仿刺參葡聚糖結(jié)合蛋白的重組表達(dá)與功能研究

賈昌鋒，陳知雨，雷一萱，張 雷，孔令明

（山東大學(xué)海洋學(xué)院，山東 威海 264209）

機(jī)體免疫系統(tǒng)是生物抵抗病原體或病原微生物侵害的主要手段。由于無脊椎動(dòng)物缺乏抗體生成機(jī)制，因此無法進(jìn)行適應(yīng)性免疫反應(yīng)，但它們卻具有高效的固有免疫［1］。固有免疫是用于生物機(jī)體免疫和防御的一種古老且高效的手段，能夠通過模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptor，PRR）識(shí)別外界的病原微生物，并將相關(guān)識(shí)別信號(hào)傳遞到細(xì)胞核中，進(jìn)而誘導(dǎo)相關(guān)的免疫效應(yīng)因子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［2，3］。β-1，3-葡聚糖結(jié)合蛋白（β-1，3-glucan-binding pro?tein，GBP）作為一種免疫應(yīng)答反應(yīng)的模式識(shí)別受體，可介導(dǎo)入侵病原體的識(shí)別，激活蛋白酶聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)抗菌肽的合成，提高對(duì)細(xì)菌的抵抗力，在生物的先天免疫中起著關(guān)鍵作用［4，5］。GBP 首次是從家蠶（Bom?byx mori）的血淋巴中分離出來［6］，而在甲殼動(dòng)物中，其在淡水螯蝦（Pacifastacus leniusculus）中最先被發(fā)現(xiàn)［7］。此外，GBP 與某些革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白（Gram-negative bacteria binding protein，GNBP）在對(duì)β-1，3 和β-1，3-1，4 葡聚糖酶的結(jié)合區(qū)域中表現(xiàn)出同源性，且其可以識(shí)別脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和β-1，3-葡聚糖（β-1，3-glucan，βG）［8］。目前，海洋無脊椎動(dòng)物中GBP 的研究主要集中在甲殼類和貝類中，如中國(guó)對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinen?sis）［9］、南美白對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）［10，11］、日本對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）［12］、羅氏沼蝦（Macro?brachium rosenbergii）［13］、短溝對(duì)蝦（Penaeus semisul?catus）［14］、文蛤（Meretrix meretrix）［15］等，結(jié)果表明它們?cè)谑艿讲≡碳r(shí)，會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)而參與到生物的先天免疫中［10，14］。

仿刺參（Apostichopus japonicus）隸屬棘皮動(dòng)物門（Echinodermata）海參綱（Holothuroidea）楯手目（As?pidochirotida）刺參科（Stichopodidae），為海味“八珍”之一，有著很高的醫(yī)藥和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［16-18］。其在中國(guó)山東和遼寧半島以及河北沿岸分布較為廣泛［19-21］。近年來，由于人們生活水平和健康意識(shí)的不斷提高，仿刺參市場(chǎng)需求量呈現(xiàn)逐年增加的態(tài)勢(shì)，水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模呈現(xiàn)持續(xù)擴(kuò)大態(tài)勢(shì)，使得仿刺參逐漸成為中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)物種之一［19］。據(jù)報(bào)道，當(dāng)前中國(guó)仿刺參水產(chǎn)養(yǎng)殖面積達(dá)238 183 hm2，產(chǎn)量高達(dá)174 340 t［22］。但由于持續(xù)惡化的海洋環(huán)境、海洋富營(yíng)養(yǎng)化程度的日趨加重，養(yǎng)殖周期長(zhǎng)和其自身免疫力低下等因素，仿刺參養(yǎng)殖業(yè)常會(huì)受到大規(guī)模的病害威脅，大范圍死亡事件時(shí)有發(fā)生。這極大地制約了仿刺參養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展［20，23］。而使用常見的化學(xué)藥物（如二氧化氯、高錳酸鉀、福爾馬林及抗生素等）進(jìn)行治療，會(huì)對(duì)仿刺參造成毒害作用。β-1，3-葡聚糖結(jié)合蛋白可增強(qiáng)生物抗菌力，但尚未見其在仿刺參中的相關(guān)報(bào)道。本研究利用分子生物學(xué)手段克隆仿刺參β-1，3-葡聚糖結(jié)合蛋白，并對(duì)其功能進(jìn)行探索，有助于了解仿刺參抵抗病原微生物入侵的機(jī)制，可為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)提供疾病防治的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 仿刺參 仿刺參（約65 g/只）購于威海帝王宮水產(chǎn)市場(chǎng)，試驗(yàn)前將其放于流動(dòng)海水池（溫度20 ℃）中飼養(yǎng)一周。然后選取健康的個(gè)體進(jìn)行解剖，并將解剖所得組織投入液氮，-80 ℃保存，用于總RNA 的提取。

1.1.2 試驗(yàn)細(xì)菌 利用3 種革蘭氏陽性菌和3 種革蘭氏陰性菌完成AJ-GBP 重組蛋白的相關(guān)活性分析。其分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黃短小桿菌（Curtobacterium luteum）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、大腸桿菌（Escherichia coli）和綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取與cDNA 合成 利用TransZol（TransGen Biotech 公司）從仿刺參各組織中提取總RNA，并用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 提取質(zhì)量。參照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Su?perMix（TransGen Biotech 公司）進(jìn)行cDNA 第一條鏈的合成，引物見表1。

表1 AJ-GBP 基因擴(kuò)增和表達(dá)所用引物

1.2.2 構(gòu)建AJ-GBP 原核重組表達(dá)載體 根據(jù)已測(cè)序的仿刺參轉(zhuǎn)錄組，獲得仿刺參GBP 的cDNA 序列并設(shè)計(jì)一對(duì)基因特異性引物（AJ-GBP F，AJ-GBP R），用于后續(xù)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR。PCR 反應(yīng)采用EasyPfu DNA Polymerase 試劑盒（TransGen Biotech公司）。其體系（50 μL）為：引物（8 μmol/L）各2 μL，2×easypfu 為25 μL，cDNA 為0.5 μL，ddH2O 為20.5 μL。 PCR 反應(yīng)條件如下：94 ℃4 min；94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。然后利用MiniBEST DNA Fragment Purification Kit（TaKa?Ra Bio 公司）完成PCR 產(chǎn)物的回收，并將獲得AJGBP基因片段與pEASY-Blunt E2（TransGen Biotech公司）進(jìn)行連接。利用BL21（DE3）pLysS Chemically Competent Cell 試劑（TransGen Biotech 公司）將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞，挑選5~10 個(gè)單菌落并接種于含有AMP（Solarbio 公司）濃度為100 μg/mL 的LB 肉湯（Solarbio 公司）。使用rTaq試劑（TaKaRa Bio 公司）和載體上引物（T7P）、AJ-GBP基因下引物（AJ-GBP R）進(jìn)行菌液PCR，鑒定陽性重組子。PCR 體系（50 μL）為：T7P（8 μmol/L）為2 μL，AJ-GBP R（8 μmol/L）為2 μL，rTaq為0.25 μL，dNTP（2.5 μmol/L）為4 μL，10×Buffer 為5 μL，菌液為0.5 μL，ddH2O 為36.25 μL。之后將確定的重組陽性子進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3AJ-GBP基因序列分析AJ-GBP的cDNA 序列和氨基酸序列利用國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和專業(yè)蛋白分析系（http：//www.expasy.org/）進(jìn)行分析。采用Sig?nalP 5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽。使用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy. org/）預(yù)測(cè)三維結(jié)構(gòu)。 使用SMART service（http：//smart. embl-heidelberg. de/） 和 HMMER（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）預(yù)測(cè)特定保守區(qū)域。利用NetNGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)。

1.2.4 AJ-GBP 蛋白重組表達(dá) 將重組陽性菌株按1∶10 接種于1 mL 含有AMP 的新鮮LB 肉湯中（AMP濃度為100 μg/mL），37 ℃180 r/min 過夜培養(yǎng)。然后將此菌液按1∶100 接種于150 mL 新鮮LB 肉湯（含有AMP，且AMP 濃度為100 μg/mL）中，37 ℃180 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6。加入IPTG（終濃度0.8 μmol/L），37 ℃180 r/min 培養(yǎng)5 h。離心收集細(xì)菌，用PBS 緩沖液清洗3 遍后重懸。將細(xì)菌破碎后12 000 r/min離心20 min 收集沉淀包涵體蛋白。沉淀包涵體蛋白先用Buffer A（5 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris-HCL）清洗2 次，再用Buffer B（5 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris-HCl，2 mol/L 尿素）清洗2 次，最后用Buffer C（10 mmol/L Tris-HCL 0.1 mol/L NaH2PO4，8 mol/L 尿素）溶解。采用0.45 μm 濾膜過濾后，再使用Milli?pore10 kd 超濾離心管（Millipore）純化重組蛋白，從而獲得純化重組蛋白。

1.2.5 AJ-GBP 重組蛋白活性分析

1）細(xì)菌凝集活性分析。將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃短小桿菌、大腸桿菌和綠膿桿菌分別接種到LB 肉湯中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6；鰻弧菌接種TCBS 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6。然后用無菌生理鹽水稀釋至OD600為0.001。5 000 r/min離心10 min 獲得沉淀菌體，用TBS 緩沖液洗滌沉淀3次后將沉淀重懸，使菌數(shù)為2×109個(gè)/mL。再將75 μL重組蛋白（約600 μg/mL）分別加入96 孔板中，加入30 μL 菌液，室溫孵育1 h。陰性對(duì)照組則用牛血清白蛋白（BSA）代替重組蛋白。在倒置顯微鏡下查看細(xì)菌凝集情況，從而獲得試驗(yàn)結(jié)果。

2）抑菌活性分析。將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃短小桿菌、大腸桿菌和綠膿桿菌分別接種到LB 肉湯中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6；鰻弧菌接種到TCBS 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6。然后把各菌液用新鮮培養(yǎng)基稀釋20 倍后備用。向96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中各加入100 μL 菌液和100 μL 重組蛋白并將二者混勻，37 ℃培養(yǎng)3 h 后，利用酶標(biāo)儀每隔30 min 記錄一次OD600值。BSA 為對(duì)照組，并設(shè)置3 個(gè)平行，統(tǒng)計(jì)OD600值并繪制不同組的生長(zhǎng)曲線。

3）細(xì)菌結(jié)合活性分析。將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃短小桿菌、大腸桿菌和綠膿桿菌分別接種到LB 肉湯中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6；鰻弧菌接種到TCBS 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6。將各菌液5 000 r/min 離心10 min 獲得沉淀菌體，利用TBS 緩沖液洗滌沉淀3 次后將沉淀重懸，使其含有3.5×108個(gè)/mL 細(xì)胞。取200 μL 菌懸液與200 μL 重組蛋白（約600 μg/mL）混勻，室溫條件下振蕩孵育30 min。5 000 r/min 離心10 min 棄上清液并收集菌體。利用TBS 洗滌菌體4 次，將第4 次洗滌液和菌體分別加入蛋白上樣緩沖液，然后進(jìn)行10 min 沸水浴，離心收集上清液后進(jìn)行SDS-PAGE 以及Western blotting 檢測(cè)目的條帶。

4）糖結(jié)合活性分析。分別取葡聚糖（80 μg/mL）、脂多糖（80 μg/mL）、肽聚糖（80 μg/mL）各50 μL 加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃過夜晾干；次日60 ℃孵育30 min，然后在每孔各加入200 μL 含5% 脫脂奶粉的PBS，37 ℃封閉2 h；倒掉封閉液，再在每孔中加入200 μL PBST（20%Tween-20∶PBS=1∶100）洗4 次，每次5 min；后在每孔中加入50 μL 蛋白（蛋白用含1% 脫脂奶粉的PBS 二倍梯度稀釋，共6 組蛋白；對(duì)照組使用BSA）；在細(xì)胞培養(yǎng)板中加入200 μL 的PBST（20%Tween-20∶PBS=1∶100）洗4 次，每次5 min；將一抗（大鼠抗His-tag 抗體）用1% 脫脂奶粉的PBS 按照1∶300 稀釋后將其在每孔中各加入100 μL，室溫條件下放置2 h；倒去一抗，再在細(xì)胞培養(yǎng)板中加入200 μL 的PBST（20%Tween-20∶PBS=1∶100）洗4 次，5 min/次；將辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗大鼠二抗用1% 脫脂奶粉的PBS 按1∶3 000 稀釋后在細(xì)胞培養(yǎng)板各加入100 μL，室溫條件下放置2 h；倒掉二抗后在每孔中加入200 μL 的PBST（20%Tween-20：PBS=1∶100）洗4 次，5 min/次。利用EL-TMB 顯色試劑盒（Sangon Biotech 公司）得到顯色結(jié)果，并在酶標(biāo)儀450 nm 處讀取吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 AJ-GBP 基因克隆與序列分析

克隆所得AJ-GBP基因全長(zhǎng)660 bp，開放閱讀框（Open reading frame，ORF）長(zhǎng)657 bp，可翻譯成219個(gè)氨基酸。AJ-GBP重組蛋白是糖基水解酶家族16 中的一員，分子質(zhì)量為24.64 kDa，等電點(diǎn)為5.94，無信號(hào)肽，鏈型為單鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線型，且AJ-GBP具有2 個(gè)蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)（S36EK，S83AR），3個(gè)酪蛋白激酶II 磷酸化位點(diǎn)（S36EKE，S55PAD，T186FGD），1 個(gè)β-1，3-葡聚糖酶位（W127-E132-I133-D134），1 個(gè)β-1，3-多糖連接識(shí)別基序（FH?NYTLVWTADSLDFYLDG），1個(gè)多糖結(jié)合基序（VFAQLPKGDWLWPAIWLLP）和1 個(gè)葡聚糖酶基序（WPASGEIDLVES）。此外，在AJ-GBP 重組蛋白的第17 位和第193 位發(fā)現(xiàn)有糖基化位點(diǎn)存在（圖1）。

圖1 AJ-GBP 氨基酸序列中位點(diǎn)和基序預(yù)測(cè)

2.2 AJ-GBP 重組蛋白活性鑒定

2.2.1 細(xì)菌凝集活性分析 細(xì)菌凝集試驗(yàn)對(duì)AJGBP 重組蛋白凝集枯草芽孢桿菌等6 種細(xì)菌的能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，AJ-GBP重組蛋白對(duì)革蘭氏陽性菌以及革蘭氏陰性菌具有明顯的凝集效果。

圖2 AJ-GBP 的凝菌結(jié)果

2.2.2 抑菌活性分析 抑菌試驗(yàn)對(duì)AJ-GBP 重組蛋白抑制6 種細(xì)菌的能力進(jìn)行測(cè)定，如圖3 所示。由圖3 可知，AJ-GBP 重組蛋白能夠抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的生長(zhǎng)，但對(duì)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的抑制作用并不明顯。

圖3 AJ-GBP 的抑菌結(jié)果

2.2.3 細(xì)菌結(jié)合活性分析 細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定AJGBP 重組蛋白對(duì)6 種細(xì)菌結(jié)合能力。圖4A 中2~7 泳道均有明顯的重組蛋白條帶，說明AJ-GBP 對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、鰻弧菌、金黃色葡萄球菌、藤黃短小桿菌、綠膿桿菌均有結(jié)合活性。圖4B 中除泳道2 外，其余泳道中均無重組蛋白殘留，說明未與菌體結(jié)合的重組蛋白已被洗凈。結(jié)果表明，AJ-GBP 重組蛋白對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌有明顯的結(jié)合活性。

圖4 AJ-GBP 的菌結(jié)合活性

2.2.4 糖結(jié)合活性分析 對(duì)葡聚糖、肽聚糖、脂多糖進(jìn)行糖結(jié)合試驗(yàn)，結(jié)果表明，AJ-GBP 重組蛋白對(duì)葡聚糖有明顯的結(jié)合活性（圖5），且結(jié)合強(qiáng)度與蛋白濃度成正比。但AJ-GBP 重組蛋白對(duì)脂多糖、肽聚糖沒有明顯的結(jié)合活性。

圖5 AJ-GBP 與葡聚糖結(jié)合活性

3 討論

試驗(yàn)成功地將仿刺參GBP基因的cDNA 進(jìn)行克隆，并命名為AJ-GBP，其全長(zhǎng)660 bp。AJ-GBP 重組蛋白具有219 個(gè)氨基酸，但不具有信號(hào)肽。研究表明，中國(guó)對(duì)蝦的GBP（FcβGBP-HDL）也被證實(shí)沒有信號(hào)肽［9］。此外，序列比對(duì)結(jié)果顯示，AJ-GBP 屬于糖基水解酶家族16，且沒有蝦β-GRP 特有的細(xì)胞黏著位點(diǎn)RGD，而在氨基酸序列的107 位置發(fā)現(xiàn)KGD。RGD 主要存在于甲殼類動(dòng)物GBP 中，可激活酚氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)以清除入侵的病原體［12，24］，而KGD 則在維持蛋白穩(wěn)定性方面發(fā)揮了巨大作用［25，26］。

GBP 可以通過結(jié)合、凝集和激活酚氧化酶活性等方式來激活對(duì)入侵病原微生物的免疫防御機(jī)制［10］。研究結(jié)果表明，AJ-GBP 重組蛋白對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有明顯的凝集作用。說明AJ-GBP 可能參與了仿刺參的免疫防御機(jī)制。且AJ-GBP 重組蛋白雖然能抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌生長(zhǎng)，但對(duì)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的抑制作用并不明顯。然而研究人員從南美對(duì)蝦中獲取的GBP 不具有抑菌能力［10］，表明GBP 具有一定的物種特異性。AJ-GBP 重組蛋白對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌有明顯的結(jié)合活性。由于在無脊椎動(dòng)物中，識(shí)別入侵病原體或病原微生物是免疫防御機(jī)制的第一步［11］，因此AJ-GBP 可能參與了仿刺參的固有免疫反應(yīng)，并在其中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。這點(diǎn)在羅氏沼蝦、中國(guó)對(duì)蝦、南美對(duì)蝦中已被證實(shí)［9，10，13］。此外，大多數(shù)GBP 對(duì)葡聚糖具有明顯的結(jié)合活性。AJ-GBP 重組蛋白也證明了這一點(diǎn)，其對(duì)葡聚糖具有明顯的結(jié)合活性，而對(duì)脂多糖、肽聚糖沒有明顯的結(jié)合活性。但有報(bào)道稱，從淡水螯蝦和澳大利亞紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）中分離出的GBP 對(duì)脂多糖和葡聚糖具有結(jié)合活性［27，28］。GBP 糖結(jié)合能力的不同表明來自不同生物的蛋白之間存在差異性，再一次說明GBP 具有物種特異性。綜上所述，AJ-GBP 重組蛋白具有明顯的抗菌活性，因此其在制備生物抗菌藥物、解決當(dāng)前養(yǎng)殖中抗生素抗藥性具有十分重要的意義。