多指標免疫分析的研究進展

羅 成，彭雅梅，沈 宏，方 群，2，潘建章，2

（1.浙江大學(xué)化學(xué)系,杭州310058；2.浙江大學(xué)杭州國際科創(chuàng)中心,杭州311200）

免疫分析（Immunoassay）是利用抗原和抗體特異性反應(yīng)進行檢測的分析方法，是臨床體外診斷（In VitroDiagnosis，IVD）檢測生理疾病相關(guān)蛋白質(zhì)指標的主要手段.免疫分析在發(fā)展初期主要通過直接檢測免疫復(fù)合物來獲取樣品中待測物的含量信息，這種方法簡單快速，但容易受到體系內(nèi)其它物質(zhì)的干擾，靈敏度較低.

1960年，Yallow和Berson［1］提出了標記免疫分析方法，他們用放射性同位素I125標記胰島素，并使其與血漿中的胰島素共同競爭有限的胰島素抗體特異性結(jié)合位點，形成的放射性抗原-抗體復(fù)合物與待測物濃度呈線性負相關(guān).標記免疫分析簡化了樣品處理流程，提高了分析的靈敏度和準確性.發(fā)展至今，根據(jù)標記方法不同，標記免疫分析可分為放射免疫分析［2~4］、酶聯(lián)免疫分析［5~8］、發(fā)光免疫分析［9~11］和熒光免疫分析［12~14］等.為了去除體系中未參與免疫反應(yīng)的物質(zhì)，標記免疫分析中往往涉及多個洗滌過程，洗滌的效果直接影響檢測的靈敏度和可靠性.為了實現(xiàn)該過程，通常將抗原或抗體固定在固相載體上，通過洗滌去除游離的物質(zhì)，因此這種標記免疫分析方法又被稱為非均相免疫分析.

蛋白質(zhì)指標的變化可反映疾病發(fā)展的程度、治療效果和預(yù)測復(fù)發(fā)幾率.單一蛋白質(zhì)指標只能用于幾種有限的疾病的判斷，如早早孕的判斷.大多數(shù)疾病的判斷都依賴于多個相關(guān)蛋白質(zhì)指標的聯(lián)合分析，只能通過其綜合結(jié)果才能對疾病狀態(tài)進行評估和診斷.因此，檢測單一蛋白指標的方法難以滿足臨床上大多數(shù)疾病的診斷需求.同一樣品中多指標蛋白的同時檢測與單一指標檢測相比，具有更為廣泛的應(yīng)用.

目前，單一免疫指標現(xiàn)場分析已獲得廣泛應(yīng)用，如用于早孕檢測的側(cè)向流試紙條檢測技術(shù)可在5~10 min實現(xiàn)尿液中人絨毛膜促性腺激素的快速檢測.而多指標分析在醫(yī)院檢驗科主要依賴商品化大型儀器檢測來完成，從采樣到出報告需要一天甚至數(shù)天的時間.然而，像以胸痛、惡心等癥狀入院的病人必須快速確定血液中的高敏肌鈣蛋白、C反應(yīng)蛋白等多個指標的含量才能排除心肌梗塞的可能，面對新型冠狀病毒這種爆發(fā)性傳染疾病，需要現(xiàn)場快速檢測血液中免疫球蛋白lgG和lgM的含量以確?？焖僮韪魝魅驹?這些場合都需要發(fā)展適用于即時檢測（Point of Caring Testing，POCT）的快速多指標檢測技術(shù).

Manz和Widmer等［15］于1990年提出了“微型全分析系統(tǒng)”（Miniaturized Total Analysis System，μTAS）概念，由此概念發(fā)展出來的微流控分析系統(tǒng)可在一塊微米級通道網(wǎng)絡(luò)的芯片上實現(xiàn)樣品采集、前處理、反應(yīng)及檢測等所有過程，具有體積小、集成度高、耗樣量少、分析速度快等優(yōu)勢.微流控分析為多指標免疫分析提供了新的技術(shù)途徑，推動了微流控多指標免疫分析系統(tǒng)的發(fā)展.

本文以免疫分析中固定捕獲抗原或抗體的固相載體對現(xiàn)有系統(tǒng)進行分類，介紹了現(xiàn)有的多指標免疫分析系統(tǒng)，討論了各自的優(yōu)勢和不足，并展望了現(xiàn)場多指標免疫分析的發(fā)展前景.

Fig.1 Immunoassay systems based on 96?well plates

1 孔板類多指標免疫分析系統(tǒng)

基于96孔板的免疫分析在臨床體外診斷中應(yīng)用廣泛，在此類免疫分析系統(tǒng)中孔板既是固相載體，也作為反應(yīng)容器.預(yù)先將抗原或抗體固定在孔內(nèi)壁上，分析時直接用移液器向孔內(nèi)加液，反應(yīng)結(jié)束后移除廢液并對孔內(nèi)壁進行多次清洗.在孔內(nèi)依次完成免疫反應(yīng)的全部步驟后對孔內(nèi)液體進行光學(xué)檢測，從而實現(xiàn)定量分析.孔板上不同孔內(nèi)可分別固定不同指標的抗體，以實現(xiàn)多指標免疫分析，商品化孔板規(guī)格統(tǒng)一，適用于不同儀器或反應(yīng)體系.

早期的孔板多指標免疫分析全過程操作需要手動完成.之后發(fā)展出由獨立的分液器、振蕩孵育器、洗板機和讀板儀組成的半自動系統(tǒng)，分析時操作者需將孔板在不同儀器之間傳遞.近年來，這些孵育、清洗、檢測等功能被集成在一個平臺上，由機械臂實現(xiàn)孔板在各個功能模塊之間的傳遞，利用注射泵連接取液針完成液體操控，由此實現(xiàn)了孔板內(nèi)免疫分析全部流程的自動化.目前已經(jīng)面市了很多各種不同原理的全自動免疫工作站.其中，瑞士Tecan公司的Freedom EVOlyzer型全自動酶聯(lián)免疫工作站將孵育板位從常規(guī)的1個擴展到了12個，并將取液針增加到了8根，在自動化的基礎(chǔ)上進一步提高了分析通量和檢測速度，具備了大樣本處理能力.山東博科生物還在BIOBASE4001和BIOBASE8001兩代工作站中使用了可替換的移液槍頭，避免了重復(fù)使用取液針帶來的交叉污染問題.

這些免疫工作站實現(xiàn)了繁瑣加液、取液操作的自動化，可完成高通量快速的免疫分析，但龐大的儀器體積和高昂的儀器購置費用限制其只能應(yīng)用于大中型醫(yī)院中心實驗室，并不適用社區(qū)診所等基層醫(yī)療機構(gòu)或現(xiàn)場快速檢測.此外，孔板類免疫分析發(fā)展至今還存在反應(yīng)效率低、分析耗時長、昂貴試劑消耗量大、靈敏度不高等問題.針對這些問題，研究者們做出了各種優(yōu)化與改進.

Hosseini等［16］采用靜電紡絲纖維墊為固相載體，搭建了用于登革熱早期診斷的多指標免疫分析系統(tǒng).如圖1（A）所示，該系統(tǒng)的核心由一步法靜電紡絲加工的纖維墊、三維（3D）打印的固定件及商品化96孔板組成.靜電紡絲纖維墊通過3D打印的兩片半圓柱體夾持構(gòu)成單元組件，組件通過壓敏膠固定在商品化96孔板的蓋子上，根據(jù)分析指標的個數(shù)可靈活裝配多個這種組件并對應(yīng)插入96孔位中.通過在孔內(nèi)不斷更換反應(yīng)試劑依次完成纖維墊上登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的競爭性免疫分析，依據(jù)370 nm下的吸光度實現(xiàn)待測物的定量檢測.相對于直接以孔內(nèi)壁固定抗體的形式，以纖維素墊為固相載體固定抗體，具有比表面積大的顯著優(yōu)勢，可固定更多的抗體來提高靈敏度.該系統(tǒng)與傳統(tǒng)孔板內(nèi)免疫分析相比，靈敏度提高了8倍，檢出限達到fg/mL水平.

除了增加抗體固定量的形式，也有研究通過提高檢測體系的信號響應(yīng)來提升檢測靈敏度.Shiigi研究組［17］應(yīng)用納米粒子來增強熒光素的熒光發(fā)光效率.將Ag納米粒子分散液加入孔板中后靜置12 h，納米粒子通過靜電作用吸附在孔壁上，對比熒光素溶液在空白孔內(nèi)和固定了納米粒子的孔內(nèi)孵育相同時間后的熒光強度，后者熒光強度是前者的22倍.該研究組將Ag納米粒子的熒光增強技術(shù)應(yīng)用于E.coli O157：H7，E.coli O26：H11和S.enterica 3種細菌的酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme linked immunosor?bent assay，ELISA），相較于未吸附納米粒子的96孔板，分析靈敏度提高了100倍，實現(xiàn)了多指標免疫分析的高靈敏檢測［18］.

常規(guī)孔板類免疫分析的反應(yīng)體系體積較大，試劑消耗量大，固定在孔板上捕獲用的單克隆抗體尤其昂貴，因此試劑消耗量很大程度上決定了孔板免疫分析的成本.Sapsford等［19］采用亞克力板和激光切割技術(shù)加工了微型化的96孔板，整個孔板尺寸與信用卡片相當，每個孔的體積相應(yīng)進行了縮小.因孔板尺寸不再與常規(guī)讀板儀匹配，該工作中采用電化學(xué)發(fā)光成像檢測儀（EL-CCD）作為檢測器.在此微型化孔板上，按照與常規(guī)孔板免疫分析相同的操作和反應(yīng)時間，完成了葡萄糖球菌B型腸毒素的檢測，檢出限為3.9 ng/mL，與傳統(tǒng)ELISA靈敏度基本保持一致，該系統(tǒng)將傳統(tǒng)ELISA的樣品消耗體積從百微升降到5μL，大大降低了分析成本.Siloam Biosciences公司設(shè)計了一種OptimizerTM板［20］，如圖1（B）所示，整個板外觀尺寸與96孔板一致，但每個孔底部設(shè)計加工有螺旋形的微通道，微通道出口直接與孔板下的吸收墊連接.在微通道內(nèi)固定捕獲抗體，分析時依次向孔內(nèi)加入各反應(yīng)液和清洗液，這些溶液通過微通道完成整個免疫反應(yīng)流程，最后采用商品化熒光讀板儀檢測微通道內(nèi)的熒光信號.系統(tǒng)成功應(yīng)用于人IL-4炎癥因子蛋白的免疫分析，將常規(guī)96孔板的樣品消耗從100μL降低到5μL.系統(tǒng)還將包括捕獲抗體固定在內(nèi)的分析時間從常規(guī)的18 h縮短至2 h，檢出限也從常規(guī)的0.8 pg/mL降低到0.2 pg/mL，該系統(tǒng)分析速度和檢測靈敏度的提高得益于微通道高比表面積帶來的高蛋白吸附效率，且反應(yīng)后的廢液直接通過毛細作用被下層的吸收墊吸收，顯著簡化了操作步驟.

除上述減小試劑消耗來節(jié)省分析成本的方法外，替代的低成本捕獲抗體的研究也取得了一些進展.Zhang等［21］發(fā)展了一種用分子印跡聚合物代替捕獲抗體實現(xiàn)蛋白分子識別的孔板免疫分析方法.在96孔板的孔內(nèi)壁通過冷等離子體誘導(dǎo)嫁接技術(shù)固定包含了量子點的分子印跡硅材料聚合物涂層（MIS-QDs），MIS-QDs表面的腔體具有類似生物抗體的識別能力，能捕獲樣品中的岡田酸，岡田酸對量子點有高熒光猝滅性.按照常規(guī)孔板類似步驟完成岡田酸的類免疫反應(yīng)后，使用商品化熒光分光光度計檢測孔內(nèi)熒光強度，檢出限為0.25 ng/mL.由于MIS-QDs對岡田酸的反應(yīng)速度快，孵育時間只需要6 min.與昂貴的生物單抗相比，這種用于抗原捕獲的聚合物成本較低，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，但其在復(fù)雜樣品體系中對待測物識別的特異性還有待進一步評估.

在孔板內(nèi)完成免疫分析的操作方法比較簡單，孔位成陣列排布也易于實現(xiàn)流程自動化，針對多指標的檢測方法目前都集中在以孔位指示指標種類，因此存在試劑消耗大，分析時間長的問題.現(xiàn)已報道的系統(tǒng)對孔板內(nèi)免疫復(fù)合物的定量主要還是在傳統(tǒng)讀板儀上完成，但吸光度檢測的靈敏度較低，后續(xù)的進一步發(fā)展需要采用靈敏度更高的檢測技術(shù)，如激光誘導(dǎo)熒光檢測［22，23］、發(fā)光檢測［24，25］和表面增強拉曼光譜檢測［26］等檢測技術(shù).

2 微流控多指標免疫分析系統(tǒng)

為了實現(xiàn)固定、孵育、清洗、檢測等免疫分析步驟，上述孔板類或管式的臨床免疫分析儀需要使用復(fù)雜的流體管路和泵閥等流體操控部件，這些部件體積龐大、價格高昂，難以集成到微型現(xiàn)場分析系統(tǒng)中.近年來，基于微流控技術(shù)的免疫分析系統(tǒng)得到了快速發(fā)展.微流控系統(tǒng)通過在芯片上集成微通道流路，可大大降低設(shè)備成本，且易于實現(xiàn)儀器的微型化；另外，微流控分析試劑消耗量少，降低了分析成本；此外，微流體的尺度效應(yīng)也有助于提高反應(yīng)效率，縮短免疫反應(yīng)時間.因此，微流控免疫反應(yīng)系統(tǒng)可滿足現(xiàn)場快速分析對設(shè)備購置成本、分析測試成本、儀器體積、分析速度等多維度的綜合要求.目前報道的微流控多指標免疫分析根據(jù)固相載體的不同主要可分為3類：（1）直接以芯片微通道或毛細管內(nèi)壁為抗體固定的載體；（2）以高聚物微珠表面為抗體的固相載體；（3）以紙纖維作為抗體的固相載體.

Fig.2 A microchip immunoassay with power?free sequential injection[28]

2.1 以微通道內(nèi)壁為固相載體的免疫分析

微流控芯片具有集成免疫反應(yīng)所有試劑和分析步驟的能力，但同時要滿足多指標的分析，這一要求對芯片的設(shè)計與加工工藝以及流體的驅(qū)動操作都提出了更大的挑戰(zhàn).為了在一張芯片上實現(xiàn)不同蛋白或樣品的檢測，Li等［27］設(shè)計了一種并行五通道的聚二甲基硅氧烷（PDMS）免疫分析芯片，每條微通道（17 mm×150μm×35μm）作為獨立的反應(yīng)單元.在分析前，先用可編程的注射泵驅(qū)動蛋白A溶液進入通道后保持靜置，在PDMS芯片表面的疏水作用下蛋白A固定在通道內(nèi)壁上，繼續(xù)將連接有蛋白A抗體的C-反應(yīng)蛋白（CRP）捕獲抗體流過通道，通過蛋白A與其抗體的特異性反應(yīng)將待分析物CRP的捕獲抗體固定在通道內(nèi)壁上.分析時依次向通道內(nèi)通入CRP，異硫氰酸熒光素（FITC）標記的CPR檢測抗體后反應(yīng)形成夾心免疫復(fù)合物，反應(yīng)結(jié)束后采用熒光顯微鏡對通道進行熒光成像檢測.包含抗體固定在內(nèi)的整個分析流程可在23 min內(nèi)完成，檢出限為0.36μg/mL.通過在各個通道內(nèi)使用不同的捕獲和檢測抗體對，多通道并行的免疫分析系統(tǒng)也具有多指標分析的能力，因此在本文也將此類免疫分析系統(tǒng)歸為多指標微流控免疫分析系統(tǒng)進行介紹.但這種平行通道完成多指標免疫分析時需要外接注射泵和多路流體管路，外圍裝置復(fù)雜且體積較大.

為了簡化多通道帶來的復(fù)雜流體操控問題，Hosokawa等［28］設(shè)計了一種無需外接驅(qū)動裝置的免疫分析芯片.芯片由一片PDMS蓋片和玻璃基底直接貼合而成，結(jié)構(gòu)如圖2所示.PDMS蓋片上有4條平行排列的獨立通道，通道尺寸為12 mm×100μm×15μm，通道入口開放于玻璃基底上方，各通道末端設(shè)計有獨立的廢液池.芯片完成組裝后先在真空干燥箱中排盡空氣后貼上膠帶保存.免疫分析時，將樣品溶液加在PDMS蓋片的通道入口以封閉通道，通道內(nèi)部壓力隨通道內(nèi)空氣滲透到PDMS中而降低，通道入口處的樣品在外界大氣壓的作用下進入通道.此時通道入口又起到突破閥的作用，使樣品停留在通道內(nèi)進行免疫反應(yīng)，當后續(xù)反應(yīng)試劑再次加至通道入口時突破閥再次開啟，同樣在內(nèi)外壓差下進入微通道進行后續(xù)反應(yīng).反應(yīng)完成后，采用倒置熒光顯微鏡對通道上的熒光復(fù)合物進行定量檢測.該研究在上述流程下完成了兔lgG和人CRP的定量分析，耗樣量為1μL，分析時間約為20 min，檢出限分別為32和48 ng/mL.這種芯片設(shè)計簡化了結(jié)構(gòu)和流體操作，液體停留在通道內(nèi)反應(yīng)的設(shè)計比連續(xù)流反應(yīng)進一步減少了試劑消耗，適合一次性使用，但要用于現(xiàn)場分析，還需與適合的便攜式檢測器相結(jié)合.

多個通道平行排列時，雖然可以通過在芯片上集成微泵微閥簡化外圍的流體操控裝置，但在分析過程中試劑的加液步驟依然隨通道數(shù)的增加而增加，造成分析時間變長.Gao等［29］發(fā)展了一種氣動微泵閥控制并行單元的多指標免疫分析芯片.芯片結(jié)構(gòu)由3層組成，上層和底層為分別加工有流體微通道和氣體控制通道的玻璃片，中間層為一片PDMS膜，并行的20個反應(yīng)單元在圓形的芯片上呈中心放射性排布.各種免疫反應(yīng)試劑預(yù)先儲存在芯片公共的儲液池中，分析時向芯片樣品池中加入不同的樣品，通過組合PDMS微泵閥依次驅(qū)動試劑和樣品進入微通道反應(yīng)區(qū)域，最終采用共焦式熒光掃描儀順序掃描各單元反應(yīng)區(qū)域獲得熒光強度信號.該工作在此芯片上同時完成了15個人血清樣品中l(wèi)gG的分析，包括固定捕獲抗體在內(nèi)的整個免疫分析時間在1 h之內(nèi)，樣品消耗量為5μL，對lgG檢出限小于10 ng/mL.該芯片通過并行單元的設(shè)計，采用氣動PDMS微泵閥對并行單元進行統(tǒng)一的流體控制，實現(xiàn)高通量、自動化的免疫分析.

微流控分析領(lǐng)域常用的離心芯片也可實現(xiàn)類似的并行單元設(shè)計和流體的統(tǒng)一操控，實現(xiàn)多指標免疫分析.離心芯片預(yù)先將反應(yīng)試劑儲存在儲液池中，加入樣品后通過離心力和毛細力控制樣品和試劑的順序操控，實現(xiàn)整個免疫分析流程.Ukita等［30］設(shè)計了堆疊式的三維離心微流控免疫分析芯片.芯片上層和底層是具有常規(guī)平面微通道的PDMS圓盤，中間層是加工有微柱陣列的亞克力圓盤，10個并行反應(yīng)單元呈放射狀分布在離心芯片上，芯片結(jié)構(gòu)如圖3所示.反應(yīng)前將所有試劑預(yù)先儲存于對應(yīng)液池中.反應(yīng)時，向芯片對應(yīng)液池加入樣品后啟動芯片驅(qū)動電機，隨著離心芯片的轉(zhuǎn)動，在離心轉(zhuǎn)速階段性提高的過程中，各步驟試劑按照離芯片中心的遠近依次進入芯片外圍的反應(yīng)腔室.反應(yīng)腔室內(nèi)加工的微柱陣列既起到固相載體的作用，又可以作為突破閥保留試劑以完成免疫反應(yīng).該離心芯片初步驗證了ELISA測定lgG的可行性，每個單元耗樣量為3μL，反應(yīng)時間為25 min.

Fig.3 Stacked centrifugal microfluidic immunoassay chip with three?dimensional[30]

為了提高離心芯片的分析通量.He等［31］在離心免疫分析芯片上設(shè)計了微型試劑分配結(jié)構(gòu).芯片采用微亞克力注塑工藝加工而成.芯片上含有的12個分析單元相互獨立，每個單元內(nèi)部又包含了兩級分配器和4個反應(yīng)單元.2個一級分配器后分別設(shè)計有樣品池，二級分配器后連接主干通道，主干通道兩側(cè)分支設(shè)計有底物和清洗液的儲液池.分析時，兩個一級分配器完成兩個樣品并行的雙指標樣品分配，二級分配器完成免疫試劑向4個反應(yīng)單元的試劑分配.由此一個分析單元可同時實現(xiàn)兩個樣品中多個指標的分析.

相較于外接注射泵或在芯片內(nèi)設(shè)計微泵閥的流體驅(qū)動方法，離心芯片通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速即可實現(xiàn)所有反應(yīng)單元中免疫反應(yīng)試劑的有序操控，易于實現(xiàn)高通量和自動化.而為了達到上述效果，芯片上儲液池與微通道之間不易設(shè)計主動閥門類的阻隔結(jié)構(gòu)，這也造成反應(yīng)試劑在儲液池內(nèi)保存會出現(xiàn)揮發(fā)、串液等問題，阻礙了離心芯片在現(xiàn)場分析領(lǐng)域的應(yīng)用.

微馬賽克免疫分析（Micromosaic Immunoassay，μMIA）芯片也是實現(xiàn)微流控多指標免疫分析的重要方式.該方法由Bernard等［32］于2001年首次提出，基本原理是將不同指標的捕獲抗原以條帶的形式固定在PDMS基底上，用封閉液對基底上未固定抗原的部分進行封閉.分析時，在基底上通入不同樣品溶液，流動方向與抗原條帶垂直，這樣每種樣品依次與不同指標的抗原條帶交叉.當樣品中有對應(yīng)抗體時，在交叉區(qū)域會與基底上的抗原發(fā)生免疫反應(yīng).若采用熒光物質(zhì)標記抗體，反應(yīng)結(jié)束后對PDMS基底成像檢測即可得到類似馬賽克圖案的熒光圖（圖4）.馬賽克芯片以一種極簡的結(jié)構(gòu)實現(xiàn)多樣品的多指標免疫分析，操作也較為簡單.

Fig.4 Principle for performing aμMIA on a surface with microfluidic network cross?delivery of a series of antigens and one of antibodies[32]

Yu等［33］報道了一種用于獸藥分析的馬賽克免疫分析芯片，芯片由帶有通道的PDMS上層蓋片和PDMS下層基底貼合組裝而成.先在通道內(nèi)通入葡萄糖氧化酶標記的氯灑西林抗原，移除蓋片后，將新的帶通道蓋片以和第一個蓋片垂直的方向貼合在基底上，再在通道中依次通入封閉液、樣品和氯灑西林抗體混合物、辣根過氧化物酶（HRP）檢測抗體完成免疫反應(yīng)全過程，拿開蓋片后在敞開的基底上鋪上化學(xué)發(fā)光底物溶液，最終通過對交叉區(qū)域的化學(xué)發(fā)光強度進行成像檢測獲得不同指標抗原的濃度.該系統(tǒng)每個通道樣品消耗量為18μL，對氯灑西林檢出限為（0.92±0.07）ng/mL.馬賽克芯片在簡化多指標免疫分析流程方面具有明顯的優(yōu)勢，但連續(xù)單向流動造成試劑消耗大，且相比于微通道免疫反應(yīng)，只在一個微平面上固定捕獲抗體，固定的捕獲抗體量少，檢測靈敏度相對較低，且過程需要手工完成，不易于自動化.

微流控技術(shù)可以將樣品處理和免疫分析步驟集成在同一張芯片上，為實現(xiàn)現(xiàn)場分析提供了技術(shù)途徑.因此，近年來不同廠家也發(fā)展了基于微流控芯片的商品化POCT多指標免疫分析產(chǎn)品.目前，美國雅培公司推出的手持式iSTAT血液分析儀被廣泛應(yīng)用于醫(yī)院急診室，分析時，在芯片上加入血液后插入儀器中，樣品中待測物依次與芯片內(nèi)的捕獲抗體、檢測抗體等反應(yīng)，可在7 min內(nèi)完成心肌肌鈣蛋白、肌酸激酶同工酶和B型鈉尿肽3種心臟標志物的免疫反應(yīng)，基于電化學(xué)發(fā)光技術(shù)實現(xiàn)定量分析.另外一款更具有代表性的POCT產(chǎn)品是雅培旗下的Triage?MeterPro便攜式免疫分析儀，其核心是用于檢測心肌標志物的微流控芯片.分析時，將血液加至芯片入口，血液經(jīng)過芯片上的微柱過濾器后完成血漿分離，分離得到的血清繼續(xù)在微通道毛細作用下向前遷移，依次與固定在通道內(nèi)的干化試劑點上完成免疫反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后基于時間分辨熒光檢測原理對免疫復(fù)合物進行定量檢測，最終可在單個芯片上完成五項心肌標志物的自動免疫分析.

2.2 基于微球的免疫分析系統(tǒng)

以微球為固相載體的微流控免疫分析具有多方面的優(yōu)勢.首先，微球的比表面積大，有助于提高免疫反應(yīng)的效率和靈敏度；其次，微球尺寸、材料種類繁多，還可對表面進行不同方法的修飾；此外，帶磁性的微球（磁珠）也可以直接用磁場靈活操控，滿足不同的免疫分析需求.

得益于微球固相載體的這些優(yōu)勢，近年來，基于磁珠的化學(xué)發(fā)光免疫分析成為了臨床上全自動免疫分析的主流方法.該法以磁珠為固定抗體的固相載體，以普通離心管為反應(yīng)容器，通過孵育、清洗等步驟在磁珠表面形成免疫復(fù)合物.國外廠商以雅培、丹納赫、西門子和羅氏4家公司為代表，發(fā)展出了各種落地式和桌面式的全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀.這些儀器平臺內(nèi)在空間上劃分出不同的功能區(qū)，分別用于實現(xiàn)儲存試劑、孵育清洗、檢測等功能，運行時依賴機械臂與取液探針配合，完成反應(yīng)管在不同功能區(qū)的傳遞和液體的操控.這些儀器采樣后在15~30 min內(nèi)可獲取檢測結(jié)果，每小時可完成上百個測試.自2012年深圳新產(chǎn)業(yè)推出第一臺國產(chǎn)全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀以來，國內(nèi)的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀也大量上市，主要包括邁克生物、安圖生物和邁瑞醫(yī)療等公司的產(chǎn)品，這些儀器在進一步增加樣品容量的同時還采用了可替換移液槍頭的設(shè)計，解決了樣品間的交叉污染問題.與傳統(tǒng)孔板類免疫分析工作站相似，這些儀器具有高通量、自動化的分析能力，但磁珠比表面積更大、清洗更徹底，所以反應(yīng)效率上相較于孔板來說更具有優(yōu)勢，但同樣也存在耗樣量大、體積大等不足，并不適用于POCT領(lǐng)域.

以微流控芯片微通道作為反應(yīng)容器可以大大降低昂貴試劑的消耗，最常用的方法是將微球通入芯片通道中，通過在微通道中設(shè)置微堰等結(jié)構(gòu)可將微球截留在通道中，同時通道仍然保持流通，后續(xù)將樣品和免疫試劑依次通過微通道，即可在微球表面完成免疫分析的全過程.Sato等［34］將固定有s-lgA捕獲抗原的聚苯乙烯微球通過微堰攔截在通道內(nèi)（圖5）.分析時，微通道內(nèi)通入膠體金標記的s-lgA抗體溶液，微球表面固定的抗原捕獲膠體金抗體，最后在原位用熱透鏡檢測器進行光吸收信號的檢測.該過程的分析時間小于1 h，研究者后續(xù)還進一步擴展芯片并行通道的數(shù)目至四通道，4個通道有獨立的樣品入口，共用一個試劑入口，該系統(tǒng)在50 min完成4個樣品中干擾素的并行免疫分析［35］.

Fig.5 Layout of the glass microfluidic immunoassay chip with a dam structure[34]

Zhao等［36］通過在微通道內(nèi)用微球堆積形成填料反應(yīng)柱的形式來增加免疫抗原和抗體間的接觸機會以進一步提高反應(yīng)效率.研究通過酰胺反應(yīng)在帶羧基的微球上固定氯霉素抗體，然后將微球?qū)隤DMS芯片通道內(nèi)，堆積形成一個填料反應(yīng)柱.當樣品和FITC標記的氯霉素流過反應(yīng)柱時與微球上抗氯霉素抗體競爭結(jié)合，最終通過對微球進行熒光成像檢測實現(xiàn)定量分析.整個過程可在20 min內(nèi)完成，檢出限為0.05 ng/mL.類似的工作還有Viirlaid等［37］直接將微球灌入一端帶活塞的管內(nèi)形成反應(yīng)柱，首先在管內(nèi)通入草甘膦抗體，使其固定在微球表面，然后再通入樣品和五?羧基四甲基羅丹明（5-TAMRA）熒光標記的草甘膦完成反應(yīng).該研究在37 min內(nèi)完成了地表水中草甘膦含量的測定，檢出限為406μg/mL.微球反應(yīng)柱增加了抗原抗體結(jié)合的機會，提高了分析效率，相比于單顆微球上熒光信號的檢測，這種微球反應(yīng)柱熒光信號的檢測對檢測器的光學(xué)定位要求更低.

使用磁珠不僅可以作為固相載體，還能在磁場的操控下自由移動，在通道內(nèi)起到混合功能的作用，從而提高反應(yīng)效率，Herrmann等［38］在PDMS芯片通道中固定的磁珠上完成了鏈霉親和素抗體的免疫分析.芯片上設(shè)計有8根平行通道，每條通道有獨立的進樣口，通道兩端窄中間寬.在分析前向通道內(nèi)通入固定有鏈霉親和素的磁珠，磁珠在中間較寬通道內(nèi)形成一個松散的堆積層，在磁鐵的操控下芯片內(nèi)的磁珠可沿著通道的方向來回移動.繼續(xù)在通道內(nèi)流入鏈霉親和素抗體、酶標二抗和底物依次反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，最后采用倒置熒光顯微鏡檢測磁珠熒光.系統(tǒng)對鏈霉親和素抗體的檢測靈敏度達皮摩爾水平，也可以在不同通道內(nèi)同時完成多種指標或多樣品的免疫分析.

上述將微球限制在微通道內(nèi)，通過依次向通道內(nèi)通入反應(yīng)試劑的方法需要復(fù)雜繁瑣的流體操作來完成免疫反應(yīng)，且通道流體阻力大，易于堵塞.為了簡化該操作，Kim等［39］設(shè)計了五腔室串聯(lián)的微流控免疫芯片.如圖6所示，第一腔室裝載抗原和檢測抗體混合液，第三腔室裝載清洗液，第五腔室裝載底物，其余腔室則裝載礦物油以隔離相鄰的3種水相反應(yīng)試劑.各腔室間加工有微柱結(jié)構(gòu)，用于穩(wěn)定水-油界面.免疫分析時，只需通過磁鐵移動固定了捕獲抗體的磁珠依次通過5個腔室，即可按序完成免疫分析步驟.整個免疫分析耗時40 min，系統(tǒng)對低聚體Aβ的檢出限為10.7 pg/mL.該研究操控磁珠運動通過靜止試劑的方法可以顯著簡化免疫液體操作流程，且磁珠在獨立腔室完成信號檢測，避免了芯片內(nèi)非特異性吸附造成的靈敏度下降問題.

Fig.6 Microfluidic immunoassay chip with five chambers in series[39]

Fig.7 A centrifugal microfluidic chip for automated immunoassay of whole blood[40]

Lee等［40］首次將基于微球懸液的免疫分析全過程集成在離心芯片上，整個免疫分析在離心分析儀上自動化完成.微球上提前固定捕獲抗體然后裝載在芯片的混合腔室中，與微球同時裝載在芯片上的還有全血樣品和免疫反應(yīng)所需的其它試劑［圖7（A）］.為了保證芯片上這些試劑在使用前的獨立保存和分析過程中的有序控制，該工作以分散有氧化鐵的石蠟作為離心芯片上各微通道間的閥門，需要時通過激光照射石蠟，使得氧化鐵吸熱后石蠟升溫而融化，由此開啟閥門，同時配合芯片離心轉(zhuǎn)動實現(xiàn)試劑的順序驅(qū)動，整個免疫分析的流程如圖7（B）~（G）所示.芯片上設(shè)計了3個獨立的分析單元，可同時實現(xiàn)多種指標的并行免疫分析.分析總時間在50 min內(nèi)，系統(tǒng)對乙型肝炎病毒表面抗原檢出限為0.51 ng/mL.上述這些系統(tǒng)采用在多個通道內(nèi)分別固定微球的方式來實現(xiàn)多指標的分析，通過易操控的石蠟閥門解決了試劑儲存時的串液問題，但也增加了芯片加工的難度.

美國Luminex公司推出了基于熒光編碼磁珠的多指標免疫分析方案（又稱為流式熒光、懸浮陣列或液態(tài)芯片），其核心是熒光編碼的磁珠，用梯度雙色熒光染色的方法對聚苯乙烯磁珠本體進行染色編碼，不同熒光編碼的磁珠分別用于固定不同的抗體.在分析時，將這些不同編碼的磁珠混合后加入待測樣品中，各種磁珠在樣品中完成各自對應(yīng)抗原的捕獲，后續(xù)免疫反應(yīng)操作類同于離心管式磁珠免疫分析.反應(yīng)完成后，將磁珠轉(zhuǎn)入三通道熒光檢測系統(tǒng)進行微球編碼的識別和免疫復(fù)合物的定量檢測.該公司提供了Luminex 200和MAGPIX兩款熒光檢測儀，前者采用流式的方法檢測磁珠熒光，后者采用熒光面陣成像技術(shù)實現(xiàn)磁珠熒光的檢測.該方案通過調(diào)節(jié)兩種編碼熒光染料的配比可獲得最多100種編碼磁珠，在一個反應(yīng)腔室內(nèi)可同時完成多達100種不同蛋白質(zhì)指標的免疫分析，但該方案只提供了自動化熒光檢測儀，在前端的免疫操作流程還需依靠手動完成，未能實現(xiàn)自動化.

Fig.8 Schematic diagram of lateral flow strips[41]

2.3 基于側(cè)向流試紙條的免疫分析系統(tǒng)

側(cè)向流試紙條是目前應(yīng)用最為廣泛的便攜式現(xiàn)場免疫分析產(chǎn)品.1988年市場上就出現(xiàn)了首個早孕試紙條，迄今為止免疫試紙條產(chǎn)品仍在市場占有很大份額.如圖8所示，試紙條主要由樣品墊、結(jié)合墊、檢測墊以及吸收墊組成［41］，分析時將液體樣本加到樣品墊上，在毛細力的驅(qū)動下樣品溶液側(cè)向流動，結(jié)合墊上提前固定有免疫探針（通常為帶膠體金標記的抗體），免疫探針與樣本溶液中的目標蛋白特異性結(jié)合后形成復(fù)合物繼續(xù)向前運動，到達檢測墊后與其上固定的捕獲抗體進一步結(jié)合而顯色，未結(jié)合抗原的免疫探針繼續(xù)運動至控制線，與其上固定的二抗結(jié)合后顯色，通過檢測線和控制線的顯色可判斷樣品中目標蛋白的有無及免疫過程是否成功.

試紙條具有操作方便，讀取簡單，分析快速等優(yōu)勢，但也存在檢測靈敏度低和定量能力不足的問題.為了提高試紙條的靈敏度，除了傳統(tǒng)的比色法［42，43］，又發(fā)展出發(fā)光檢測［44~46］、表面增強拉曼光譜檢測［47］、電化學(xué)檢測［48］、熱檢測［49］等方法.Li等［50］在標記有熒光銪的聚苯乙烯微球上固定抗體，微球與抗原樣品在管內(nèi)混合后孵育10 min，將反應(yīng)后的微球溶液全部滴加在試紙條的樣品墊上，未結(jié)合抗原樣品的微球繼續(xù)與檢測線上的抗原結(jié)合，結(jié)合了抗原樣品的微球到達控制線后與其上的二抗結(jié)合，通過紫外分析儀或凝膠成像系統(tǒng)完成結(jié)果的定量讀取.與納米金標記的試紙條相比，該熒光銪微球試紙條對黃曲霉毒素M1的檢測靈敏度是前者的5倍.

另外，為了實現(xiàn)單一試紙條的多指標分析，Chen等［51］在一張試紙條上的兩條檢測線分別固定甲狀腺過氧化物酶（CEA）抗體和甲胎蛋白（AFP）抗體實現(xiàn)了雙指標分析.該研究組還對比了化學(xué)發(fā)光檢測和比色檢測的靈敏度.研究將HRP和抗體同時固定在金納米顆粒上，既可比色也可化學(xué)發(fā)光檢測，兩條檢測線上的免疫復(fù)合物先用顯微鏡成像檢測再用化學(xué)發(fā)光分析儀檢測.結(jié)果顯示，兩種指標的化學(xué)發(fā)光檢測靈敏度是比色檢測的25倍，但化學(xué)發(fā)光與比色相比，完成反應(yīng)后需要清洗并加入魯米諾底物，整個過程需要30 min，耗時較長.Wang等［52］用兩種熒光發(fā)射波長的量子點分別標記CEA和AFP抗體，并將這兩種指標的捕獲抗體混合后固定在同一條檢測線上，通過雙通道熒光檢測完成兩個指標識別和分別定量分析，該系統(tǒng)對CEA和AFP的檢出限分別為3和2 ng/mL.Fang等［53］則采用3種熒光發(fā)射波長的量子點作為抗體標記物，在單個試紙條上實現(xiàn)CEA、AFP和前列腺特異性抗原（PSA）3種癌癥指標的同時檢測，3條檢測線的熒光強度與樣品中對應(yīng)抗原濃度成正比，檢出限分別為2.05 pg/mL（PSA），3.30 pg/mL（AFP）和4.92 pg/mL（CEA）.

在傳統(tǒng)試紙條上增加信號定量檢測和多組分分析功能會導(dǎo)致系統(tǒng)變得復(fù)雜，削弱了試紙條本身操作方便的優(yōu)勢.為了適應(yīng)POCT的要求，He等［54］設(shè)計并搭建了低成本、便攜式的熒光成像系統(tǒng)，整個系統(tǒng)由手機、半球透鏡、激光二極管和吸熱玻璃組成（圖9）.該系統(tǒng)可完成兩條檢測線上分別摻有銪和銩的上轉(zhuǎn)換納米粒子的熒光檢測，以熒光波長區(qū)別指標類型，以熒光強度指示對應(yīng)指標濃度.該系統(tǒng)同時完成了PSA和EphA2蛋白的定量檢測，檢出限分別為89和400 pg/mL.Rong等［55］同樣基于手機開發(fā)了熒光側(cè)向流試紙條的免疫分析系統(tǒng)，采用3D打印的機械部件集成了手機、LED激發(fā)光源、電子元件等.以熒光量子點作為抗體標記探針，在20 min內(nèi)完成了血清中寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1的定量檢測，檢出限為0.15 ng/mL.

Fig.9 Quantitative lateral flow strip(LFS)sensor using highly doped upconversion nanoparticles as reporters and a phone camera as the readout element[54]

3 總結(jié)與展望

免疫分析是臨床體外診斷的重要方法，而多種蛋白質(zhì)標志物的聯(lián)合檢測對疾病的診斷具有重要意義.本文以固定捕獲抗體的固相載體為分類標準，介紹了商品化和研究領(lǐng)域發(fā)展的多指標免疫分析系統(tǒng).孔板類多指標免疫分析在不同孔內(nèi)進行不同指標的免疫分析，試劑耗費量大，設(shè)備和分析成本高，且儀器體積大，難以應(yīng)用于基層醫(yī)療機構(gòu)和現(xiàn)場分析等場合.基于微流控技術(shù)的免疫分析系統(tǒng)具有體積小、耗樣少、效率高等優(yōu)勢，因此特別適用于POCT現(xiàn)場快速檢測場合.其中以芯片通道為固相載體的免疫分析系統(tǒng)仍然面臨復(fù)雜流體操控自動化的問題.側(cè)向流試紙條在單指標免疫分析方面優(yōu)勢突出，但在多指標檢測方面存在定量能力不足和指標檢測數(shù)量不足等限制.微通道內(nèi)微球/磁珠或熒光編碼磁珠等為固相載體的分析系統(tǒng)顯著增加了抗原捕獲量和捕獲效率，減少試劑消耗的同時提高了檢測靈敏度，通過結(jié)合微流控技術(shù)易于簡化操作流程，實現(xiàn)并行多指標的自動化免疫分析，因此有望在將來發(fā)展成為主流的POCT多指標免疫分析技術(shù).相信經(jīng)過不斷的發(fā)展和改進，基于微流控技術(shù)的微球/磁珠多指標免疫分析通過簡化操控流程將在急診科室、事故現(xiàn)場等需要快速免疫檢測的場合獲得廣泛應(yīng)用，同時通過降低設(shè)備及分析成本，可實現(xiàn)此類設(shè)備在基層醫(yī)療機構(gòu)或大型交通樞紐的傳染病快速篩選場合的大批量推廣應(yīng)用.