甘藍(lán)型油菜花粉粒ARTP 誘變及后代表型鑒定

何曉瑩，陸文虎，師偉策，王文敏，王敬喬，陳 葦，張國建，張建昆，束正齊，俎 峰

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，昆明 650205；2.昆明深洪生物科技開發(fā)有限公司，昆明 650051；3.云南省農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，昆明 650031）

甘藍(lán)型油菜大約起源于7 500 年前地中海地區(qū)甘藍(lán)和白菜的天然雜交與自然加倍［1］，其中油用甘藍(lán)型油菜的馴化與栽培僅有700 余年的歷史，是一個年輕的油料作物物種［2］。其有限的栽培馴化史與傳統(tǒng)的品種選育方法，尤其是20 世紀(jì)70 年代以來的雙低化育種導(dǎo)致其遺傳基礎(chǔ)相對狹窄，致使近年來甘藍(lán)型油菜突破性新品種選育困難，迫切需要創(chuàng)造新的優(yōu)良種質(zhì)材料，以拓展甘藍(lán)型油菜的遺傳基礎(chǔ)與優(yōu)異基因庫［3］。

輻射與化學(xué)誘變是傳統(tǒng)的種質(zhì)創(chuàng)新手段。其中輻射誘變多以X 射線、γ 射線、60Coγ 射線與宇宙射線作為輻射誘變源［4］，化學(xué)誘變多以EMS（甲基磺酸乙酯）為誘變劑［5］。前人利用這些傳統(tǒng)技術(shù)在甘藍(lán)型油菜中誘變獲得了高油酸［6，7］、高含油量［8］、長角果［9，10］、大粒［11］與矮桿［12］等優(yōu)良突變體。但上述技術(shù)多具有人體與環(huán)境危害性，限制了其在生產(chǎn)上的大規(guī)模應(yīng)用?；诖髿鈮荷漕l輝光放電原理的常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術(shù)是近年來興起的一種誘變新方法，具有成本低、安全簡便、對環(huán)境無害、突變率高、突變體遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)［13，14］，前期已廣泛應(yīng)用于各類微生物誘變優(yōu)良菌株選育中［14-17］。近年來該技術(shù)逐漸應(yīng)用到植物種質(zhì)創(chuàng)新領(lǐng)域，研究報道顯示ARTP 誘變技術(shù)能夠提高金雞菊種子發(fā)芽勢與發(fā)芽率，增加幼苗葉片數(shù)量與葉面積，提升植株花朵的次生代謝產(chǎn)物［18］，促進(jìn)玉米種子萌發(fā)與幼苗生長［19］，有助于提升甘蔗愈傷組織草甘膦抗性能力［20］，但未有ARTP 在油菜種質(zhì)創(chuàng)新領(lǐng)域的應(yīng)用研究報道。

本研究以甘藍(lán)型油菜花粉為誘變材料，采用ARTP誘變技術(shù)分別輻照0、20、30 和40 min，再將誘變后的花粉授于同一群體中自然產(chǎn)生的不育單株，探究不同輻照時間對誘變花粉授粉當(dāng)代單角粒數(shù)及后代子粒發(fā)芽勢、發(fā)芽率、不育株率及含油量的影響。探索性地開展甘藍(lán)型油菜ARTP 花粉粒誘變試驗，以期獲得高含油量變異株系，并為今后生產(chǎn)上應(yīng)用ARTP花粉粒誘變技術(shù)探索較為適宜的參數(shù)體系及為開展油菜種質(zhì)創(chuàng)新提供新的方法與思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘藍(lán)型油菜Ogu-CMS 恢復(fù)系16C 由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所油菜研究中心提供（16C外源恢復(fù)基因不完全符合孟德爾遺傳，純合可育單株自交后代群體中會自然產(chǎn)生約4% 的不育單株-16CS）。2018 年10 月種植16C 于尋甸基地網(wǎng)室；2019 年5 月收獲誘變花粉授粉后代-M0代種子；2019 年10 月種植M0代種子于小哨基地網(wǎng)室；2020年2 月田間調(diào)查4 個ARTP 輻照時間梯度后代群體不育株率并于2020 年5 月收獲M1代種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 ARTP 誘變 利用ARTP 誘變育種儀（ARTPP，無錫源清天木生物有限公司）使用99.99% 高純度氦氣作為工作氣體對油菜花粉粒進(jìn)行輻照處理。輻照參數(shù)設(shè)置如下：額定功率，160 W；工作氣量，15 SLM；等離子發(fā)射源照射樣品距離，2 mm；輻照時間分別為0、20、30 和40 min，以CK、ARTP20、ARTP30和ARTP40 表示。

1.2.2 花粉取樣與誘變后授粉 2019 年1 月17 日，16C 盛花期選取當(dāng)日開花的花朵，使用小毛刷仔細(xì)刷取花粉到誘變載盤，花粉厚度<1 mm?；ǚ哿RTP 誘變后，誘變載盤置于冷藏柜（4 ℃）保存過夜。第2 天中午授粉于尋甸基地網(wǎng)室16C 群體中的不育單株-16CS（不育單株提前3 d 套袋，避免花粉污染）。每個輻照時間梯度花粉授粉5~10 株，2019年5 月收獲M0代種子。

1.2.3 M0代種子與植株測定指標(biāo)及其方法 誘變花粉粒授粉當(dāng)代植株單角粒數(shù)：每個輻照時間梯度選取5 個單株，每個單株選取主花序20 個角果進(jìn)行單角果粒數(shù)統(tǒng)計。

M0代種子發(fā)芽勢與發(fā)芽率：把M0代種子播種在0.2% 瓊脂糖培養(yǎng)基上，室溫放置，分別統(tǒng)計第3 天和第6 天的萌發(fā)種子數(shù)，計算發(fā)芽勢與發(fā)芽率。重復(fù)3次，每個誘變時間梯度每重復(fù)播種100 粒種子。

發(fā)芽勢=（第3 天萌發(fā)種子數(shù)/每組試驗種子數(shù)）×100%

發(fā)芽率=（第6 天萌發(fā)種子數(shù)/每組試驗種子數(shù)）×100%

M0代植株不育株率調(diào)查：M0代植株盛花期，鑒定單株育性。

不育株率=（不育單株數(shù)/總單株數(shù)）×100%

1.2.4 M1代種子含油量測定 使用近紅外（NIRS）品質(zhì)分析儀（FOSS5000，丹麥福斯公司）對M0代植株開放結(jié)實獲得的M1代種子進(jìn)行含油量分析，具體操作參考前人報道［21］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Excel 2016 進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP 輻照油菜花粉對當(dāng)代授粉植株單角粒數(shù)的影響

用ARTP 輻照0、20、30 和40 min 的花粉給16CS植株授粉，單角粒數(shù)分別為29.74±0.90、29.13±1.54、23.95±2.02 與19.55±1.13?？梢婋S著ARTP 輻照時間增加，角粒數(shù)逐漸下降。其中ARTP20 處理的角粒數(shù)與對照（CK）相比基本沒有變化；ARTP40 授粉單角粒數(shù)最低，較CK 降低34.26%。方差分析結(jié)果見表1。由表1 可知，不同ARTP 輻照處理之間單角粒數(shù)差異極顯著（F值=53.88**），推測ARTP 輻照能夠顯著降低花粉粒活性和授粉結(jié)實能力，并進(jìn)而影響角粒數(shù)。

表1 不同ARTP 輻照時間方差分析

2.2 ARTP 輻照油菜花粉對M0 代子粒發(fā)芽率與發(fā)芽勢的影響

M0代子粒3 重復(fù)發(fā)芽試驗結(jié)果見圖1。由圖1可知，CK、ARTP20、ARTP30 和ARTP40 誘變花粉授粉所得M0代子粒發(fā)芽勢分別為96.00%±1.00%、37.00%±2.65%、0.00%±0.00% 與13.67%±2.52%；發(fā)芽率分別為100%±0.00%、73.67%±3.79%、12.33%±3.06% 與27.67%±2.52%，表明ARTP 輻照顯著影響M0代子粒的發(fā)芽勢與發(fā)芽率。ARTP30 的M0代子粒發(fā)芽勢與發(fā)芽率最低，其中發(fā)芽勢低至0，而發(fā)芽率均值也僅有12.33%。但是，ARTP40 的M0代子粒發(fā)芽勢與發(fā)芽率較ARTP30 均有所上升，結(jié)合“2.1”結(jié)果，推測這可能是由于ARTP40 輻照誘變載盤上的花粉層厚度不均勻所致，雖然ARTP 輻照40 min 極大降低了花粉活力與授粉能力，但部分較厚花粉層底部的花粉粒未得到ARTP 充分輻照，進(jìn)而導(dǎo)致其后代M0代子粒發(fā)芽勢與發(fā)芽率較ARTP30 有所提升。

圖1 M0代子粒發(fā)芽勢與發(fā)芽率

2.3 ARTP 輻照油菜花粉對M0代植株不育株率的影響

分別對CK、ARTP20、ARTP30 與ARTP40 的M0代植株取樣192、768、812 和837 株進(jìn)行育性情況調(diào)查，其中不育株數(shù)分別為41、191、319 和265 株。ARTP20 的M0代不育株率為24.87%，比CK 不育株率（21.35%）略高；ARTP30 的M0代不育株率最高，達(dá)39.29%；ARTP40 的M0代不育株率次之，達(dá)31.66%（圖2）。由此可見，ARTP 輻照花粉時長≥30 min 顯著影響16C 花粉粒外源恢復(fù)基因的遺傳穩(wěn)定性。但同時不同輻照時間梯度對不育株率的影響表現(xiàn)出與“2.2”類似的結(jié)果，即ARTP40 M0代植株不育株率低于ARTP30 M0代植株不育株率，推測亦是由于ARTP40誘變載盤上的花粉層厚度不均勻所致。

圖2 M0代植株不育株率統(tǒng)計

2.4 ARTP 輻照油菜花粉對M1代子粒含油量的影響

隨機(jī)收獲314 株ARTP30 和15 份CK 的M0代植株，利用近紅外品質(zhì)儀對其M1代子粒進(jìn)行含油量分析。結(jié)果顯示10 株CK M1代子粒含油量均值為41.39%±0.75%，與歷年來16C含油量均值41.17%±1.89%基本一致。而314株ARTP30 M1代子粒中含油量有287株超過42.50%、221株超過45.07%和43株超過50.20%，分別占比91.40%、70.38% 與13.69%；其中ARTP30-315 單株子粒含油量最高，達(dá)52.61%，較CK 含油量均值增幅27.11%。由此可見，ARTP30 的M1代油菜子粒含油量較CK 與16C 得到了顯著提升。

3 討論

本研究采用ARTP 誘變技術(shù)以4 個時間梯度（0、20、30、40 min）輻照油菜花粉，發(fā)現(xiàn)ARTP 輻照30 min 以上的誘變花粉，授粉當(dāng)代單角粒數(shù)及后代M0代子粒發(fā)芽勢和發(fā)芽率均顯著下降，M0代植株不育株率顯著上升；同時發(fā)現(xiàn)ARTP30 M1代子粒含油量較CK 有顯著提升（43 份子粒含油量超過50.2%，占比13.69%），其中ARTP30-315 單株子粒含油量最高，達(dá)52.61%，較CK 含油量均值增幅27.11%。研究初步明確，利用ARTP-P 誘變儀開展甘藍(lán)型油菜花粉誘變較為適宜的ARTP 輻照時間區(qū)間，并獲得了大量含油量顯著提升的株系，為今后生產(chǎn)上應(yīng)用ARTP 花粉粒誘變技術(shù)及開展油菜種質(zhì)創(chuàng)新提供了有益的嘗試與技術(shù)參數(shù)借鑒。

較種子、幼胚及愈傷組織而言，花粉粒更適宜作為種質(zhì)創(chuàng)新的誘變材料［5］。植物花粉量巨大，且花粉誘變產(chǎn)生突變后，通過雙受精作用能夠快速將遺傳變異傳遞給后代，但前人研究報道卻較少使用花粉作為誘變對象［4］。這主要是因為對于完全花作物而言，花粉誘變后授粉給原株系材料需要進(jìn)行大量的人工剝蕾去雄；而授粉給不育系株系，則后代子?；蛐碗s合，導(dǎo)致后續(xù)突變體與突變表型鑒定困難［22-25］。本研究采用Ogu-CMS 恢復(fù)系16C 作為花粉供體，其群體中自然產(chǎn)生的不育單株16CS 為誘變花粉授粉對象，既不需要大量手工剝蕾去雄，同時授粉后代的遺傳背景亦沒有發(fā)生改變，方便后續(xù)突變體與突變表型的比較與鑒定，較好地解決了上述問題。

甘藍(lán)型油菜Ogu-CMS 恢復(fù)系16C 為云南省主推雜交品種云油雜15 號父本，其在生產(chǎn)應(yīng)用過程中存在兩個問題需要改良與解決。一是16C 含油量偏低，多年多點(diǎn)含油量測試均值在42% 左右，制約了云油雜15 號的產(chǎn)油量；二是恢復(fù)系16C 純合自交后代出現(xiàn)約4% 的不育單株，影響雜交制種產(chǎn)量與純度。本研究利用16C 花粉作為誘變材料，在輻照30 min 的后代中發(fā)現(xiàn)了43 份子粒含油量超過50.2%的單株材料，后續(xù)這些株系材料通過純化與篩選有望解決16C 含油量偏低的問題。同時本研究發(fā)現(xiàn)16C 為處理對照M0代不育株率為21.35%，這與16C純合自交后代4% 的不育株率一致。 ARTP 輻照30 min 以上，M0代植株不育株率顯著上升，最高達(dá)39.29%，表明16C 花粉外源恢復(fù)基因攜帶的染色體片段受到了ARTP 輻照的誘變，預(yù)示著有望在其后代中選育出育性遺傳更為穩(wěn)定的恢復(fù)株系。未來研究中，需要進(jìn)一步加強(qiáng)高含油量、育性更加穩(wěn)定遺傳的突變材料的篩選，這樣的突變株系有望替代原有的16C 株系進(jìn)行雜交種配制與生產(chǎn)。