基于分子識別的免疫層析技術(shù)用于新冠肺炎感染的快速診斷

劉 園，鄧瑾琦，趙 帥，田 飛，李 軼，孫佳姝，3，劉 超，3

（1.天津大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系天津市分子光電子科學(xué)重點實驗室,化學(xué)科學(xué)與工程協(xié)同創(chuàng)新中心,天津300072；2.北京市納米生物醫(yī)學(xué)檢測工程技術(shù)研究中心,中國科學(xué)院納米標(biāo)準(zhǔn)與檢測重點實驗室,中國科學(xué)院納米科學(xué)卓越創(chuàng)新中心,國家納米科學(xué)中心,北京100190；3.中國科學(xué)院大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院,北京100049）

自2019年12月以來，由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）導(dǎo)致的新冠肺炎（COVD-19）疫情在全球蔓延，目前已導(dǎo)致超過1.7億人感染，超過270萬人死亡［1］.SARS-CoV-2屬于冠狀病毒科，β冠狀病毒屬，形狀呈球形，直徑為80~120 nm，屬于單股正鏈RNA病毒，有囊膜，囊膜上分布有刺突糖蛋白（Spike protein，S）、膜糖蛋白（Membrane protein，M）和包膜糖蛋白（Envelope protein，E）等，囊膜內(nèi)則含有與核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，N）結(jié)合的RNA（圖1）［2~5］.SARS-CoV-2的S蛋白包含S1和S2兩個亞基，其中S1亞基中的受體結(jié)合域片段（RBD）通過與細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）結(jié)合引起SARS-CoV-2感染［6~8］.在感染SARS-CoV-2病毒后，免疫體系會產(chǎn)生與抗原相對應(yīng)的免疫球蛋白.研究表明，新冠肺炎感染力較強，且在無癥狀感染期便具有很強的傳染性［9~11］.SARSCoV-2病毒感染會引起發(fā)熱、干咳、乏力等癥狀，重癥患者伴隨有呼吸困難和/或低血氧癥，嚴(yán)重者可能會導(dǎo)致凝血功能障礙和多器官功能衰竭等［12~14］.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（RT-PCR）是目前最常用的新冠肺炎感染檢測手段［15］，雖然該方法的靈敏度和特異性很高，但其檢測耗時較長，且只能在專業(yè)實驗室中由專業(yè)技術(shù)人員進行檢測操作，無法用于快速檢測［16］.為了有效遏制新冠肺炎疫情傳播，亟待開發(fā)新的檢測方法用于病毒感染者快速篩查.

免疫層析技術(shù)，又稱為側(cè)向?qū)恿骷夹g(shù)（Lateral flow assay，LFA），是一種以毛細(xì)作用為驅(qū)動的快速檢測方法［17，18］.早孕試紙便是一種以人絨毛膜促性腺激素（HCG）為檢測對象的商業(yè)化膠體金免疫層析試紙［19］.膠體金免疫層析試紙（GLFA）一般包括樣品墊、結(jié)合墊、硝基纖維素（NC）膜以及吸水墊等部分，其結(jié)合墊上固定有抗體修飾的金納米顆粒（AuNPs），NC膜上固定有捕獲抗體［20~22］.樣本滴加至樣品墊后，在毛細(xì)作用下順次流經(jīng)結(jié)合墊與NC膜，最終到達吸水墊.樣本流經(jīng)結(jié)合墊時，樣本中的待測物質(zhì)會與金標(biāo)抗體結(jié)合；樣本流經(jīng)NC膜時，待測樣本被捕獲抗體捕獲并固定，NC膜上由于金納米顆粒聚集而出現(xiàn)紅色條帶，通過觀察檢測區(qū)域中的紅色條帶即可實現(xiàn)對HCG的快速定性檢測［23］.然而，傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙靈敏度較低，且只能實現(xiàn)定性檢測，在很大程度上限制了其應(yīng)用范圍［24~27］.近年來，納米技術(shù)的快速發(fā)展為免疫層析技術(shù)提供了新的選擇，已有多種基于不同檢測模式的免疫層析試紙被報道用于不同靶標(biāo)的快速定量靈敏檢測［28~33］.

新冠疫情爆發(fā)后，免疫層析技術(shù)因其操作簡單、檢測時間短等優(yōu)點而再次受到關(guān)注.目前，已有多種不同形式的免疫層析試紙被用于不同新冠肺炎相關(guān)標(biāo)志物的檢測，包括抗體、蛋白、核酸等，并有一些免疫層析試紙已經(jīng)獲批上市.本文分類總結(jié)并比較了最近報道的基于免疫層析技術(shù)的新冠肺炎感染診斷方法，并簡單介紹了目前已獲批上市的新冠肺炎感染診斷免疫層析試紙，最后對免疫層析技術(shù)在新冠肺炎感染診斷領(lǐng)域的應(yīng)用前景進行了展望.

Fig.1 Schematic diagram of the structure of SARS?CoV?2[5]

1 免疫層析技術(shù)用于SARS-CoV-2抗體檢測

抗體（Antibody）是機體在受到外界抗原刺激后由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的可以與對應(yīng)抗原結(jié)合的免疫球蛋白，包括免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）等5大類.抗體的檢出表明機體內(nèi)已存在外界抗原，因此抗體被廣泛選為生物標(biāo)志物用于病毒感染檢測.

1.1 膠體金免疫層析試紙用于SARS-CoV-2抗體檢測

膠體金免疫層析試紙是最常見的抗體免疫層析檢測模式.Peng等［34］報道了一種可以同時檢測SARS-CoV-2的抗N蛋白和S蛋白RBD的IgM和IgG抗體的免疫層析試紙（圖2）.該方法在NC膜檢測線處固定鼠抗人IgG抗體或者鼠抗人IgM抗體，并在金納米顆粒表面修飾重組N蛋白抗原或重組RBD蛋白抗原.待測樣本流經(jīng)NC膜時，若樣本中存在對應(yīng)IgG或IgM抗體，檢測線處便會形成免疫復(fù)合物并出現(xiàn)紅色條帶.使用便攜式閱讀器對信號進行讀取，可以在15 min內(nèi)檢測出血清中的抗N和抗S-RBD IgG/IgM.該研究使用此免疫層析試紙檢測了108個臨床樣本，并與化學(xué)發(fā)光（Chemiluminescence，CL）免疫分析試劑盒的檢測結(jié)果進行對比，結(jié)果表明Kappa系數(shù)達到了0.804（P<0.001）.Peng等［35］還報道了一種基于激光的光學(xué)讀出方法，用于提高膠體金免疫層析試紙的檢測靈敏度.樣品沿試紙流動時，SARS-CoV-2的IgG抗體被固定在檢測線處的抗人IgG抗體捕獲，然后再與包被有SARS-CoV-2 S蛋白的AuNPs結(jié)合.由于表面等離子共振現(xiàn)象（SPR），AuNPs可以對532 nm光子產(chǎn)生強烈吸收.該研究將532 nm的激光分成兩部分，分別用于AuNPs檢測和激光功率監(jiān)控.將激光垂直射到檢測試紙上，然后用光子探測器通過兩透鏡圖像系統(tǒng)對AuNPs對激光的吸收信號進行收集并分析.研究結(jié)果表明，當(dāng)IgG的濃度大于10 ng/mL時才能在試紙上產(chǎn)生可視條帶；但是使用激光光學(xué)分析方法進行分析時，IgG的檢出限可以達到0.1 ng/mL，證明了使用激光光學(xué)分析方法可將檢測SARS-CoV-2的IgG抗體的靈敏度提升100倍.Zeng等［36］也報道了一種基于膠體金的免疫層析試紙，可以在15 min內(nèi)同時檢測SARSCoV-2的IgM和IgG抗體.該研究通過檢測SARS-CoV-2陽性與陰性人員的血液樣本，得出該試紙的檢測特異度（指陰性樣本中被判定為陰性的樣本比例，即真陰性樣本比例）和敏感度（指陽性樣本中被判定為陽性的樣本比例，即真陽性樣本比例）分別達到100%和85.29%.與單IgM或者IgG檢測試紙相比，IgG-IgM結(jié)合的檢測試紙具有更高的敏感度.

Fig.2 SARS?CoV?2 antibody detection with GLFA[34]

Roda等［37］報道了一種基于光學(xué)/化學(xué)發(fā)光雙讀出的膠體金免疫層析試紙用于快速檢測COVID-19患者唾液和血清中的IgA抗體.患者唾液或者血清樣本中的抗SARS-CoV-2 IgA被SARS-CoV-2的N蛋白特異性捕獲在檢測線處，并且被AuNPs染色或者被辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗IgA標(biāo)記.對于基于AuNPs的光學(xué)IgA免疫層析試紙，使用智能手機相機對在檢測線處形成的色帶進行成像進而進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和定量；對于化學(xué)發(fā)光檢測，將免疫捕獲后的層析試紙與預(yù)先浸漬過化學(xué)發(fā)光底物的玻璃纖維接觸，使用配有CCD相機的便攜設(shè)備對化學(xué)發(fā)光信號進行捕獲與分析.光學(xué)/化學(xué)發(fā)光雙讀出免疫層析試紙可以在15 min之內(nèi)檢測到唾液/血清中SARS-CoV-2 IgA，化學(xué)發(fā)光模式的檢測靈敏度較比色模式提高10倍以上.

Wen等［38］報道了一種SARS-CoV-2 IgG檢測免疫層析試紙，并使用55個臨床確診的新型冠狀病毒患者的血清樣本評估了該試紙的檢測性能.與RT-PCR檢測結(jié)果進行對比發(fā)現(xiàn)，免疫層析試紙的敏感度達到69.1%.Cavalera等［39］開發(fā)了一種可以快速檢測抗SARS-CoV-2的N蛋白的總免疫球蛋白（IgG，IgM和IgA）的免疫層析試紙，并檢測了147個臨床樣本（包括62個SARS-CoV-2陽性樣本和85個陰性對照樣本），其診斷特異度和敏感度分別達到100%和94.6%，與ELISA檢測結(jié)果高度一致.

1.2 基于其它納米材料的免疫試紙用于SARS-CoV-2抗體檢測

除金納米顆粒外，其它納米材料也被用于SARS-CoV-2抗體免疫層析檢測.Chen等［40］報道了一種基于鑭系元素?fù)诫s的聚苯乙烯納米顆粒（LNP）的免疫層析試紙，用于人血清的抗SARS-CoV-2 IgG抗體快速檢測［圖3（A）］.該免疫層析試紙的NC膜上固定有SARS-CoV-2的N蛋白，用于SARS-CoV-2 IgG抗體的捕獲；含有鑭系元素?fù)诫s的聚苯乙烯納米顆粒則偶聯(lián)有鼠抗人IgG抗體，用于SARS-CoV-2 IgG抗體的識別.樣本流經(jīng)NC膜后，將試紙裝入便攜式熒光讀取裝置中對熒光信號進行捕獲與分析.整個檢測過程僅需10 min，而且所需樣本量非常少（血清樣本1∶1000稀釋使用）.利用該熒光檢測試紙對7個陽性樣本和12個陰性樣本進行檢測，并將其檢測結(jié)果與RT-PCR結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，Kappa檢測系數(shù)達到0.890（P<0.001），表明試紙的檢測結(jié)果與RT-PCR結(jié)果之間沒有統(tǒng)計學(xué)意義的顯著差異.Feng等［41］使用基于鑭系元素Eu（Ⅲ）摻雜熒光微球的免疫層析試紙對血清中COVID-19的特異性IgG和IgM抗體進行快速的定性/半定量測定.利用該熒光免疫試紙對COVID-19患者和健康人的血清和血漿樣本進行檢測分析，檢測敏感度和特異度分別為98.72%和100%（IgG）以及98.68%和93.10%（IgM）.Wang等［42］制備了一種基于硒納米顆粒的免疫層析試紙，用于血樣本清中SARS-CoV-2的IgG和IgM抗體檢測.經(jīng)過測試，該免疫試紙在人血清樣本中檢測IgG和IgM抗體的檢出限分別達到了5 ng/mL和20 ng/mL.與RT-PCR檢測相比，該試紙能在10 min內(nèi)得出檢測結(jié)果，而且其對90份COVID-19陽性患者和263份陰性對照樣本的檢測敏感度和特異度分別達到93.33%和97.34%.Li等［43］使用量子點（QDs）對SARSCoV-2抗體進行免疫層析檢測.與傳統(tǒng)的膠體金免疫試紙相比，量子點熒光免疫試紙的靈敏度至少提高了1個數(shù)量級.

Fig.3 LFA with different nanomaterials for the detection of SARS?CoV?2 antibody

Wang等［44］設(shè)計了新型比色/熒光雙模SiO2@Au@QDs納米顆粒作為免疫層析試紙的多功能標(biāo)記探針，用于SARS-CoV-2的IgG和IgM抗體的同時檢測.該免疫層析試紙僅需要1μL的血清樣本便可在15 min內(nèi)完成抗體檢測，靈敏度比傳統(tǒng)的膠體金試紙高100倍.對57份臨床樣本（16份SARS-CoV-2陽性患者的血清樣本以及41份陰性血清樣本）的檢測結(jié)果顯示，試紙的敏感度和特異度均達到了100%.

Liu等［45］報道了一種基于表面增強拉曼散射（SERS）的免疫試紙，用于SARS-CoV-2的IgG和IgM抗體同時檢測［圖3（B）］.在SiO2核上包覆含有雙層拉曼染料的Ag外殼結(jié)構(gòu)用作SERS報告探針，并與SARS-CoV-2的S蛋白偶聯(lián)用于SARS-CoV-2 IgG和IgM檢測.利用便攜式拉曼儀器讀取檢測區(qū)的SERS信號強度可對IgM和IgG進行高靈敏檢測，其檢出限比傳統(tǒng)免疫層析試紙高出800倍.

Yakoh等［46］開發(fā)了一種用于診斷COVID-19的電化學(xué)紙基分析設(shè)備（Electrochemical paper-based analytical device，ePAD）［圖3（C）］.該設(shè)備包括3個具有不同功能的部分：ePAD工作區(qū)、ePAD檢測區(qū)與ePAD回收區(qū).將SARS-CoV-2 RBD通過氧化石墨烯（GO）固定在ePAD工作區(qū)以捕獲SARS-CoV-2抗體，通過方波伏安法（Square wave voltammetry，SWV）對電化學(xué)反應(yīng)進行監(jiān)控，并根據(jù)形成免疫復(fù)合物后SWV的信號應(yīng)答對電化學(xué)信號進行分析.ePAD回收區(qū)被封裝于設(shè)備內(nèi)部，可以防止生物危害樣品使用后暴露在環(huán)境中引起污染.該ePAD對SARS-CoV-2 IgG和IgM的檢出限分別達到了0.96和0.14 ng/mL，比傳統(tǒng)的膠體金免疫層析方法提高了3個數(shù)量級.利用制備的ePAD測試檢測真實血清樣本中的IgG和IgM抗體，并與商業(yè)ELISA試劑盒檢測結(jié)果進行對比，其檢測敏感度和特異度分別達到了100%和90%，表明該ePAD可以用于COVID-19患者的血清樣本抗體檢測.

抗體檢測是基于免疫層析技術(shù)的病毒感染診斷的重要方法之一，也是一種相對成熟的感染診斷檢測方法.但由于抗體存在于血液中，抗體檢測須以血清、血漿或者全血作為檢測樣本，血液樣本檢測增加了采樣難度.此外，抗體在機體發(fā)生免疫應(yīng)答之后才會產(chǎn)生，因此抗體檢測具有一定窗口期，只能判定既往感染的發(fā)生，無法在感染初期篩查感染者.然而，抗體可以用于評估機體對新冠肺炎感染的抵抗力，同時也是疫苗有效性評價的重要指標(biāo).

2 免疫層析技術(shù)用于SARS-CoV-2抗原檢測

除抗體外，新冠病毒相關(guān)抗原（如S蛋白或N蛋白等）也可以作為靶標(biāo)用于新冠病毒感染診斷［47］.Liu等［48］開發(fā)了一種基于Co-Fe@Hemin納米酶的化學(xué)發(fā)光試紙用于SARS-CoV-2的RBD蛋白檢測［圖4（A）］.Co-Fe@Hemin納米酶探針具有很高的過氧化物酶活性，可以催化H2O2與魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號.該方法將SARS-CoV-2的RBD捕獲抗體與檢測抗體分別固定在NC膜檢測線上或偶聯(lián)在合成的Co-Fe@Hemin納米酶上作為檢測探針.當(dāng)SARS-CoV-2 RBD蛋白存在時，檢測線處會形成夾心免疫復(fù)合物，通過智能手機或者CCD相機捕獲化學(xué)發(fā)光信號可以實現(xiàn)對RBD蛋白的定量檢測.該化學(xué)發(fā)光試紙可在16 min內(nèi)實現(xiàn)SARS-CoV-2或SARS-CoV-2的RBD蛋白檢測，對SARS-CoV-2假病毒的檢出限達到360 TCID50/mL（TCID50：50%tissue culture infective dose，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）.

Grant等［49］報道了一種用于檢測SARS-CoV-2的N蛋白的層析方法.先將含有SARS-CoV-2的N蛋白的樣品與分別偶聯(lián)有N蛋白抗體的紅色乳膠珠、偶聯(lián)有雞IgY的藍色乳膠珠（作為質(zhì)控）以及生物素化的N蛋白抗體在96孔板中預(yù)混合，插入試紙后，固定在檢測線處的鏈霉親和素使N蛋白-紅色乳膠珠結(jié)合物在檢測線處富集，而固定在質(zhì)控線處的山羊抗雞IgY抗體使藍色乳膠珠結(jié)合物在質(zhì)控線處聚集.利用便攜式光學(xué)閱讀器分別測量560和660 nm處的紅色和藍色乳膠珠的吸光度進而進行信號分析，實現(xiàn)了SARS-CoV-2 N蛋白檢測，檢出限達到0.65 ng/mL.Kim等［50］使用噬菌體展示技術(shù)制備了4種對SARS-CoV-2的N蛋白具有很強特異性和親和力的融合抗體（12H1，12H8，12B3和1G5），并以此為基礎(chǔ)發(fā)展了用于N蛋白檢測的層析試紙.將含SARS-CoV-2的樣品加至層析試紙樣品墊，樣本中的N蛋白被與纖維素納米珠偶聯(lián)的檢測抗體識別并被捕獲抗體捕獲，進而在檢測線處形成三明治復(fù)合物，通過觀察檢測線處條帶可以判定SARS-CoV-2的存在.利用最佳抗體對（12H8-12H1抗體對）的免疫試紙對SARS-CoV-2病毒進行檢測，其檢出限為2.5×104pfu/反應(yīng)（pfu：plaque forming unit，噬菌斑形成單位數(shù)）.

除抗體外，其它親和識別分子也可用于SARS-CoV-2病毒蛋白檢測.Lee等［51］構(gòu)建了由ACE2和S蛋白抗體配對的層析試紙，用于SARS-CoV-2的S1蛋白檢測［圖4（B）］.該研究首先確認(rèn)ACE2與抗體（包括CR3022，F(xiàn)26G19和S1-mAb）配對可以準(zhǔn)確識別SARS-CoV-2的S1蛋白，而不會與SARS-CoV的S1蛋白和MERS-CoV的S1蛋白發(fā)生交叉反應(yīng).隨后使用ACE2捕獲SARS-CoV-2的S1蛋白，并使用與纖維素納米珠偶聯(lián)的SARS-CoV-2 S1抗體進行層析檢測.實驗結(jié)果顯示，基于ACE2的層析試紙對SARS-CoV-2的S1重組蛋白的檢出限小于5 ng/反應(yīng).臨床樣本檢測結(jié)果顯示，該方法對COVID-19患者的鼻拭子樣本的檢出限為1.86×105copies/mL，并對健康人的鼻拭子樣本沒有信號反應(yīng).Baker等［52］發(fā)現(xiàn)N-乙酰神經(jīng)氨酸對SARS-CoV-2的S蛋白具有較高的親和力，并在此基礎(chǔ)上利用層析方法對SARSCoV-2的S蛋白進行檢測.將含有N-乙酰神經(jīng)氨酸的聚糖固定在檢測線處用于捕獲SARS-CoV-2的S蛋白，同時將N-乙酰神經(jīng)氨酸衍生物與AuNPs偶聯(lián)并組裝成雜化納米顆粒用于SARS-CoV-2 S蛋白的識別與信號讀出.該層析試紙對S蛋白的檢出限達到了5μg/mL，并可成功檢測包裝有SARS-CoV-2 S蛋白的假病毒顆粒.

病毒抗原檢測也是一種常見的病毒感染層析檢測方法，相比于抗體檢測，抗原檢測直接以病毒相關(guān)抗原為檢測對象，無窗口期，因此可以用于感染篩查.此外，抗原檢測以咽拭子、鼻拭子等為檢測樣本，無需病毒裂解，相比于抗體檢測與核酸檢測取樣更為簡單.然而，與核酸檢測相比，抗原檢測靈敏度較低.另外，感染風(fēng)險是抗原檢測過程中不可忽視的一個重要方面.

Fig.4 LFA for detection of SARS?CoV?2 antigen

3 層析技術(shù)用于SARS-CoV-2核酸檢測

核酸也是新冠病毒感染篩查的重要靶標(biāo)之一.傳統(tǒng)的免疫層析核酸檢測通常將捕獲探針固定于NC膜上，而檢測探針上標(biāo)記有報告分子.當(dāng)靶標(biāo)核酸存在時，捕獲探針與檢測探針同時與靶標(biāo)核酸雜交，通過讀取檢測區(qū)域的報告信號實現(xiàn)靶標(biāo)核酸檢測.將近年來興起的CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）基因編輯技術(shù)與層析技術(shù)相結(jié)合的核酸檢測策略，則為病毒核酸的快速靈敏檢測提供了新的選擇.

Fig.5 SARS?CoV?2 nucleic acid detection based on non?CRISPR principle

3.1 基于非CRISPR方法的SARS-CoV-2核酸層析檢測

Yu等［53］開發(fā)了一種結(jié)合RT-PCR的層析試紙用于同時檢測SARS-CoV-2的RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）基因、開放閱讀框3a（Open reading frame 3a，ORF3a）基因和N蛋白基因［圖5（A）］.該方法在試紙的檢測線上分別固定了RdRp基因、ORF3a基因和N基因的捕獲探針，當(dāng)Cy5標(biāo)記的RT-PCR擴增產(chǎn)物通過檢測線時，分別與各自的捕獲探針雜交并在檢測線處產(chǎn)生熒光信號.所建立的層析試紙測定法對SARS-CoV-2的RdRp基因、ORF3a基因和N蛋白的檢出限均達到10 copies/反應(yīng).利用該層析試紙對162個臨床樣本進行檢測，其檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果高度一致，整體一致性達到99.4%（陽性預(yù)測率：100%，陰性預(yù)測率：99.0%）.

Zhang等［54］報道了一種結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（RT-LAMP）的層析試紙，用于可視化檢測SARS-CoV-2的N基因和開放閱讀框1ab（Opening reading frame 1ab，ORF1ab）基因［圖5（B）］.將待測樣本先用裂解液處理，然后利用外引物、生物素標(biāo)記的內(nèi)引物和熒光素（FITC）標(biāo)記的dUTP快速進行RT-LAMP擴增以產(chǎn)生帶標(biāo)記的擴增產(chǎn)物.將試紙插入反應(yīng)試管中，隨著擴增產(chǎn)物沿條帶流動，檢測線處的抗FITC抗體可以捕獲擴增產(chǎn)物和鏈霉親和素包被的顆粒復(fù)合物，并在檢測線處形成紅色條帶.擴增后的試紙檢測只需要3 min即可完成信號的讀取.RT-LAMP-層析試紙對SARS-CoV-2假病毒的N基因和ORF1ab基因的檢測限低于2 copies/μL.利用RT-LAMP-層析試紙系統(tǒng)檢測了12份臨床RNA樣本（8份COVID-19陽性患者樣本和4份陰性樣本），其檢測結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果呈現(xiàn)100%的一致性.

Zhu等［55］將多重RT-LAMP技術(shù)和納米顆粒相結(jié)合的層析試紙用于檢測SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因.ORF1ab基因的RT-LAMP產(chǎn)物的一端標(biāo)記有FITC，可以被位于檢測線1處的抗FITC抗體捕獲；N基因的RT-LAMP產(chǎn)物末端標(biāo)記有地高辛（Dig），可以被固定在檢測線2處的抗Dig抗體捕獲.ORF1ab和N基因RT-LAMP產(chǎn)物的另一端使用生物素進行標(biāo)記，進而結(jié)合鏈霉親和素偶聯(lián)的有色納米顆粒以產(chǎn)生可視化結(jié)果.該層析試紙對SARS-CoV-2的ORF1ab和N基因的檢出限均達到12 copies/反應(yīng).Varona等［56］利用分子信標(biāo)（Molecular beacon，MB）探針和RT-LAMP對SARS-CoV-2的ORF1a序列進行層析檢測.該MB-LAMP-層析試紙將鏈霉親和素固定在檢測線用于捕獲生物素化的引物.將正向環(huán)引物轉(zhuǎn)化為標(biāo)記有FAM熒光基團的MB，并對反向環(huán)引物的5端進行生物素化，可以將生物素化的引物引入擴增子中.MB通過與互補的環(huán)系列雜交以實現(xiàn)ORF1a基因特異性識別，只有當(dāng)生物素化的引物引入擴增子并與MB的互補環(huán)序列雜交時才能在層析試紙的檢測線上出現(xiàn)檢測信號.該研究還開發(fā)了一種3D打印設(shè)備，以防止在LAMP之后打開容器所造成的污染.該方法對SARS-CoV-2的ORF1a基因的檢測靈敏度與RT-PCR靈敏度相當(dāng)，可以達到22.4 copies/反應(yīng).

Wu等［57］提出了基于核酸序列依賴性擴增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）測序的高通量測試（Isothermal NASBA sequencing-based high-throughput test，INSIGHT）方法.這種方法結(jié)合了等溫NASBA和下一代測序（Next-generation sequencing，NGS）技術(shù)，主要分為2個階段：第一階段為NASBA反應(yīng)階段，使用逆轉(zhuǎn)錄和T7 RNA聚合酶介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)錄來快速擴增目標(biāo)RNA，通?？梢栽? h內(nèi)實現(xiàn)超過10億倍的擴增［58］.在此階段，該研究可以使用層析試紙實現(xiàn)SARS-CoV-2核酸可視化檢測.在試紙的檢測線處固定抗熒光素酰胺（Fluorescein amidite，F(xiàn)AM）抗體，并設(shè)計了2個可與NASBA產(chǎn)物結(jié)合的RNA序列，同時一個RNA的一端標(biāo)記有FAM，可被固定在檢測線上的抗-FAM抗體捕獲，另一個RNA序列的一端標(biāo)記有生物素，可以與中性生物素標(biāo)記的碳納米顆粒結(jié)合，從而使生物素標(biāo)記的碳納米顆粒在檢測線處聚集，進而產(chǎn)生可視化信號.該層析試紙的檢出限達到2.5 copies/μL.第二階段為NGS檢測階段.在NASBA擴增階段對產(chǎn)物進行分別編碼，之后將擴增產(chǎn)物一同轉(zhuǎn)入測序儀進行高通量測序分析，可以進一步降低檢測的假陰性或假陽性，以提高檢測的準(zhǔn)確性.

Wang等［59］發(fā)展了一種無擴增的用于對SARS-CoV-2的RNA（包括ORF1ab基因、E基因和N基因）進行熒光檢測的核酸免疫測定方法［圖5（C）］.該研究使用的S9.6單克隆抗體可以對DNA-RNA雜交體進行特異性識別與捕獲.檢測時，將咽拭子或者痰液樣品中的SARS-CoV-2裂解并釋放出RNA，釋放的RNA可與特定的DNA反義序列雜交，產(chǎn)生的RNA-DNA雜交雙鏈被使用螯合物熒光納米顆粒（Fluorescent nanoparticles，F(xiàn)NP）標(biāo)記的S9.6抗體捕獲，當(dāng)通過檢測區(qū)域時，復(fù)合物再次被固定在檢測線處的S9.6單克隆抗體捕獲并產(chǎn)生熒光信號.利用該試紙對734份樣本（593份咽拭子和141份痰液樣本）進行檢測并與RT-PCR檢測結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)該層析試紙對這2種類型樣本的檢測敏感度和特異度分別達到100%和99%.

3.2 基于CRISPR方法的SARS-CoV-2核酸免疫層析檢測

CRISPR是一種近年來新興的基因編輯方法［60，61］.當(dāng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的向?qū)NA（Small guide RNA，sgRNA）與靶序列結(jié)合后，會激活Cas9酶的DNA酶切活性，并在sgRNA的引導(dǎo)下完成對目的基因的編輯［62，63］.研究發(fā)現(xiàn)，與Cas9不同，Cas12a酶在目的基因激活后，可以實現(xiàn)對任意DNA序列的切割［64，65］，而Cas13a酶激活后則可以對任意RNA序列進行切割［66］.由于其獨特的酶切放大能力，CRISPR/Cas方法迅速發(fā)展成為高靈敏分子診斷方法.

Fig.6 Schematic diagram of LFA detection of SARS?CoV?2 nucleic acid based on CRISPR technology

Broughton等［67］報道了一種基于CRISPR-Cas12a的DETECTR（DNA Endonuclease-Target CRISPR Trans Reporter）層析試紙，并以人核糖核酸酶P（Human ribonuclease P，RNase P）基因作為對照用于檢測SARS-CoV-2的E基因和N基因［圖6（A）］.該研究首先設(shè)計了針對SARS-CoV-2的E和N基因的引物，并使用RT-LAMP技術(shù)對提取自鼻拭子或者咽拭子樣本中的RNA進行RT-LAMP擴增；然后設(shè)計了Cas12a gRNA以特異性識別SARS-CoV-2的E基因和N基因.識別出匹配的靶標(biāo)后，用Cas12a gRNA復(fù)合物對FAM-生物素報告分子進行切割，隨后令切割后的報告分子流向檢測線，在層析試紙的檢測線處產(chǎn)生熒光信號；而未切割的FAM-生物素報告分子則在質(zhì)控處被捕獲.整個檢測可以在40 min內(nèi)完成，且其檢測結(jié)果顯示，RT-LAMP/Cas12a DETECTR方法對SARS-CoV-2的RNA的檢出限為10 copies/μL.利用SARS-CoV-2 DETECTR對83份呼吸拭子樣本進行檢測，其陽性預(yù)測率和陰性預(yù)測率分別達到了95%和100%，可見其檢測準(zhǔn)確性與RT-qPCR相當(dāng).Ali等［68］也制備了一種基于RT-LAMP和CRISPRCas12a的層析試紙用于快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測SARS-CoV-2.該研究也使用RT-LAMP進行基因擴增，并使用CRISPR-Cas12a實現(xiàn)特異性識別，只有存在特定的crRNA和RT-LAMP擴增子的情況下才能切割報告因子.與DETECTR方法不同，該研究使用非靶向熒光淬滅劑標(biāo)記的ssDNA（ssDNA-FQ）作為報告分子，報告分子被激活的Cas12切割后產(chǎn)生熒光信號.該系統(tǒng)的檢出限也達到了10 copies/反應(yīng)，但是整體檢測時間需要1 h.真實臨床樣本檢測結(jié)果表明，該方法的檢測結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果100%一致.

Nguyen等［69］開發(fā)了基于CRISPR-Cas12a的免疫層析試紙用于分析檢測SARS-CoV-2的N基因.該研究使用RT-LAMP技術(shù)對樣本中提取的RNA進行擴增，并對crRNA進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的Cas12a/crRNA與野生型Cas12a/crRNA相比，其催化活性和切割效率提高了3.5倍，對靶標(biāo)的識別特異性也提高了8.8倍.進行靶標(biāo)識別后，Cas12a/crRNA對生物素-熒光素（Biotin-FITC）報告分子進行切割，切割后的報告分子與膠體金標(biāo)記的FITC特異性抗體結(jié)合并在試紙檢測線處被特異性捕獲，整個檢測可以在40~60 min內(nèi)完成，而且其檢測靈敏度提高了23倍.

Sun等［70］報道了一種逆轉(zhuǎn)錄重組聚合酶等溫擴增（Reverse transcription recombinase polymerase amplification，RT-RPA）技術(shù)和CRISPR-Cas12a結(jié)合的層析檢測試紙，用于SARS-CoV-2的RdRp和N基因.激活后的Cas12a識別RT-RPA擴增產(chǎn)物后對FAM-生物素報告分子進行切割，并進一步在檢測線處產(chǎn)生信號.結(jié)果顯示，基于RT-RPA與CRISPR-Cas12a的試紙對SARS-CoV-2基因的檢出限達到2.5 copies/μL.Zhu等［71］將多交叉置換擴增（Multiple cross displacement amplification，MCDA）技術(shù)與CRISPR-Cas12a技術(shù)相結(jié)合用于SARS-CoV-2核酸層析檢測.該研究首先針對SARS-CoV-2的ORF1ab和N基因設(shè)計了2種MCDA引物用于樣本中RNA的擴增，并設(shè)計了2個CRISPR-Cas12a/crRNA用于靶標(biāo)的特異性識別.由MCDA產(chǎn)生的擴增子可以誘導(dǎo)CRISPR-Cas12a/crRNA復(fù)合物切割末端修飾有生物素和FITC的單鏈報告分子.當(dāng)未切割以及切割的報告分子流經(jīng)試紙時，先與修飾有鏈霉親和素的AuNPs結(jié)合，然后分別在固定有FITC抗體和生物素-牛血清白蛋白的質(zhì)控線和檢測線處被捕獲.整個過程可以在1 h內(nèi)完成，檢出限達到7 copies/反應(yīng).利用該方法對37份COVID-19陽性患者的呼吸拭子樣本和77個陰性樣本進行檢測并與RT-PCR的檢測結(jié)果對比，結(jié)果顯示該試紙的檢測敏感度和特異度均為100%.

Patchsung等［72］報告了一種基于CRISPR-Cas13a的SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking）方法用于檢測SARS-CoV-2的S基因、N基因和ORF1ab基因［圖6（B）］.該方法首先利用RT-RPA技術(shù)將SARS-CoV-2病毒RNA擴增為DNA，再通過T7酶轉(zhuǎn)錄成RNA.利用Cas13a-crRNA復(fù)合物與擴增的RNA靶標(biāo)結(jié)合并激活Cas13a的活性，從而切割生物素-熒光素RNA報告分子，被切割的RNA報告分子在試紙的檢測線處被捕獲并產(chǎn)生可視化的檢測信號.該試紙的檢出限達到42 copies/反應(yīng).對154個臨床樣本的檢測結(jié)果顯示，SHERLOCK系統(tǒng)對于SARS-CoV-2檢測的敏感度和特異度分別達到97%和100%.

將等溫擴增方法（LAMP和RPA）與CRISPR/Cas12a或CRISPR/Cas13a系統(tǒng)相結(jié)合，可以實現(xiàn)對SARS-CoV-2基因的高靈敏檢測，但由于Cas12a與Cas13a對被切割核酸序列不具有選擇性，上述方法難以實現(xiàn)多基因同時檢測.Xiong等［73］開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的三線層析試紙（Triple-line lateral flow assay，TL-LFA），并與RT-RPA技術(shù)結(jié)合，實現(xiàn)了SARS-CoV-2的E和ORF1ab雙基因同時快速［圖6（C）］.該研究首先使用多重RT-RPA技術(shù)對病毒的E基因和ORF1ab基因進行擴增，并使用生物素和地高辛分別對2種正向擴增引物進行修飾；然后設(shè)計了2個包含可變識別序列和恒定支架序列的sgRNA（sgRNA1和sgRNA2）分別用于靶向生物素標(biāo)記的E基因擴增子和地高辛標(biāo)記的ORF1ab基因擴增子，此外在RNA的支架序列中還含有可以與AuNP-DNA探針雜交的結(jié)合序列.2種Cas9/sgRNA先分別與生物素標(biāo)記E基因擴增子和地高辛標(biāo)記ORF1ab基因擴增子雜交，雜交復(fù)合物流過免疫層析試紙時，AuNPs-DNA探針先通過核酸雜交與Cas9/sgRNA的支架序列結(jié)合，然后在流經(jīng)2條檢測線時分別被預(yù)先包被的鏈霉親和素和抗地高辛抗體捕獲.由于AuNPs的聚集，可以在檢測線處觀察到紅色條帶.使用該方法對SARS-COV-2標(biāo)準(zhǔn)品的E基因和ORF1ab基因進行檢測，其檢測靈敏度達到4 copies/μL.進一步對64份鼻咽拭子臨床樣本進行檢測，并與RT-PCR檢測結(jié)果進行對比，結(jié)果顯示該方法的陰性和陽性預(yù)測率分別達到100%和97.14%.

基于層析技術(shù)的核酸檢測方法是新型的病毒感染篩查方式.核酸層析檢測同樣以鼻拭子、咽拭子等為檢測對象，取樣簡單，無檢測窗口期，但需要病毒裂解、核酸釋放及核酸擴增等操作，檢測時間也較抗原檢測更長.常規(guī)的核酸層析檢測在完成核酸提取與擴增后通過識別擴增產(chǎn)物序列或引物標(biāo)記分子等實現(xiàn)擴增產(chǎn)物捕獲與檢測.近年來新興的基于CRISPR技術(shù)的核酸層析檢測方法，通過Cas蛋白識別核酸擴增產(chǎn)物并激活其酶切活性用于報告分子切割并放大讀出信號，在此基礎(chǔ)上可以實現(xiàn)靶標(biāo)核酸高靈敏層析檢測，為新冠病毒核酸層析檢測提供了新思路.

4 新冠肺炎診斷相關(guān)免疫層析試紙市場化情況

新冠肺炎感染診斷與篩查是控制疫情的重要手段之一.新冠肺炎疫情發(fā)生后，國家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）立即啟動醫(yī)療器械應(yīng)急審批程序，全力加快審評審批速度，并在2020年1月26日應(yīng)急批準(zhǔn)首批4個新冠肺炎診斷產(chǎn)品上市.截止到2021年6月，國家藥品監(jiān)督管理局共審批通過60款新冠肺炎診斷產(chǎn)品，其中包括15款免疫層析檢測產(chǎn)品.目前已審批通過的免疫層析檢測產(chǎn)品包括11款抗體檢測產(chǎn)品，2款N蛋白檢測產(chǎn)品以及2款核酸檢測產(chǎn)品，詳細(xì)信息如表1所示.

Table 1 NMPA-approved lateral flow test strips for the COVID-19 infection diagnosis

為了應(yīng)對各類醫(yī)療器械的緊缺，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）也在2020年2月初發(fā)布了應(yīng)急使用授權(quán)（EUA），并在2020年2月4日緊急授權(quán)了第一款新冠肺炎檢測產(chǎn)品，即由美國疾病預(yù)防控制中心（Center for Disease Control and Prevention，CDC）報道的新冠病毒RT-PCR診斷試劑.截至2021年6月，美國FDA已經(jīng)累計授權(quán)了350款新冠肺炎檢測產(chǎn)品，其中包括40款免疫層析檢測產(chǎn)品.目前已獲美國FDA EUA的新冠肺炎診斷相關(guān)免疫層析產(chǎn)品的檢測靶標(biāo)包括新冠病毒相關(guān)抗體與抗原，但尚未有免疫層析核酸檢測產(chǎn)品獲批，抗原檢測以N蛋白為主，詳細(xì)信息如表2所示.

Table 2 FDA-approved lateral flow test strips for the COVID-19 infection diagnosis

Continued

5 結(jié) 論

病毒感染快速篩查對于遏制新冠肺炎疫情蔓延具有重要意義.免疫層析技術(shù)由于其操作簡單、檢測時間短及結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)勢而成為新冠肺炎感染快速篩查的重要手段之一.迄今，已有多種針對新冠病毒抗體、蛋白和核酸等不同靶標(biāo)的免疫層析檢測方法被報道.然而，這些方法具有一定局限性：抗體檢測面臨取樣難度大、窗口期無法檢測等問題；蛋白檢測需要考慮檢測過程中防護感染；核酸檢測則存在需要核酸提取、擴增等步驟，操作更為繁瑣，檢測時間也相對更長等問題.此外，目前已有一部分免疫層析檢測產(chǎn)品已經(jīng)獲批上市.隨著更多新型的感染快速篩查方法被建立，相信新冠肺炎疫情最終一定能被有效遏制.