水解酶與細(xì)菌特異性響應(yīng)的RCD相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌的比色法檢測.如圖8（A）所示，將細(xì)菌特異性響應(yīng)的RCD的一端固定在磁珠上，另一端通過堿基互補(bǔ)與連接有尿素酶的DNA相結(jié)合.在靶標(biāo)細(xì)菌存在下，RCD發(fā)生切割反應(yīng)，從裂解片段中磁性分離出含有尿素酶的片段，將其帶入含有的尿素和石蕊（酚紅指示劑）的溶液中，尿素酶水解尿素，使溶液pH值升高，最終導(dǎo)致酚紅指示劑的顏色由黃色變?yōu)榧t色，從而實(shí)現(xiàn)比色檢測.該方法在2 h內(nèi)可檢測出500 CFU/mL大腸桿菌.該檢測體系將細(xì)菌信號轉(zhuǎn)化為pH相關(guān)的比色信號，為細(xì)菌檢測提供了一種簡單且低成本的方法［74，75］.基于同樣的原理，Ali等［41］利用幽門螺桿菌特異性響應(yīng)的RCD，構(gòu)建了便攜式紙基傳感器［圖8（B）］，該傳感器檢出限為104CFU/mL，并且對糞便標(biāo)本中幽門螺桿菌的檢測具有很強(qiáng)的特異性和靈敏度，為基于RCD的紙基傳感器應(yīng)用于復(fù)雜樣品中致病菌的檢測奠定了基礎(chǔ).

Liu等［76］設(shè)計(jì)了一種結(jié)合RCD和RCA的集成式折紙傳感器用于檢測大腸桿菌.該傳感器由3部分組成，首先是用于細(xì)菌細(xì)胞裂解產(chǎn)物的收集區(qū)域，接著是由多個(gè)對大腸桿菌特異性響應(yīng)的RCD組成的DNA納米花用于分子識別，最后是可以發(fā)生RCA和比色反應(yīng)的信號放大和顯示區(qū).將此折紙傳感器折疊以后，RCD會被激活發(fā)生裂解，裂解產(chǎn)物將會作為RCA反應(yīng)的引物發(fā)生RCA，RCA產(chǎn)物中具有過氧化氫酶活性的G4脫氧核酶在血紅素存在的情況下氧化顯色底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）產(chǎn)生比色信號.該傳感器能在35 min的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對大腸桿菌的檢測，檢出限為103CFU/mL，并且能對果汁、牛奶等復(fù)雜樣品基質(zhì)中的大腸桿菌進(jìn)行快速靈敏檢測.該集成式折紙傳感器無需設(shè)備即可進(jìn)行檢測，在快速、靈敏、高選擇性地檢測致病菌方面具有巨大的潛力.

Fig.8 Schematic diagram of the litmus test for bacteria detection

2.3 基于細(xì)菌響應(yīng)型RCD的其它類型生物傳感器

Tang等［77］將細(xì)菌響應(yīng)型RCD與等離激元相結(jié)合，以大腸桿菌作為檢測模型，構(gòu)建了一種新型的納米等離子體生物傳感器用于致病菌的檢測.如圖9所示，RCD被連接到鏈霉親和素磁性珠上，在大腸桿菌裂解液存在時(shí)被激活進(jìn)行裂解反應(yīng).裂解后的RCD殘基附著在磁珠上，引發(fā)兩個(gè)發(fā)夾寡核苷酸之間的雜交鏈反應(yīng)（HCR）.通過生物素-鏈霉親和素相互作用，將多個(gè)葡萄糖氧化酶固定在DNA雙螺旋的缺口位點(diǎn)上，它們與三角形銀納米板混合均勻，葡萄糖氧化酶可以將葡萄糖轉(zhuǎn)化為過氧化氫和葡萄糖酸.過氧化氫可以有效地腐蝕藍(lán)色的三角形銀納米板，使其生成更小的球形銀納米粒子，導(dǎo)致藍(lán)色快速褪去，從而實(shí)現(xiàn)檢測大腸桿菌的目的.此傳感器利用細(xì)菌特異性響應(yīng)的RCD作為分子識別元件，酶響應(yīng)等離子體納米顆粒局部表面等離子體共振（LSPR）作為信號讀出，可檢測濃度低至50 CFU/mL的大腸桿菌，甚至在復(fù)雜樣品基質(zhì)（如河水、蘋果汁和牛奶等）也能進(jìn)行檢測.

近期，Li和Soleymani等［78］報(bào)道了一種將細(xì)菌特異性響應(yīng)RCD與電化學(xué)方法相結(jié)合，快速檢測尿路感染中大腸桿菌的便攜性生物傳感器.如圖10所示，RCD作為識別元件，當(dāng)靶標(biāo)細(xì)菌存在時(shí)，發(fā)生切割釋放DNA條形碼，將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到雙通道電子芯片上.此傳感器將RCD和雙通道電化學(xué)芯片結(jié)合，使得差分電化學(xué)信號傳輸成為可能，同時(shí)也提供了臨床分析所需的分析靈敏度和特異性.此傳感器能夠從包含多種非特異性細(xì)菌種類的面板中選擇性地檢測103CFU/mL大腸桿菌.并且對41例患者的尿液樣本進(jìn)行臨床評估表明，與目前使用的基于細(xì)菌培養(yǎng)方法需要數(shù)小時(shí)的分析時(shí)間相比，該方法在不到1 h分析時(shí)間內(nèi)的診斷敏感性為100%，特異性為78%，非常有望進(jìn)一步應(yīng)用于臨床診斷中.

Fig.9 Schematic diagram of DNAzyme?integrated plasmonic nanosensors for bacteria detection[77]

Fig.10 Illustration of DNAzymes integrated with electrical readout for rapid and culture?free bacterial detection using a handheld platform[78]

3 總結(jié)與展望

致病菌引起的傳染病對人類健康構(gòu)成巨大威脅，細(xì)菌響應(yīng)型RCD由于其特異性高、穩(wěn)定性好、易于修飾等優(yōu)點(diǎn)，為開發(fā)快速、簡便且可靠的致病菌檢測方法提供了強(qiáng)有力的工具.隨著體外篩選技術(shù)的發(fā)展，越來越多針對不同致病菌的RCD被篩選得到，為更多致病菌的快速檢測帶來了希望.本文綜述了細(xì)菌響應(yīng)型RCD體外篩選技術(shù)的發(fā)展及其在致病菌檢測方面的最新進(jìn)展.

盡管細(xì)菌響應(yīng)型RCD作為信號識別和轉(zhuǎn)導(dǎo)元件，在致病菌的檢測方面取得了很好的進(jìn)展，但實(shí)現(xiàn)細(xì)菌響應(yīng)型RCD真正的實(shí)際應(yīng)用仍然面臨許多挑戰(zhàn)和機(jī)遇.（1）細(xì)菌響應(yīng)型RCD在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，易受到環(huán)境中干擾物或核酸酶的影響，因此需要綜合評價(jià)其在不同復(fù)雜樣品基質(zhì)中對靶標(biāo)的特異性、靈敏度以及穩(wěn)定性等特征.（2）細(xì)菌檢測具有挑戰(zhàn)性，不僅因?yàn)闄z測需要面對非常復(fù)雜的樣品，而且還需要很高的檢測靈敏度.對于食物或水傳播的致病菌，一個(gè)CFU就足以可能造成危害.因此，細(xì)菌檢測傳感系統(tǒng)往往需要納入一些信號放大的策略，包括等溫?cái)U(kuò)增［79~81］、納米酶［82~87］、場效應(yīng)晶體管［88~90］等技術(shù)以提高檢測靈敏度.（3）實(shí)際應(yīng)用需要考慮生物傳感器的成本和易用性，特別是用于環(huán)境監(jiān)測和家庭生活的傳感器，檢測結(jié)果應(yīng)該容易獲得和解釋.將基于細(xì)菌響應(yīng)型RCD的信號輸出與目前已經(jīng)商業(yè)化的血糖儀［91］或妊娠試紙條［92］等檢測方法相結(jié)合，可以使檢測更加便捷.（4）細(xì)菌響應(yīng)型RCD的進(jìn)一步應(yīng)用需要對其結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制有更深入的了解，以便更好地開發(fā)新的細(xì)菌響應(yīng)型RCD，同時(shí)更容易優(yōu)化反應(yīng)條件和催化動力學(xué).這一領(lǐng)域正在取得重大進(jìn)展，如可以用分子模擬［93］或X射線晶體學(xué)［94］來確定RCD的三維結(jié)構(gòu).（5）近年來，針對細(xì)菌響應(yīng)型RCD的篩選策略不斷發(fā)展和完善，新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌響應(yīng)型RCD的種類越來越豐富，這也促進(jìn)了其作為一種新型生物傳感器的應(yīng)用.但目前篩選過程仍較繁瑣且耗時(shí)，如何借助微流控［95~97］等微納技術(shù)實(shí)現(xiàn)RCD的高通量和自動化篩選，是未來需要進(jìn)一步解決的問題.隨著技術(shù)的發(fā)展、機(jī)理的完善和應(yīng)用的革新，基于細(xì)菌響應(yīng)型RCD的致病菌檢測技術(shù)會進(jìn)一步在食品安全、環(huán)境檢測和疾病監(jiān)控領(lǐng)域獲得更大的應(yīng)用.