缺氧響應(yīng)熒光探針的成像及治療應(yīng)用

諶委菊，陳詩雅，薛曹葉，劉 波，鄭 晶

（1.長沙理工大學(xué)分析測試中心，細(xì)胞化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長沙410114；2.湖南大學(xué)化學(xué)生物傳感與計量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長沙410082；3.湖南省體育科學(xué)研究所,長沙410005；4.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,長沙410008）

缺氧（Hypoxia）作為腫瘤和中風(fēng)等疾病的重要特征之一，主要是指因組織的氧氣供應(yīng)不足或用氧障礙，最終導(dǎo)致組織的代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化的病理過程［1，2］.隨著腫瘤區(qū)域中實(shí)體瘤的過度生長，遠(yuǎn)離血管的內(nèi)部細(xì)胞中的氧氣消耗量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出其血液供應(yīng)量，這就造成了腫瘤內(nèi)的缺氧.在缺氧環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞會通過基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)過程的改變來適應(yīng)這一惡劣環(huán)境［3］.此外，缺氧還會誘發(fā)細(xì)胞凋亡和自噬等變化［4~6］.在臨床上，缺氧常被視為腫瘤預(yù)后的不利因素.與常氧細(xì)胞相比，血液供應(yīng)不足會導(dǎo)致化療藥物難以在缺氧腫瘤細(xì)胞中富集；即便有部分化療藥物能夠抵達(dá)缺氧區(qū)域，其藥效也會因其在缺氧環(huán)境中形成的活性物質(zhì)減少及與DNA分子的親和作用減弱而顯著降低［7~9］.因此，腫瘤缺氧環(huán)境的精準(zhǔn)成像對腫瘤的診斷和后續(xù)治療具有重要的指導(dǎo)意義.

在腫瘤缺氧微環(huán)境中，還原應(yīng)激會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)偶氮還原酶、硝基還原酶及醌還原酶等生物還原酶含量顯著增加［10~12］，這些生物還原酶可以使偶氮鍵、硝基和醌等官能團(tuán)還原［13］.目前，已有磁共振成像、單光子發(fā)射計算機(jī)斷層掃描、正電子發(fā)射斷層掃描和免疫組織化學(xué)等多種成像技術(shù)基于此類生物還原反應(yīng)進(jìn)行缺氧成像［14~16］.但這類技術(shù)存在信噪比低、精度不高、存在有害輻射及收集圖像慢等缺陷，在腫瘤缺氧成像應(yīng)用中具有一定的局限性.與傳統(tǒng)的成像方法相比，熒光成像技術(shù)具有靈敏度高、無創(chuàng)及操作簡便等優(yōu)勢，近年來逐漸成為熱門成像方法［17］.基于此，研究者們構(gòu)建了多種缺氧響應(yīng)熒光探針用于腫瘤成像及治療.本文從代表性的缺氧響應(yīng)基團(tuán)出發(fā)，介紹了缺氧響應(yīng)熒光探針的響應(yīng)機(jī)制，并著重總結(jié)缺氧響應(yīng)熒光探針在成像及治療方面的研究進(jìn)展.

1 代表性的缺氧響應(yīng)基團(tuán)

缺氧響應(yīng)基團(tuán)作為缺氧響應(yīng)熒光探針的識別單元，能與細(xì)胞中缺氧相關(guān)的生物還原酶發(fā)生反應(yīng).常見的缺氧響應(yīng)基團(tuán)有硝基、偶氮鍵和醌等，在缺氧微環(huán)境中這些基團(tuán)可以接受電子并被還原.

1.1 硝 基

缺氧微環(huán)境中，在電子供體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的存在下，硝基芳族衍生物是硝基還原酶的良好底物.硝基能被還原成亞硝基和羥胺，生成的羥胺能繼續(xù)被還原為伯胺［18］.同時，由于硝基為強(qiáng)吸電子基團(tuán)，可以作為有效的熒光猝滅劑［19］.

Li等［20］設(shè)計了一種基于硝基呋喃的缺氧響應(yīng)熒光分子探針.由圖1可見，5-硝基呋喃基團(tuán)作為缺氧響應(yīng)單元與信號單元試鹵靈通過醚鍵交聯(lián).在常氧條件下，該分子探針的熒光被硝基猝滅；在缺氧環(huán)境下，過表達(dá)的硝基還原酶將5-硝基呋喃基團(tuán)還原，試鹵靈分子通過消除重排反應(yīng)釋放出來，熒光信號得到恢復(fù).該探針具有極高的靈敏度，對硝基還原酶的檢出限達(dá)到0.27 ng/mL，能夠有效區(qū)分常氧及缺氧細(xì)胞.

Fig.1 Schematic illustration of nitrofuran?based probe for imaging of hypoxia[20]

與傳統(tǒng)熒光探針相比，近紅外熒光探針具有組織穿透能力強(qiáng)及背景干擾小等優(yōu)勢［21~23］，F(xiàn)an等［24］報道了一種基于硝基苯的近紅外熒光探針用于細(xì)胞缺氧成像.由圖2可見，缺氧響應(yīng)單元硝基苯與熒光信號單元硼二吡咯亞甲基共價連接在一起，同時采用脂質(zhì)體作為分子探針的載體以提高探針的生物相容性.在常氧環(huán)境中，硝基苯通過光致電子轉(zhuǎn)移（PET）作用猝滅熒光團(tuán)的信號；在缺氧條件下，硝基還原酶將硝基苯還原為氨基苯，阻斷PET過程，熒光得到恢復(fù).該探針激發(fā)波長紅移至640 nm，實(shí)現(xiàn)了小鼠模型缺氧水平的實(shí)時成像，具有廣闊的應(yīng)用前景.

Fig.2 Schematic illustration of nitrobenzene?based probe for NTR imaging of hypoxia[24]

1.2 偶氮鍵

在缺氧環(huán)境中，過表達(dá)的偶氮還原酶和NADPH能將偶氮鍵切斷，并使其還原形成胺類化合物［25，26］.Kiyose等［27］設(shè)計了首個基于偶氮基團(tuán)的熒光小分子探針用于細(xì)胞及活體的缺氧成像.由圖3可見，該分子探針用近紅外染料二羰花菁作為熒光信號單元，黑洞猝滅劑BHQ3作為缺氧響應(yīng)單元.在常氧環(huán)境下，含有偶氮鍵的BHQ3通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）猝滅二羰花菁的熒光；在缺氧條件下，過表達(dá)的偶氮還原酶將BHQ3的偶氮鍵切斷還原，二羰花菁熒光得以恢復(fù).基于此原理，研究者們還設(shè)計了多種基于偶氮鍵的熒光探針［28~30］.

Fig.3 Design strategy of azo?based probe for imaging of hypoxia[27]

Fig.4 Detection mechanism of quinone?based probe for imaging of hypoxia[33]

1.3 醌

醌具有形成完整芳香族結(jié)構(gòu)的傾向.在醌還原酶存在下，醌易被還原形成對苯二酚.即，醌在還原酶作用下得到1個電子被還原為半醌基，生成的半醌基不穩(wěn)定，繼續(xù)得到1個電子被還原為對苯二酚［31］.另外，醌具有強(qiáng)吸電子效應(yīng)，可以作為多種熒光染料的猝滅劑，而還原產(chǎn)物對苯二酚是有效的電子供體，因此醌被還原后將恢復(fù)熒光團(tuán)的熒光［32］.

基于以上原理，研究者們設(shè)計了多種缺氧型熒光探針用于細(xì)胞成像［33~35］.Sun等［33］設(shè)計了一種基于苯醌基團(tuán)的缺氧小分子探針用于細(xì)胞成像.由圖4可見，該探針中含有苯醌基團(tuán)的有機(jī)物與三價銥離子發(fā)生配位作用形成絡(luò)合物，苯醌基團(tuán)作為缺氧響應(yīng)單元可猝滅配合物的熒光.在常氧環(huán)境下，由于苯醌基團(tuán)的強(qiáng)猝滅作用，無法檢測到三價銥配合物的熒光信號；在缺氧環(huán)境下，高表達(dá)的醌還原酶將醌還原為苯酚，猝滅作用消失，探針的熒光信號得到恢復(fù).

2 缺氧響應(yīng)熒光探針的成像應(yīng)用

在腫瘤缺氧微環(huán)境中，由缺氧誘導(dǎo)的多種生理變化與腫瘤的發(fā)展、擴(kuò)散密切相關(guān)，因此，構(gòu)建缺氧響應(yīng)的熒光探針用于腫瘤標(biāo)志物成像對實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷和預(yù)后評估具有重要意義.

2.1 單個缺氧相關(guān)物質(zhì)成像

細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)如偶氮還原酶和硝基還原酶等的表達(dá)水平可以反映該細(xì)胞內(nèi)的缺氧程度.因此，對這類物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確及時的成像有助于人們判斷腫瘤區(qū)域內(nèi)的缺氧狀態(tài)，為后續(xù)的治療提供指導(dǎo).迄今，研究人員已開發(fā)出多種缺氧響應(yīng)熒光探針用于細(xì)胞內(nèi)單個缺氧相關(guān)物質(zhì)成像［36~39］.Zhang等［39］報道了一種基于陽離子共軛聚合物的熒光探針用于活細(xì)胞缺氧成像.由圖5可見，該設(shè)計利用對硝基苯作為缺氧響應(yīng)單元，并將其修飾在聚合物的側(cè)鏈.在常氧條件下，側(cè)鏈的硝基苯基于PET作用猝滅主鏈熒光團(tuán)的熒光；在缺氧條件下，過表達(dá)的硝基還原酶將硝基苯還原生成氨基苯隨即阻斷PET過程，從而使該探針的熒光信號得到恢復(fù).

Fig.5 Schematic presentation of nitroreductase?related probe for hypoxia imaging[39]

Fig.6 Scheme of intracellular mitochondria?targeted pH and hypoxia sensing[40]

2.2 多種缺氧相關(guān)物質(zhì)成像

目前報道的缺氧響應(yīng)熒光探針大多僅針對單個缺氧相關(guān)參數(shù)作出響應(yīng)，然而在實(shí)際缺氧環(huán)境中常常伴隨著多參數(shù)的變化.因此，開發(fā)能夠?qū)Χ喾N缺氧相關(guān)物質(zhì)作出響應(yīng)的熒光探針具有重要意義.

Lan等［40］開發(fā)了一種基于納米金屬有機(jī)框架物（MOF）的比率型熒光探針用于缺氧和酸度變化的同時成像.由圖6可見，該探針通過將釕的有機(jī)配合物4，4′-二苯酸基-2，2′-聯(lián)吡啶（DBB-Ru，低氧敏感性染料）、熒光素（FITC，酸堿度敏感性染料）和羅丹明異硫氰酸酯（RITC，酸堿度和低氧敏感性染料）包埋入MOF支架中得到熒光納米探針.隨著氧氣濃度的降低，DBB-Ru的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng).同時，隨著酸性減弱，F(xiàn)ITC的熒光信號增強(qiáng).基于FITC與RITC的熒光變化，該探針可對活細(xì)胞內(nèi)酸度變化進(jìn)行成像.

2.3 缺氧相關(guān)生理過程成像

除上述由還原應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)含量變化之外，缺氧還會引起細(xì)胞凋亡、自噬和線粒體吞噬等生理或病理變化［41~44］.由于活性氧水平的提高，缺氧狀態(tài)下細(xì)胞可能發(fā)生線粒體自噬，在自噬過程中線粒體本身會發(fā)生一系列生理變化，如pH降低和極性增強(qiáng)等［45］.因此，探究缺氧環(huán)境下線粒體的自噬過程具有重要意義.

近年來，已有多篇文獻(xiàn)報道缺氧響應(yīng)熒光探針用于線粒體吞噬過程成像［46，47］.本課題組［46］報道了一種偶氮還原酶響應(yīng)的熒光探針用于細(xì)胞內(nèi)缺氧誘導(dǎo)的線粒體自噬成像.由圖7（A）可見，偶氮苯作為缺氧響應(yīng)單元插入聚合物膠束中自組裝形成兩親性聚合物膠束，同時將pH敏感的線粒體靶向熒光染料螺并吡喃衍生物（Mito-rHP）裝載進(jìn)膠束中.在缺氧細(xì)胞中，膠束被過表達(dá)的偶氮還原酶還原分解，釋放出線粒體靶向染料Mito-rHP.由圖7（B）可見，Mito-rHP進(jìn)入線粒體后，熒光強(qiáng)度隨著pH值降低而增強(qiáng)，最終實(shí)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的線粒體自噬過程成像.

Fig.7 Schematic illustration of azo?based amphiphilic polymer and its work principle in hypoxia cell(A)and confocal fluorescence microscopy imaging of cells incubated with polymer under different treatments(B)[46]

Fig.8 Schematic diagram of NIR probe for visualization of hypoxia induced mitophagy(A)and fluorescence images for tracking hypoxia induced mitophagy process(B)[47]

如前所述，近紅外熒光探針在成像中具有獨(dú)特優(yōu)勢.基于此，Liu等［47］構(gòu)建了一種缺氧響應(yīng)的近紅外熒光探針用于實(shí)時監(jiān)測線粒體自噬.由圖8（A）可見，該探針中近紅外染料的羥基與硝基苯共價相連用來猝滅其熒光.探針的正電特性使其具有良好的線粒體靶向作用.在缺氧環(huán)境下，硝基苯被細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的硝基還原酶還原，而后恢復(fù)近紅外染料在710 nm處的熒光.在線粒體自噬過程中，隨著pH值降低，去保護(hù)的近紅外染料進(jìn)一步質(zhì)子化，使其在710 nm處的熒光減弱而650 nm處的熒光增強(qiáng).如圖8（B）所示，通過測定其熒光變化可以實(shí)現(xiàn)在缺氧環(huán)境下線粒體自噬過程的監(jiān)測.

3 缺氧響應(yīng)熒光探針的治療應(yīng)用

缺氧是腫瘤微環(huán)境最顯著的特征之一，當(dāng)病人出現(xiàn)典型的缺氧癥狀后，必須接受有效的治療.目前已有的治療方法中仍有一些問題亟待解決［48］：（1）缺氧細(xì)胞遠(yuǎn)離血管，治療藥物無法有效遞送至目標(biāo)區(qū)域；（2）缺氧環(huán)境誘導(dǎo)某些與耐藥性相關(guān)的基因過表達(dá)，導(dǎo)致治療效果不佳.為克服以上障礙，研究者們利用缺氧環(huán)境陸續(xù)開發(fā)了多種性能優(yōu)良的熒光探針用于腫瘤治療.

3.1 基因治療

基因治療廣泛應(yīng)用于先天及后天的多類疾?。?9］.為提高干擾RNA（siRNA）運(yùn)載效率，避免其在血液循環(huán)中降解，研究者們主要借助納米材料運(yùn)載siRNA.而在腫瘤微環(huán)境中，如何實(shí)現(xiàn)siRNA的刺激響應(yīng)釋放是提高療效的關(guān)鍵因素.

Perche等［50］首次報道了一種缺氧響應(yīng)的熒光探針用于靶向siRNA傳遞.由圖9可見，該探針由聚乙二醇（PEG）、聚乙烯亞胺（PEI）、偶氮苯和1，2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺（DOPE）4部分自組裝而成.偶氮苯作為缺氧響應(yīng)開關(guān)連接PEG與PEI-DOPE聚合鏈，加入siRNA后自組裝形成聚合物納米顆粒.在缺氧微環(huán)境中，過表達(dá)的偶氮還原酶切斷偶氮鍵，納米顆粒解散，瞬間釋放大量siRNA.該納米探針實(shí)現(xiàn)了在特定缺氧環(huán)境釋放siRNA，有效降低了對正常組織的毒副作用.

Fig.9 Hypoxia?responsive nanoprobe for gene therapy[50]

3.2 光動力學(xué)治療

光動力學(xué)治療的主要機(jī)理是通過光照使光敏劑產(chǎn)生活性氧，隨即利用活性氧殺死癌細(xì)胞，具有無創(chuàng)、副作用小等優(yōu)勢，在腫瘤治療中備受青睞［51~54］.在光動力學(xué)治療過程中，通常利用腫瘤缺氧環(huán)境中過表達(dá)的偶氮還原酶、硝基還原酶等實(shí)現(xiàn)光敏劑的特異性釋放［55~58］.

Li等［56］設(shè)計了一種雙刺激響應(yīng)的熒光探針用于腫瘤的光動力學(xué)治療.由圖10（A）可見，該探針通過偶氮鍵將親水性甲氧聚乙二醇（mPEG）和修飾有咪唑基團(tuán)的聚天冬氨酸聚合物（PAsp-IM）連接在一起，自組裝形成膠束，二氫卟吩E6（Ce6）作為光敏劑包裹在膠束里面，其中偶氮鍵和咪唑基團(tuán)分別作為缺氧和單線態(tài)氧的響應(yīng)基團(tuán).當(dāng)膠束到達(dá)缺氧環(huán)境中，偶氮鍵被過表達(dá)的偶氮還原酶切斷，表面的mPEG鏈釋放出來，膠束部分解散.在近紅外光照射下，單線態(tài)氧與咪唑基團(tuán)反應(yīng)，PAsp-IM端的親水性增強(qiáng)，膠束快速解散，瞬間釋放出大量的Ce6用于光動力治療.由圖10（B）可見，該探針巧妙地設(shè)計了偶氮苯和咪唑基團(tuán)兩個識別位點(diǎn)，利用反應(yīng)后膠束的電荷及親疏水性變化，能夠有效提高其細(xì)胞內(nèi)吞效率及光敏劑的釋放速率.

Fig.10 Illustration of hypoxia?sensitive micelles for photodynamic therapy(A)and fluorescent imaging of tumor organs and healthy organs under different treatment(B)[56]

Fig.11 Schematic illustration of the azoreductase?responsive,mitochondrion?targeted probe for hypoxia imaging and enhanced PDT(A)and the therapy efficacy of the mitochondrion?targeted probe in representative mice(B)[57]

最近，本課題組［57］構(gòu)建了一種缺氧響應(yīng)的線粒體靶向核酸探針，用于細(xì)胞內(nèi)成像及光動力學(xué)治療.由圖11（A）可見，該探針由2條短的DNA鏈H1和H2通過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)自組裝形成長鏈.其中，H1的一端標(biāo)記線粒體靶向基團(tuán)花菁染料Cy3，H2的一端標(biāo)記缺氧響應(yīng)染料BHQ2；另一端則設(shè)計為富G序列，用來裝載光敏劑四（1-甲基吡啶嗡-4-基）卟吩對甲苯磺酸鹽（TMPyP4）.在常氧環(huán)境下，BHQ2通過FRET猝滅Cy3的熒光.在腫瘤缺氧微環(huán)境中，過表達(dá)的偶氮還原酶切斷BHQ2的偶氮鍵，其猝滅作用消失，Cy3的熒光得到恢復(fù).此外，由于Cy3的靶向作用，載有光敏劑TMPyP4的DNA長鏈能夠快速富集在線粒體內(nèi).由圖11（B）可見，在光照條件下，探針產(chǎn)生大量活性氧用來殺傷癌細(xì)胞，結(jié)合線粒體的靶向作用，探針可以有效提高光動力學(xué)治療效果.

3.3 化學(xué)治療

化療是目前臨床腫瘤治療中最常用的手段之一.抗癌藥物通過血液循環(huán)能夠抵達(dá)身體的各個部位［59~61］.由于化療藥物自身的選擇性不強(qiáng)，在殺滅癌細(xì)胞的同時也會不可避免地?fù)p傷人體正常的細(xì)胞.為降低毒副作用、實(shí)現(xiàn)更加高效的藥物運(yùn)載，研究人員利用腫瘤缺氧微環(huán)境設(shè)計分子開關(guān)用于載藥體系［62~65］.

Liu等［64］開發(fā)了一種缺氧響應(yīng)的載藥體系用于腫瘤的化學(xué)治療.由圖12（A）可見，該探針由化療藥物5-脫氧氟尿苷（FDU）、熒光染料前體4'-二乙胺基-1，1'-連二苯-2-羧酸（DB）和缺氧響應(yīng)基團(tuán)4-硝基苯共價連接而成.在腫瘤缺氧微環(huán)境中，過表達(dá)的硝基還原酶將硝基苯還原，并發(fā)生消除重排反應(yīng)釋放出化療藥物FDU；同時，熒光染料前體DB去保護(hù)生成7-二乙胺基-香豆素（CM）發(fā)出熒光，用于實(shí)時監(jiān)測藥物釋放過程.由圖12（B）可見，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該體系具有良好的治療效果.

Fig.12 Schematic illustration for triggered release of hypoxia?responsive drug delivery system(A)and the therapy efficacy of the drug delivery system after different treatment(B)[64]

Fig.13 Schematic illustration of the targeted DOX?oaded polymersomes for chemotherapy(A)and representative images of the MCF7 cells with different treatment(B)[65]

上述探針能夠?qū)崿F(xiàn)刺激響應(yīng)藥物釋放，但由于某些正常細(xì)胞也含有一定的缺氧相關(guān)物質(zhì)，因此載體抵達(dá)腫瘤細(xì)胞前不可避免地會有部分藥物提前釋放.針對這一不足，通過引入具有特定靶向作用的載藥系統(tǒng)能夠有效解決該問題.Mamnoon等［65］構(gòu)建了一種缺氧響應(yīng)的靶向載藥體系用于乳腺癌細(xì)胞的化學(xué)治療.由圖13（A）可見，該探針主要由聚乳酸（PLA）、聚乙二醇（PEG）、偶氮苯及雌二醇自組裝形成聚合物囊泡.其中，偶氮苯作為響應(yīng)基團(tuán)連接PLA和PEG，雌二醇作為靶向基團(tuán)能夠與乳腺癌細(xì)胞表面過表達(dá)的雌激素受體特異性識別.此外，化療藥物DOX被物理包埋入囊泡中.當(dāng)藥物載體被特異性靶向到乳腺癌細(xì)胞后，偶氮苯被缺氧環(huán)境中過表達(dá)的偶氮還原酶切斷，導(dǎo)致聚合物囊泡解散，藥物被有效地釋放出來.由圖13（B）可見，該載藥體系具有良好的靶向作用，可有效降低毒副作用，明顯提高療效.

3.4 協(xié)同治療

在復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境中，以上單一的治療方案因各自的局限性而無法起到完全治愈腫瘤的效果.近年來，研究者們陸續(xù)構(gòu)建了多種具有協(xié)同治療效果的缺氧響應(yīng)探針，以提高療效，降低毒副作用［66~69］.Wang等［66］設(shè)計了一種缺氧響應(yīng)的熒光探針，用于腫瘤的化療及光動力學(xué)協(xié)同治療.由圖14（A）可見，該探針主要由以下幾部分自組裝而成：疏水端為生物可降解的聚己內(nèi)酯（PCL），親水端為修飾有光敏劑二氫卟吩E6（Ce6）的聚乙二醇（簡稱Ce6-PEG），缺氧響應(yīng)基團(tuán)偶氮苯將PCL和Ce6-PEG連接起來，自組裝形成聚合物納米顆粒.此外，化療藥物DOX被包埋進(jìn)入聚合物納米顆粒內(nèi)部.納米顆粒進(jìn)入腫瘤缺氧微環(huán)境后，過表達(dá)的偶氮還原酶將偶氮鍵切斷，導(dǎo)致納米顆粒解散，DOX被釋放出來；同時，外部光照刺激產(chǎn)生的單線態(tài)氧能夠進(jìn)行光動力學(xué)治療，而光動力學(xué)治療可以進(jìn)一步加劇腫瘤微環(huán)境的缺氧程度，有助于提高納米顆粒的解散速度，最終加快藥物的釋放速率.由圖14（B）可見，通過小鼠模型證實(shí)該探針相比于單一治療手段顯著提高了治療效果.

Fig.14 Schematic of the hypoxia?triggered DOX@NP nanoparticles for synergistic therapy treatment(A)and representative images of the tumor after different treatments(B)[66]

在腫瘤缺氧微環(huán)境中，耐藥糖蛋白（p-gp）的過表達(dá)可將化療藥物從細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜外排出去，最終導(dǎo)致化療效果作用減弱［70］.研究結(jié)果表明，p-gp的過表達(dá)與缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α密切相關(guān).因此，在化療過程中抑制HIF-1α相關(guān)的分子信號通道是降低藥物耐藥性的有效手段［71，72］.基于此，本課題組［69］構(gòu)建了一種能夠有效降低化療藥物耐藥性的缺氧響應(yīng)熒光探針用于腫瘤的協(xié)同治療.首先合成了一種摻雜Fe的偶氮有機(jī)金屬有機(jī)框架物（AMOFs）；再將化療藥物DOX通過物理包埋裝載在AMOFs的孔內(nèi)，siRNA通過靜電作用吸附在AMOFs表面.在缺氧微環(huán)境下，過表達(dá)的偶氮還原酶切斷偶氮鍵，AMOFs解體釋放DOX及表面的siRNA，釋放出來的siRNA能夠有效沉默HIF-1α，隨即抑制p-gp的表達(dá).下調(diào)的p-gp能阻斷DOX的外排，從而消除化學(xué)耐藥性.結(jié)果表明，此探針可以通過將化學(xué)治療和基因治療有效結(jié)合起來發(fā)揮優(yōu)良的協(xié)同治療效果.

硝基、偶氮鍵和醌是研究者們目前進(jìn)行缺氧響應(yīng)熒光探針設(shè)計常用的3種響應(yīng)基團(tuán).其響應(yīng)機(jī)理如下：這3種基團(tuán)均具有一定的氧化性,在電子供體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的存在下，利用腫瘤缺氧微環(huán)境中過表達(dá)的硝基還原酶、偶氮還原酶、醌還原酶發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)其熒光信號的變化.表1對此3種基團(tuán)的還原響應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了闡釋，并對其在腫瘤缺氧成像（缺氧相關(guān)參數(shù)成像和缺氧相關(guān)生理過程成像）和腫瘤化療、光動力學(xué)治療、基因治療、協(xié)同治療等方面的應(yīng)用進(jìn)行了系統(tǒng)的分類總結(jié).

Table 1 Summary of typical hypoxia-triggered probes and their applications

綜上所述，本文介紹了目前常用的缺氧響應(yīng)基團(tuán)并總結(jié)了缺氧響應(yīng)熒光探針在成像及腫瘤治療方面的最新研究進(jìn)展.偶氮鍵、硝基及醌作為缺氧響應(yīng)熒光探針常用的3種響應(yīng)基團(tuán)，在缺氧環(huán)境中可以接受電子被還原.探針響應(yīng)的主要機(jī)理是利用此類還原反應(yīng)阻斷探針的FRET或PET過程以恢復(fù)信號基團(tuán)的熒光進(jìn)行成像.缺氧響應(yīng)探針主要是利用腫瘤缺氧環(huán)境中的還原應(yīng)激酶實(shí)現(xiàn)單個及多個缺氧相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行成像，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)腫瘤缺氧過程生理變化的探究.缺氧響應(yīng)熒光探針在腫瘤化療、光動力學(xué)治療、基因治療等方面均有一定的應(yīng)用，但均存在一定的局限性.發(fā)展具有協(xié)同治療效果的缺氧響應(yīng)熒光探針具有獨(dú)特優(yōu)勢，而如何巧妙利用多種治療方案以發(fā)揮最佳效果仍是需要亟待解決的問題.希望本綜合評述能使大家對缺氧響應(yīng)熒光探針的應(yīng)用現(xiàn)狀有一個整體的了解，并對后續(xù)研究在探針設(shè)計方面具有一定的參考價值.當(dāng)然，缺氧響應(yīng)相關(guān)的熒光探針最終實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用價值仍面臨很大挑戰(zhàn)：首先，目前已有探針的主要傳遞機(jī)理是利用高滲透長滯留（EPR）效應(yīng)，而EPR效應(yīng)具有極大的個體差異性，因此在實(shí)際臨床應(yīng)用存在很大阻礙；其次，在復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境中，不同類型的腫瘤其缺氧程度存在差異，目前的探針很難具有普適性；最后，在實(shí)現(xiàn)最終的臨床應(yīng)用前，探針的生物相容性、毒性等問題必須得到解決.因此，希望未來缺氧響應(yīng)熒光探針的應(yīng)用研究具有新的突破，并最終實(shí)現(xiàn)在臨床上的應(yīng)用價值.