煙草甲幼蟲高毒力病原真菌的篩選

齊禹哲，閆芳芳，李成軍，劉蘇，陳鵬，徐傳濤，李茂業(yè)，劉明科，閆雪梨，李斌

摘? 要：為篩選出對煙草甲2齡幼蟲具有較好防治效果的病原真菌，在實驗室條件下，采用浸漬法測定5株蠟蚧輪枝菌和5株球孢白僵菌對煙草甲2齡幼蟲的毒力，篩選出2株對煙草甲2齡幼蟲具有高毒力的白僵菌菌株Bb05和Bbr81，將2株菌株配置成不同濃度的孢子懸浮液，測定其毒力并對Bb05菌株的侵染過程進行觀察。結(jié)果表明，接種孢子濃度1.0×108 mL-1條件下，菌株Bb05處理煙草甲的累積死亡率最高，達77.78%，LT50為8.18 d;菌株Bbr81處理煙草甲的累積死亡率為74.44%，LT50為7.60 d。用不同濃度孢子懸浮液處理煙草甲2齡幼蟲后，其累積死亡率隨孢子濃度和接種時間的增加而增加，Bb05菌株的LC50為8.3×107 mL-1，菌株Bbr81的LC50為1.2×107 mL-1。篩選所得的2個菌株對煙草甲蟲2齡幼蟲的毒力較高，具有一定的開發(fā)應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：昆蟲病原真菌;煙草甲;生物測定;生物防治

Screening for Highly Virulent Entomopathogenic Fungi Against Lasioderma serricorne （Fabricius） Larvae

QI Yuzhe1， YAN Fangfang2， LI Chengjun3， LIU Su1， CHEN Peng4， XU Chuantao5，

LI Maoye1*， LIU Mingke1， YAN Xueli1， LI Bin4*

（1. Key Laboratory of Biology and Sustainable Management of Plant Diseases and Pests of Anhui Higher Education Institutes， School of Plant Protection， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China; 2. Sichuan Panzhihua Branch Tobacco Company， Panzhihua， Sichuan 617026， China; 3. Tobacco Research Institute of Henan Academy of Agricultural Sciences， Xuchang， Henan 464000， China; 4. Sichuan Branch of China National Tobacco Corporation， Chengdu 630041， China; 5. Luzhou Company of Sichuan Tobacco Company， Luzhou， Sichuan 646600， China）

Abstract： In order to screen for entomopathogenic fungi with better control effect on the second instar larvae of Lasioderma serricorne， in this experiment， 5 strains of Verticillium lecanii and 5 strains of Beauveria bassiana were determined by the impregnation method. Two Beauveria bassiana strains Bb05 and Bbr81 with high virulence to the second instar larvae of Lasioderma serricorne were obtained， and the two strains were prepared into different concentrations of spore suspension， and their virulence was determined. The infection process of the Bb05 strain was observed. The results showed that， at the concentration of 1.0×108 mL-1， Bb05 had the highest cumulative death rate to L. serricorne （77.78%） and LT50 （8.18 d）. The cumulative mortality of strain Bbr81 and LT50 was 74.44% and 7.60 d respectively. After treating the Lasioderma serricorne with different concentrations of spore suspensions， the cumulative mortality increased with the increase of spore concentration and inoculation time. The LC50 of strain BB05 was 8.3×107 spores mL-1， and that of strain Bbr81 was 1.2×107 spores mL-1. The two strains were highly virulent to the 2nd instar larvae of tobacco beetle， and have a certain potential for development and application.

Keywords： entomopathogenic fungi; Lasioderma serricorne; bioassay; biological control

煙草甲[Lasioderma serricorne （Fabricius）]又名煙草竊蠹，屬鞘翅目（Coleoptera），竊蠹科（Anobiidae），具有適應(yīng)能力強、食性廣泛、產(chǎn)卵量大等特點，危害和污染各個加工階段的煙草產(chǎn)品。此蟲特別喜歡蛀食醇化1～2年的煙草葉片，其幼蟲常隱匿于煙葉的夾層褶皺中取食煙葉，造成煙葉穿孔破碎，同時其蟲尸及蟲糞污染煙葉，嚴(yán)重影響煙葉品質(zhì)[1-2]。目前對煙草甲的防治主要依靠磷化氫熏蒸，但隨著煙草甲對磷化氫的抗性逐漸增強，其熏蒸效果大幅度降低[3-6]。同時，化學(xué)熏蒸極易造成環(huán)境污染，因此，迫切需要尋找對環(huán)境友好且不易產(chǎn)生抗性的防治藥劑，以替代化學(xué)熏蒸。

昆蟲病原真菌具有不污染環(huán)境、可持續(xù)控制害蟲、易工業(yè)化生產(chǎn)等特點，在農(nóng)林業(yè)害蟲防治中具有巨大的應(yīng)用價值。近年來，國內(nèi)外的許多學(xué)者對其進行了廣泛深入研究[7]。目前，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）、蠟蚧輪枝菌（Verticilliu mfungus）等具有廣譜殺蟲作用的昆蟲病原真菌已經(jīng)在國內(nèi)外商品化，并在重要農(nóng)林害蟲防治中取得了較為明顯的效果。但國內(nèi)外有關(guān)昆蟲病原真菌防治煙草甲的研究報道較少。

因此，本研究選擇保存于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院生物防治實驗室的5株蠟蚧輪枝菌菌株和5株球孢白僵菌菌株，以煙草甲2齡幼蟲作為供試?yán)ハx，通過室內(nèi)測定比較各個菌株之間的毒力差異，同時對比不同濃度各菌株對煙草甲2齡幼蟲的致死率，將累積校正死亡率大于70%的兩株菌株進行時間-劑量-死亡率關(guān)系分析，進一步驗證昆蟲病原真菌菌株對煙草甲2齡幼蟲的致病性，并利用體式顯微鏡觀察了1株高毒力菌株侵染煙草甲2齡幼蟲的過程，以期為煙草甲的生物防治研究提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 供試材料

SDAY培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，酵母浸出粉10 g，瓊脂20 g，蛋白胨10 g。水1000 mL，121 ℃滅菌15 min備用。0.05%吐溫-80溶液，121 ℃滅菌備用。

1.2? 供試儀器

人工氣候箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），體式顯微鏡（Nikon公司SMZ1500型），光學(xué)顯微鏡（leica microscope DM500型），血球計數(shù)板（上海求精生化有限公司）。

1.3? 供試?yán)ハx

供試煙草甲于2018年采自四川省煙草公司瀘州市公司煙葉倉儲中心庫，在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院昆蟲飼養(yǎng)室內(nèi)使用小麥粉與酵母粉（重量比20∶1，均勻混合）進行飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度（26±2）℃，光周期為光照14 h∶黑暗10 h[8-10]。挑選體型相近、生命力強的煙草甲2齡幼蟲進行試驗。

1.4? 供試菌株

5株蠟蚧輪枝菌和5株球孢白僵菌系從田間采集的僵蟲上分離純化獲得，供試菌株皆保存于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院生物防治實驗室。各菌株的編號、寄主及采集地見表1。

1.5? 菌落培養(yǎng)及形態(tài)觀察

將活化的菌株用孢子液點植法接種于9 cm的SDAY培養(yǎng)基平板上，取供試真菌的分生孢子液3 μL點植在培養(yǎng)皿表面中心，使接種面呈均勻的圓形，每株菌株接種3個培養(yǎng)皿。接菌后保藏于（25±1）℃、RH（85±5）%、光周期為光照16 h∶黑暗8 h的光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。記錄菌落形態(tài)、顏色及分生孢子粉色澤。

菌落生長速率采用十字交叉法，于接種3 d后開始測量。菌株生長15 d后用邊長為1 cm的正方形打孔器分別在菌落中心和菌落邊緣取菌塊5個，放入10 mL含有0.05% Tween-80無菌水的試管中，在渦旋混合器上振蕩10 min，用血球計數(shù)板測定孢子含量。

1.6? 煙草甲幼蟲高毒力菌株篩選

將活化后的10個菌株的菌絲及分生孢子分別刮取至含有0.05%吐溫-80的無菌水溶液中，使用渦旋振蕩器振蕩5 min，用濾紙去除多余菌絲，將孢子懸浮液用血球計數(shù)板計數(shù)后，稀釋至1.0×108 mL-1備用[11]。

將生長發(fā)育良好，活力強的煙草甲2齡幼蟲30頭作為1組，共6組。其中3組為試驗組，采用浸漬法進行真菌接種，將幼蟲在各個菌懸液中浸漬10 s，取出后在濾紙上去除多余菌液;其余3組為對照組，采用0.05%吐溫-80溶液進行浸漬處理。處理后的幼蟲均移至盛有飼料的培養(yǎng)皿，在（26±2） ℃，相對濕度（80±5）%條件下飼養(yǎng)，連續(xù)觀察10 d，記錄試蟲死亡數(shù)，每個處理重復(fù)3次。

1.7? 不同孢子濃度懸浮液對煙草甲幼蟲的毒力測定

經(jīng)試驗篩選獲得2株對煙草甲致死率大于70%的菌株（Bb05和Bbr81），將其分別配制成4個濃度（1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108 mL-1）的孢子懸浮液[12]，使用1.6中的方法接種煙草甲幼蟲，以0.05%吐溫-80作為對照，每組30頭，重復(fù)3次，處理方式及飼養(yǎng)方法同1.6。

1.8? 白僵菌對煙草甲幼蟲的侵染過程觀察

將篩選出的Bb05菌株以1.0×108 mL-1的孢子懸浮液用浸漬法（同1.6）侵染煙草甲2齡幼蟲，每隔24 h用體式顯微鏡進行觀察，并記錄煙草甲體表形態(tài)變化。

1.9? 數(shù)據(jù)處理

使用DPS軟件[13]對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計算出LT50和LC50，用Duncan新復(fù)極差法進行多重比較[14-15]。

2? 結(jié)? 果

2.1? 供試菌株的菌落形態(tài)和培養(yǎng)性狀

供試的昆蟲病原真菌在SDAY培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)皆為近圓形毛氈狀（圖1、表2），10株真菌菌落表面皆具有同心輪紋，但同心輪紋的形狀各不相同，其中菌株LJ1、Bb05、Bbr81中間較厚略凸起外緣較薄;放射狀脊溝紋明顯，有多道明顯的環(huán)狀脊溝紋。LJ4、LJ5、LJ7、Bb01、Bb08、Bbr81、Bbr84等7個菌株的菌落顏色及孢子粉顏色多為乳白色，而LJ1、LJ10、Bb05的菌落及孢子為白色，其中菌株Bb05和菌株Bbr81具有明顯分生孢子層，而其他菌株大多菌絲明顯，說明菌株Bb05和菌株Bbr81具有產(chǎn)孢量大的特點。

由表3可以看出，供試真菌菌株在SDAY培養(yǎng)基上的菌落直徑（5 d，F(xiàn)9，20=51.54，p<0.0001;10 d， F9，20=53.22，p<0.0001;15 d，F(xiàn)9，20=58.28，p<0.0001）、產(chǎn)孢量（F9，20=9.16，p<0.0001）存在顯著性差異。其中Bb05和Bbr81菌株的菌落生長最快，培養(yǎng)15 d時其菌落直徑分別為50.37和49.10 mm。Bbr81的產(chǎn)孢量最高，為7.13×107 cm-2，其次是Bb05菌株，產(chǎn)孢量達6.98×107 cm-2，與Bbr81的產(chǎn)孢量沒有顯著差異。

2.2? 不同昆蟲病原真菌菌株對煙草甲幼蟲的毒力

由表4看出，10種昆蟲病原真菌對煙草甲幼蟲都具有一定的致病性，不同的昆蟲病原真菌對煙草甲幼蟲的累積死亡率存在差異（F9，30=26.82，p<0.0001），菌株Bb05的校正死亡率最高，累積死亡率達到77.78%，LT50為8.18 d。其次，菌株Bbr81的累積死亡率為74.44%，LT50為7.60 d。其他菌株的校正死亡率顯著低于菌株Bb05和菌株Bbr81，表明這兩種菌株對煙草甲幼蟲具有較高的毒力。

2.3? 不同濃度昆蟲病原真菌孢子懸浮液對煙草甲2齡幼蟲的毒力及侵染過程

圖2示出，高濃度的白僵菌孢子懸浮液比低濃度更早更有效地致使煙草甲2齡幼蟲死亡;同時，隨著接種時間的推移，煙草甲2齡幼蟲的累積死亡率逐步增加。在孢子濃度為1.0×108 mL-1條件下接種10 d，菌株Bbr81對煙草甲2齡幼蟲的致死率達到74.44%，菌株Bb05的致死率達77.78%。

由表5可見，以接菌9 d后的致死率計算，菌株Bb05對煙草甲2齡幼蟲的致死中濃度LC50孢子濃度為1.2×107 mL-1，菌株Bbr81的LC50為8.3×107 mL-1，經(jīng)過比較菌株Bb05對煙草甲幼2齡幼蟲的毒力大于菌株Bbr81。

由圖3可見，使用孢子濃度為1.0×108 mL-1的菌株Bb05浸漬接種，煙草甲2齡幼蟲于接種3～4 d開始出現(xiàn)活力減弱現(xiàn)象，蟲體顏色逐漸變暗，少數(shù)幼蟲頭部和足部出現(xiàn)白色菌絲，開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，5～6 d后蟲體整個變?yōu)樽仙w型稍微減小，柔軟蟲體變僵，菌絲逐漸伸出蟲體，并將蟲體整個包裹住，隨著時間的延長蟲體可見大量分生孢子。

3? 討? 論

本研究對從田間采集的僵蟲進行分離純化，獲得5株白僵菌和5株輪枝菌，并對它們進行生物學(xué)性狀和致病力研究，發(fā)現(xiàn)不同菌株之間的生物學(xué)特性存在顯著差異，進一步證實了不同菌株對煙草甲的致病力與其生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率等生物學(xué)性狀相關(guān)，其中菌株生長速率快、產(chǎn)孢量高、孢子萌發(fā)速率高的菌株對煙草甲的毒力更強。這與前人[16-19]的研究結(jié)果基本一致。張龍娃等[20]采用不同濃度白僵菌孢子懸浮液對美國白蛾進行毒力試驗，發(fā)現(xiàn)隨孢子濃度升高，真菌對美國白蛾的侵染率呈上升趨勢。這與本研究發(fā)現(xiàn)的高濃度白僵菌孢子懸浮液對煙草甲2齡幼蟲具有更高的致死率基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)白僵菌菌株Bb05、Bbr81對煙草甲2齡幼蟲具有較高的毒力，這與張曉敏等[12]的報道一致。其中，Bb05菌株在培養(yǎng)15 d時生長最快（直徑50.37 mm）、產(chǎn)孢量最高（6.98×107 cm-2），在孢子濃度為108 mL-1時接種對煙草甲2齡幼蟲的LT50最短（8.19 d），致病力最強（接種10 d校正死亡率77.78%）。依據(jù)接種9 d的結(jié)果，Bb05菌株對煙草甲2齡幼蟲的LC50為1.2×107 mL-1，較Bbr81更低。

致病力的強弱是評定真菌防治價值的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。輪枝菌也是一種廣譜高效、應(yīng)用效果較好的昆蟲病原真菌，目前主要用于蚧類、螨類、蚜蟲類和粉虱類的綠色防控[19]。但本研究選用的5株輪枝菌菌株對煙草甲2齡幼蟲的致病力明顯低于白僵菌菌株。初步推測，雖然兩種真菌的致病機理相似，但不同菌株在孢子萌發(fā)過程中所產(chǎn)生的蛋白酶、脂肪酶以及幾丁質(zhì)酶存在差異[20]，從而導(dǎo)致白僵菌菌株與蠟蚧菌菌株對煙草甲的致病力存在較為明顯的差別。

4? 結(jié)? 論

本研究發(fā)現(xiàn)白僵菌菌株Bb05、Bbr81對煙草甲2齡幼蟲具有較好防治效果，其中Bb05在產(chǎn)孢量、菌落生長速度和毒力等方面更優(yōu)，可為后續(xù)煙草甲雄性成蟲攜菌侵染雌雄成蟲的實倉防治提供理論基礎(chǔ)。而在實際應(yīng)用中適宜真菌萌發(fā)的溫濕度、藥劑劑型、實倉防治以及真菌保存方法等，還需進一步驗證。

參考文獻

[1] 吳彥，尤春雪，田兆福，等. 牡荊葉揮發(fā)油對煙草甲的殺蟲活性[J]. 植物保護，2016，42（5）：97-102，109.

WU Y， YOU C X， TIAN Z F， et al. Insecticidal activity of volatile oil from chastetree leaves on tobacco-a[J]. Plant Protection， 2016， 42（5）： 97-102， 109.

[2] EDDE P A. Biology， ecology， and control of Lasioderma serricorne （F.） （Coleoptera： Anobiidae）： a review[J]. Journal of Economic Entomology， 2019， 112（3）： 1011-1031.

[3] MASATOSHI H， KASAISHI Y， HORI M， et al. Effects of the conditions of the cigarette beetle， Lasioderma serricorne （Fabricius） （Coleoptera： Anobiidae）， on the knockdown time by phosphine fumigation[J]. Japanese Journal of Applied Entomology and Zoology， 2006， 50（1）： 13-17.

[4] HORI M， KASAISHI Y. Estimation of the phosphine resistance level of the cigarette beetle， Lasioderma serricorne （Fabricius） （Coleoptera： Anobiidae）， by the knockdown time of adult[J]. Applied Entomology and Zoology， 2005， 40（4）： 557-561.

[5] IMAI T， HARADA H. Low-temperature as an alternative to fumigation to disinfest stored tobacco of the cigarette beetle， Lasioderma serricorne （F.） （Coleoptera： Anobiidae）[J]. Applied Entomology and Zoology， 2006， 41（1）： 87-91.

[6] SAGLAM O， EDDE P A， PHILLIPS T W. Resistance of Lasioderma serricorne （Coleoptera： Anobiidae） to fumigation with phosphine[J]. Journal of Econmic Entomology， 2015， 108（5）： 2489-2495.

[7] 蒲蟄龍，李增智. 昆蟲真菌學(xué)[M]. 合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，1996.

PU Z L， LI Z Z. Insect mycology[M]. Hefei： Anhui Publishing House of Science and Technology， 1996.

[8] SHINODA K; FUJISAKI K. Effect of adult feeding on longevity and fecundity of the cigarette beetle， Lasioderma serricorne F. （Coleoptera ： Anobiidae）[J]. Applied Entomology and Zoology， 2001， 36（2）： 219-223.

[9] 楊紹佳，邱雯雯，史夢竹，等. 不同濕度下煙草甲實驗種群兩性生命表的構(gòu)建[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，33（2）：177-185.

YANG S J， QIU W W， SHI M Z， et al. Construction of gender life table in tobacco a experimental population under different humidity[J]. Journal of Fujian Agriculture， 2018， 33（2）： 177-185.

[10] 郭軍，戴仁懷，楊洪，等. 煙草甲的優(yōu)良寄生蜂象蟲金小蜂的生物學(xué)特性[J]. 中國生物防治學(xué)報，2018，34（5）：649-655.

GUO J， DAI R H， YANG H， et al. Biological characteristics of Anisopteromalus calandrae （Howard） （Hymenoptera： Pteromalidae： Anisopteromalus）， parasitized on Lasioderma serricorne （Fabricius）[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2018， 34（5）： 649-655.

[11] 張艷梅，謝映平，薛皎亮，等. 油松毛蟲受球孢白僵菌感染的組織病理學(xué)變化[J]. 昆蟲學(xué)報，2011，54（5）：531-539.

ZHANG Y M， XIE Y P， XUE J L， et al. Histopathological changes in Dendrolimus tabulaeformis （Lepidoptera：Lasiocampidae） infected by Beauveria bassiana[J]. Acta Entomologica Sinica， 2011， 54（5）： 531-539.

[12] 張曉敏，楊輝，施鳴，等. 防治煙草甲白僵菌的倉儲應(yīng)用菌株選育[J]. 中國煙草學(xué)報，2015，21（2）：79-84.

ZHANG X M， YANG H， SHI M， et al. Screening and breeding of Beauveria bassiana for controlling tobacco beetles[J]. Chinese Tobacco Science， 2015， 21（2）： 79-84.

[13] 唐啟義，馮明光. 實用統(tǒng)計分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2002.

TANG Q Y， FENG M G. DPS data processing system for practical statistics[M]. Beijing： Science Press， 2002.

[14] TSUCHIYA S， KASAISHI Y， HARADA H， et al. Assessment of the efficacy of Japanese Bacillus thuringiensis isolates against the cigarette beetle， Lasioderma serricorne （Coleoptera ： Anobiidae）[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2002， 81（2）： 122-126.

[15] HORI M， MIWA M， LIZAWA H. Host suitability of various stored food products for the cigarette beetle， Lasioderma serricorne （Coleoptera： Anobiidae）[J]. Applied Entomology and Zoology， 2011， 46（4）： 463-469.

[16] 孟祥坤，朱超，于新，等. 高毒力白僵菌的篩選及對花生甜菜夜蛾的致病力[J]. 中國生物防治學(xué)報，2018，34（2）：259-265.

MENG X K， ZHU C， YU X， et al. Screening of highly toxic Beauveria bassiana and its pathogenicity against peanut beet night moth[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2008， 34（2）： 259-265.

[17] 雷妍圓，呂利華，何余容，等. 球孢白僵菌生物學(xué)特性與其對小菜蛾致病力相關(guān)性分析[J]. 中國生物防治，2010，26（2）：143-148.

LEI Y Y， LYU L H， HE Y R， et al. Correlation between biological characteristics of Beauveria bassiana and its virulence to plutella xylostella[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2010， 26（2）： 143-148.

[18] 胡本進，徐麗娜，胡飛，等. 稻蛀莖夜蛾高致病性球孢白僵菌菌株篩選[J]. 中國生物防治學(xué)報，2015，31（2）：280-283.

HU B J， XU L N， HU F， et al. Screening of highly pathogenic strains of Beauveria bassiana against Sesamia inferens[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2015， 31（2）： 280-283.

[19] 蔡春霞，李茂業(yè)，陳德鑫，等. 八株蠟蚧輪枝菌的生物學(xué)特性及其對煙蚜致病性的影響[J]. 中國煙草科學(xué)，2018，39（5）：86-93.

CAI C X， LI M Y， CHEN D X， et al. Biological characteristics of eight Verticillium lecanii and their effects on the pathogenicity against Myzus persicae aphids[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（5）： 86-93.

[20] 楊曉昱，于蓉蓉. 蠟蚧輪枝菌防治植物病蟲害研究進展[J]. 中國植保導(dǎo)刊，2005（5）：9-11.

YANG X Y， YU R R. Review on research progress on the control of crop pests by using Verticillium lecanii[J]. China Plant Protection， 2005（5）： 9-11.