一株產(chǎn)果香型真菌的篩選、鑒定及在煙草增香中的應(yīng)用

張鵬，李煒，師超，高加明，任杰，申國(guó)明，張忠鋒

摘? 要：煙葉香氣不足一直制約著煙葉品質(zhì)及其工業(yè)可用性。為開(kāi)發(fā)新的煙草香料，本研究從湖北省利川市煙草種植區(qū)的煙葉中篩選到產(chǎn)果香型菌株R59，經(jīng)鑒定為產(chǎn)黑色素短梗霉Aureobasidium melanogenum。發(fā)酵后，該菌株能夠產(chǎn)生11種香氣化學(xué)物質(zhì)，其中果香型的苯乙醇、苯乙醛和醋酸異戊酯的濃度均超過(guò)100 μg/mL。對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)以30 g/L的葡萄糖作為碳源，15 g/L玉米漿作為氮源，培養(yǎng)基pH為5.0條件下培養(yǎng)R59菌株，可有效提高菌株中苯乙醛和醋酸異戊酯的產(chǎn)量。噴灑10 μL/g R59菌株發(fā)酵液可有效改善煙絲的協(xié)調(diào)性、香氣和余味。R59菌株產(chǎn)香發(fā)酵成本低，添加工藝簡(jiǎn)單，可以作為一種提高煙草品質(zhì)的香料來(lái)源。

關(guān)鍵詞：果香型真菌;煙草;增香;感官評(píng)價(jià)

Screening and Identification of a Fungus with a Sweet Fruit Aroma and Its Application in Flavoured Tobacco

ZHANG Peng1， LI Wei2， SHI Chao3， GAO Jiaming4， REN Jie1， SHEN Guoming1， ZHANG Zhongfeng1*

（1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China; 2. Shanghai Tobacco Group Beijing Cigarette Factory Co.， Ltd. Beijing 101121， China; 3. Lichuan Branch of Enshi Tobacco Company， Lichuan， Hubei 445400， China; 4. Hubei Provincial Tobacco Company of China National Tobacco Corporation， Wuhan 430000， China）

Abstract： Insufficient aroma of tobacco leaves has always been a major factor limiting the quality of tobacco leaves and their industrial availability. In order to develop a new source of spices， the R59 strain with a sweet fruit aroma was isolated from healthy leaves of tobacco collected from Lichuan， Hubei province. This strain was identified as Aureobasidium melanogenum. In this study， eleven aroma components were detected in the fermentation broth. Among them， phenylethyl alcohol， phenylacetaldehyde， and isoamyl acetate， which possessed fruity arama， were produced more than 100 μg/mL. After fermentation medium optimization， the production of phenylacetaldehyde and isoamyl acetate by the R59 strain was increased significantly when cultured in 30 g/L glucose， 15 g/L corn steep liquor at pH 5.0. Spraying of the fermentation broth onto cut tobacco at a dosage of 10 μL/g could effectively improve its coordination， aroma and aftertaste. Due to its low fermentation cost and simple addition process， the R59 strain can be used as an aroma source to significantly improve the quality of cigarette products.

Keywords： fruity fungi; tobacco; fragrances enhancement; sensory evaluation

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。卷煙的香氣品質(zhì)直接影響消費(fèi)者的吸食口感，是評(píng)價(jià)卷煙產(chǎn)品的重要指標(biāo)。提高卷煙的香氣品質(zhì)有多種方法，如選育高香品質(zhì)的煙草品種[1]、改善煙草的栽培模式[2]及在卷煙加工過(guò)程中添加香料[3]等。其中外源添加香料在卷煙加工中最為常用，可以直接、有效地提升卷煙的香氣品質(zhì)，掩蓋煙葉的刺激性和雜氣。但是，外源添加香料目前主要以化學(xué)合成為主，合成過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物和潛在有害物質(zhì)會(huì)造成環(huán)境污染。因此，研發(fā)綠色、環(huán)保的新型香料，替代化學(xué)合成的卷煙香料，對(duì)于煙草香料行業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要。

自然界中有多種微生物能夠產(chǎn)生香氣物質(zhì)，為新型天然源香料的開(kāi)發(fā)提供了途徑[4]。微生物產(chǎn)香種類(lèi)豐富，細(xì)菌類(lèi)的枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生乙醇、乙酸乙酯等，呈現(xiàn)醇香、果香和甜香等特征性香氣;地衣芽孢桿菌能產(chǎn)生草酸、甲酸乙酯、丙酮醛等，呈現(xiàn)辛香、蜂蜜香、醋酸香和醬香等特征性香氣[5];真菌類(lèi)如東方伊薩酵母能夠合成特殊的酯類(lèi)物質(zhì)，產(chǎn)生蟠桃香;畢赤酵母高產(chǎn)乙酸乙酯，可增加果香[6];釀酒酵母和畢赤酵母混合發(fā)酵產(chǎn)生花香果香，尤其是熱帶水果型香氣;馬克斯克魯維酵母能產(chǎn)生高達(dá)400 mg/L的苯乙醇[7]，該物質(zhì)具有典型的玫瑰香氣，常作為煙草香料的重要組分[8-9]。

微生物發(fā)酵產(chǎn)香具有生產(chǎn)周期短、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，已在白酒[10]、食醋[11]、醬油、腐乳、豆豉等加工行業(yè)中得到應(yīng)用。國(guó)內(nèi)對(duì)煙葉產(chǎn)香微生物的研究起步較晚，目前尚未建立起適合發(fā)酵生產(chǎn)卷煙香料的微生物群落結(jié)構(gòu)體系。本研究從煙草植株上篩選產(chǎn)香的微生物，并對(duì)關(guān)鍵致香成分和發(fā)酵條件進(jìn)行鑒定和優(yōu)化，評(píng)價(jià)其發(fā)酵產(chǎn)物在煙草增香中的應(yīng)用效果，旨在發(fā)掘適用于卷煙增香的微生物，豐富煙草行業(yè)新型香料的來(lái)源，開(kāi)發(fā)具有良好風(fēng)味的新型煙草制品。

1? 材料與方法

1.1? 供試材料

供試煙葉于2018年7月采自湖北省恩施土家族苗族自治州利川市煙草種植區(qū)，分別于不同海拔（800、1000和1200 m）產(chǎn)區(qū)采集煙草上部、中部和下部烤后葉。

1.2? 試劑和培養(yǎng)基

1.2.1? 試劑? 試驗(yàn)PCR用高保真Phanta酶和DNA提取試劑盒購(gòu)自于南京諾唯贊生物科技有限公司，擴(kuò)增DNA片段所用引物和ITS rDNA序列由青島擎科生物科技有限公司合成，DNA Marker購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)有限公司，培養(yǎng)基配置所需葡萄糖、氯化鈉、硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉和瓊脂等均購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，豆餅粉、玉米漿及玉米蛋白粉購(gòu)自于青島科瑞培養(yǎng)基有限公司;色譜純化學(xué)試劑甲醇、二氯甲烷、苯乙醛、乙酸苯乙酯、醋酸異戊酯均購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2.2? 培養(yǎng)基? 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：0.5%（m/v，下同）牛肉膏，1%蛋白胨，1%氯化鈉。LB液體培養(yǎng)基：1% NaCl，1%蛋白胨，0.5%酵母粉;固體培養(yǎng)基配置時(shí)加入1.5%瓊脂。YPD液體培養(yǎng)基：2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母粉;固體培養(yǎng)基配置時(shí)加入1.5%瓊脂。

所有培養(yǎng)基均于115 ℃滅菌30 min后使用，其中LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)菌，YPD培養(yǎng)基用于培養(yǎng)酵母菌和絲狀真菌。

1.3? 煙草微生物的分離

稱(chēng)取10 g煙葉樣品，剪碎加入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，放于28 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)速為150 r/min。用血球計(jì)數(shù)板對(duì)培養(yǎng)基中的微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)，后用無(wú)菌水稀釋至每微升培養(yǎng)基中微生物個(gè)數(shù)為1～10。將稀釋后的培養(yǎng)液在LB平板上涂布以分離細(xì)菌，在YPD平板上進(jìn)行涂布以分離真菌（包括酵母菌），分別于28 ℃和37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。挑取菌落形態(tài)不同的微生物在固體培養(yǎng)基上劃線純化后，置于30%的甘油中于–80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.4? 產(chǎn)果香微生物的篩選

將篩選到的微生物菌株于搖床中振蕩培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)價(jià)[12]。產(chǎn)香品質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括4個(gè)方面：香氣度、差異度、留香時(shí)間、刺激性。差異度由小到大滿(mǎn)分10分，香氣由弱到強(qiáng)滿(mǎn)分20分，留香時(shí)間由短暫到持久滿(mǎn)分10分，刺激性由大到小滿(mǎn)分10分。分?jǐn)?shù)越高，香味品質(zhì)越好，篩選最佳的產(chǎn)果香微生物。

1.5? 果香菌株的鑒定

選取產(chǎn)香賦分值最高的菌株，將其在YPD平板上劃線，28 ℃靜置培養(yǎng)48 h后，觀察其菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)[9-11]。設(shè)計(jì)合成真菌通用引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，擴(kuò)增菌株的ITS rDNA序列后送青島擎科生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，在Blast結(jié)果的基礎(chǔ)上，查找與此菌株進(jìn)化關(guān)系相近的標(biāo)準(zhǔn)菌株的ITS rDNA。基于鄰位相接法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行種屬鑒定。

1.6? 發(fā)酵液中香氣成分的分析

將產(chǎn)香賦分值最高的菌株接于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液離心，取上清液，等體積加入二氯甲烷并混勻。將發(fā)酵液萃取有機(jī)相減壓蒸餾至徹底干燥，然后加入適量二氯甲烷，用于氣質(zhì)聯(lián)用（GC/MS）分析，氣相色譜條件參照文獻(xiàn)[9-10]。質(zhì)譜條件中接口溫度280 ℃;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;離子化方式EI;電子能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍（m/z）35～400。得到的質(zhì)譜結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有物質(zhì)比較，確定化合物種類(lèi)，再根據(jù)峰面積計(jì)算各成分的含量和濃度。

1.7? 苯乙醛和醋酸異戊酯含量的測(cè)定

苯乙醛和醋酸異戊酯含量用HPLC方法測(cè)定[13]，色譜柱為Waters 2695和Platisil C18柱（4.6 mm×250 mm）;紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;流動(dòng)相為甲醇-水，梯度洗脫，流速為1 mL/min。根據(jù)峰面積，按照標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行苯乙醛和醋酸異戊酯含量測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：將色譜純苯乙醛和醋酸異戊酯分別配制成濃度為10～150 mg/L的工作溶液，使用0.45 μm有機(jī)過(guò)濾膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.8? 發(fā)酵產(chǎn)香條件的優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化主要考慮葡萄糖濃度、氮源種類(lèi)、玉米漿濃度和pH等4個(gè)因素對(duì)菌株產(chǎn)香的影響，葡萄糖濃度設(shè)置為：15、20、25、30、35、40 g/L;氮源選擇為蛋白胨和酵母粉、玉米漿、玉米蛋白、（NH4）2SO4、豆餅粉5組;玉米漿濃度設(shè)置為10、15、20、25、30、35 g/L;pH設(shè)置為4.5、5、5.5、6、6.5、7。先將選取的菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，放于30 ℃搖床150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，得到種子培養(yǎng)液。取5 mL種子培養(yǎng)液接入不同發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)36 h后，測(cè)定發(fā)酵液中苯乙醛和醋酸異戊酯含量。

1.9? 發(fā)酵液增香效果的感官評(píng)價(jià)

在1.8所述條件下培養(yǎng)產(chǎn)香賦分值最高的菌株，將發(fā)酵液用0.45 μm濾膜過(guò)濾除菌后均勻噴灑于煙絲表面，噴灑量為5～20 μL/g，后將煙絲放置于25 ℃、65%的濕度環(huán)境下平衡6 h，制成煙支。以不噴灑菌株發(fā)酵液的煙絲為對(duì)照。感官質(zhì)量由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所和頤中（青島）實(shí)業(yè)有限公司技術(shù)中心評(píng)吸專(zhuān)家進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[14-15]。

2? 結(jié)? 果

2.1? 產(chǎn)果香微生物的篩選

從不同海拔、不同部位煙葉中共分離得到細(xì)菌69株和真菌57株，作為增香微生物篩選的菌種庫(kù)。純化過(guò)的菌株在平板劃線過(guò)程中，通過(guò)初步的嗅覺(jué)篩選，發(fā)現(xiàn)有5株微生物能產(chǎn)生較為明顯的果香。5個(gè)菌株繼續(xù)在28 ℃和160 r/min下振蕩培養(yǎng)36 h，采用嗅香的方式進(jìn)行感官評(píng)價(jià)并賦分比較。如表1所示，A1、R59、A13和B2 四株菌產(chǎn)香均較強(qiáng)，差異度也比較明顯，其中R59的產(chǎn)香能力最強(qiáng);綜合停留時(shí)間和刺激性，R59菌株得分最高。R59菌株能夠產(chǎn)生清甜水果香氣，夾雜著一種特殊的玫瑰香味，且香氣持久，雜氣較輕，故將其用于后續(xù)的產(chǎn)香和應(yīng)用研究。

2.2? 菌株鑒定

不同種類(lèi)的微生物具有不同的菌落和細(xì)胞形態(tài)，是區(qū)分不同微生物的重要標(biāo)準(zhǔn)。在YPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3 d后，R59菌株的菌落較濕潤(rùn)且不光滑，呈淡黃色到淡粉色，菌落外周有放射狀突起（圖1A）。在油鏡下觀察，該菌株的細(xì)胞體積較釀酒酵母細(xì)胞大，多數(shù)為橢圓形，部分細(xì)胞能觀察到正在進(jìn)行出芽生殖，也有一部分細(xì)胞連在一起形成假菌絲（圖1B）。綜上所述，R59菌株的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)與短梗霉類(lèi)似。

rDNA序列在真菌基因組合中成簇存在，具有較高保守性，常用于菌株的分子鑒定。在rDNA各個(gè)區(qū)域中，ITS rDNA與26S rDNA和18S rDNA區(qū)域相比具有更高的變異度，同時(shí)其保守性也足以用于進(jìn)行酵母的種屬區(qū)分。如圖2所示，R59菌株與短梗霉屬的CBS109800菌株位于進(jìn)化樹(shù)的同一支，說(shuō)明其進(jìn)化關(guān)系最為接近，兩者的ITS rDNA相似度超過(guò)99%。綜合形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，R59菌株的種屬位置鑒定為Aureobasidium melanogenum。

2.3? 香氣物質(zhì)成分分析

利用液質(zhì)聯(lián)用對(duì)R59菌株發(fā)酵液中的香氣成分進(jìn)行了分析[16-17]，檢出了11種香氣成分，包括多種酯類(lèi)物質(zhì)（表2）。其中苯乙醇、苯乙醛和醋酸異戊酯3種香氣成分占比最高，濃度分別為172.9、261.2和127.3 μg/mL，說(shuō)明它們對(duì)R59菌株發(fā)酵液中的香氣貢獻(xiàn)較大。此外，也檢測(cè)出3-甲基丁醛、乙酸乙酯、苯甲酸苯乙酯、α-紫羅酮、金合歡基丙酮、檸檬醛和乙苯等7種香氣成分，濃度在6.8～ 36.1 μg/mL之間，它們可能賦予了R59菌株明顯而

不同的香氣特征，決定了發(fā)酵液香氣的豐富性[18-19]。此外，檢測(cè)到1種不利成分2-甲基丙醇，該物質(zhì)有刺激性氣味，對(duì)香氣有不利影響。

2.4? 發(fā)酵產(chǎn)香條件的優(yōu)化

液質(zhì)聯(lián)用分析發(fā)現(xiàn)，R59菌株能產(chǎn)生較高濃度的苯乙醛和醋酸異戊酯，這兩種物質(zhì)具有典型的果香香氣，并且在其他產(chǎn)香酵母中含量較少，是決定R59菌株產(chǎn)香特征的關(guān)鍵成分。以提高苯乙醛和醋酸異戊酯的產(chǎn)量為目標(biāo)，研究培養(yǎng)基中不同的葡萄糖濃度、氮源種類(lèi)、玉米漿濃度和pH對(duì)產(chǎn)香的影響，用HPLC測(cè)定兩種物質(zhì)的產(chǎn)量，找到最合適的發(fā)酵條件。如圖3（A）所示，隨著葡萄糖濃度增加至30 g/L，苯乙醛的產(chǎn)量也升高，葡萄糖濃度繼續(xù)提升，苯乙醛產(chǎn)量基本保持不變;而醋酸異戊酯在葡萄糖濃度增大到20 g/L之后，產(chǎn)量基本保持不變。這說(shuō)明苯乙醛和醋酸異戊酯的合成途徑可能有差別。有機(jī)氮源玉米漿對(duì)兩種物質(zhì)的生產(chǎn)有明顯的促進(jìn)作用，苯乙醛和醋酸異戊酯的產(chǎn)量分別達(dá)到336.4和129.3 μg/mL（圖3B）。如圖3（C）所示，最佳的玉米漿濃度為15 g/L;如圖3（D）所示，在pH 5.0的培養(yǎng)基中，苯乙醛和醋酸異戊酯的產(chǎn)量最高，pH過(guò)高和過(guò)低均影響香氣物質(zhì)的合成，這種趨勢(shì)和酵母菌生長(zhǎng)的pH特性相一致。因此，苯乙

醛和醋酸異戊酯最適宜的發(fā)酵條件為葡萄糖30 g/L、玉米漿15 g/L、培養(yǎng)基pH 5.0。在此條件下，苯乙醛和醋酸異戊酯的產(chǎn)量分別達(dá)到348.6和143.7 μg/mL。

2.5? 菌株發(fā)酵液在烤煙增香中的應(yīng)用評(píng)價(jià)

采用R59菌株的發(fā)酵液處理煙絲并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，如表3所示，添加發(fā)酵液的卷煙樣品，煙絲的協(xié)調(diào)性、香氣和余味指標(biāo)分值均高于對(duì)照，表現(xiàn)為發(fā)酵樣品的果香氣更濃更飽滿(mǎn)，香氣的協(xié)調(diào)性也有增加，余味更干凈，抽吸品質(zhì)顯著提高，而當(dāng)發(fā)酵液添加量超過(guò)10 μL/g時(shí)，煙絲的抽吸品質(zhì)不會(huì)再有進(jìn)一步提高。此外，添加發(fā)酵液會(huì)引起卷煙刺激性和雜氣的加重，這可能和發(fā)酵液中香氣物質(zhì)之外的代謝產(chǎn)物有關(guān)。

3? 討? 論

利用微生物開(kāi)發(fā)綠色、環(huán)保的新型煙草香料，是替代化學(xué)法合成煙草香料的可行途徑。微生物種類(lèi)眾多，產(chǎn)生的香氣也多種多樣，杜飛等[20]從茅臺(tái)酒酒糟和茯磚茶中分離出的釀酒酵母和冠突散囊菌，可以產(chǎn)生茶香、酒香、蜜甜香及特殊的香味，以其發(fā)酵液處理煙葉，可有效提高其感官品質(zhì)。郭林青等[21]從水果表面篩選到漢遜酵母菌株，可利用煙末發(fā)酵產(chǎn)生花香香韻和甜香香韻物質(zhì)。朱克永[22]從獼猴桃表皮分離得到酵母菌株，發(fā)酵后具有優(yōu)雅水果香氣和獼猴桃自然果香。本研究從湖北省恩施土家族苗族自治州利川市煙草種植區(qū)的煙葉中分離了69株細(xì)菌和57株真菌，并從中篩選到5種產(chǎn)香微生物。其中R59菌株的產(chǎn)香能力最強(qiáng)，嗅香評(píng)分最高，因此對(duì)其進(jìn)行了產(chǎn)香和應(yīng)用研究。對(duì)R59菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，并對(duì)該菌株的ITS rDNA序列進(jìn)行分析和Blast比對(duì)，將其鑒定為Aureobasidium melanogenum。

通過(guò)對(duì)R59菌株的香氣成分進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)出11種致香成分。其中苯乙醇、苯乙醛和醋酸異戊酯產(chǎn)量均超過(guò)100 μg/mL，特別是苯乙醛的產(chǎn)量達(dá)到261.2 μg/mL。根據(jù)化學(xué)物質(zhì)的香氣特征，苯乙醛具有水果的甜香氣，醋酸異戊酯具有香蕉、蘋(píng)果樣香氣，而苯乙醇具有典型的玫瑰香氣，并且具有增強(qiáng)香氣的作用，這3種組分可能是R59菌株具有較強(qiáng)果香且較為持久的原因。其他8種濃度較低的成分，則可能在賦予R59菌株香氣的豐富度上發(fā)揮作用。而對(duì)于不利成分2-甲基丙醇，后續(xù)可以通過(guò)原生質(zhì)體融合或者誘變育種技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行改良，以減少該物質(zhì)的含量，提高香氣品質(zhì)。

苯乙醇是產(chǎn)香酵母中較為常見(jiàn)的一種香氣物質(zhì)，并且對(duì)香氣特征起到較大的作用[23-24]。而高產(chǎn)苯乙醛和醋酸異戊酯的酵母菌則較少報(bào)道，在多數(shù)產(chǎn)香酵母中這兩種物質(zhì)的含量較低。本研究對(duì)R59菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度、氮源種類(lèi)和溶液pH均對(duì)苯乙醛和醋酸異戊酯的產(chǎn)量有較大的影響，其中最適的葡萄糖濃度為30 g/L、最優(yōu)氮源玉米漿濃度為15 g/L，最適pH為5.0。在該培養(yǎng)條件下發(fā)酵，R59菌株的苯乙醛和醋酸異戊酯的產(chǎn)量分別提高30%以上和10%以上。將R59菌株的發(fā)酵液噴灑至煙絲表面后進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)噴灑10 μL/g的發(fā)酵液可有效改善煙絲的協(xié)調(diào)性、香氣和余味等。

R59菌株產(chǎn)香發(fā)酵成本低，生產(chǎn)迅速，不需要復(fù)雜的提取步驟，有較強(qiáng)的實(shí)際意義。而之前的研究中，發(fā)酵所產(chǎn)香氣物質(zhì)均需單獨(dú)的有機(jī)試劑萃取過(guò)程，才能用于煙草增香[25-26]，與之相比，本研究具有明顯的工藝簡(jiǎn)便性。

4? 結(jié)? 論

本研究篩選到具有明顯產(chǎn)香能力的R59菌株，對(duì)其rDNA-ITS序列分析，鑒定其為Aureobasidium melanogenum。R59菌株能夠分泌超過(guò)11種香氣化合物，主要的香氣物質(zhì)為苯乙醇、苯乙醛和醋酸異戊酯，通過(guò)對(duì)其發(fā)酵的培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化后，進(jìn)一步提升了菌株苯乙醛和醋酸異戊酯的產(chǎn)量。對(duì)卷煙樣品評(píng)吸結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加R59菌株發(fā)酵液能夠有效增加卷煙的協(xié)調(diào)性、香氣和余味，且最佳添加量為10 μL/g。R59菌株的產(chǎn)香發(fā)酵成本低，添加工藝簡(jiǎn)單，可以作為一種提高煙草品質(zhì)的香料來(lái)源。

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