小麥白粉病生防菌擬諾卡氏菌屬TMG—8菌株的篩選研究

曹遠銀+王婉琳+申璐嵐

摘要：為更好地利用生防菌防控小麥白粉病危害，從不同省份、不同生態(tài)環(huán)境中采集52份土樣，用稀釋分離法得到150株菌株，通過小麥白粉孢子萌發(fā)抑制試驗、小麥離體葉片藥效試驗及溫室苗期藥效試驗篩選得到1株對小麥白粉病抑制作用較強的生防菌株TMG-8。采用16S rDNA序列分析法結合部分生化測定試驗對生防菌TMG-8進行初步鑒定，并采用抗生素抗性標記法測定生防菌TMG-8的定殖能力。初步鑒定菌株TMG-8為擬諾卡氏菌屬；生防菌可在葉面上短暫定殖，在小麥葉片上的定殖量為下部>中部>上部，在小麥苗上的定殖量為根部>莖部>葉部；菌株 TMG-8可在土壤中短期穩(wěn)定定殖，其含量隨著時間逐步增加并趨于穩(wěn)定，但增加幅度不大；無論是浸根處理還是灌根處理，生防菌都能在小麥苗上定殖，定殖量為根部>莖部>葉部，灌根處理比浸根處理含菌量多。

關鍵詞：小麥白粉??；生物防治；擬諾卡氏菌屬；定殖能力

中圖分類號：S435.121.4+6 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2017）01-0095-04

小麥白粉病是由禾本布氏白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tritici）引起的一種世界性病害，在世界各產(chǎn)麥區(qū)均有發(fā)生，是影響小麥生長發(fā)育的主要病害之一[1]。近年來，隨著部分地區(qū)年降水量增多[2]、冬季溫度升高[3]、耕作制度變化以及受菌種變異、品種繁雜等因素的影響[4]，我國小麥白粉病的發(fā)生與危害日趨嚴重，幾乎蔓延至全國所有麥區(qū)，在很多地區(qū)已從次要病害上升為主要病害，成為小麥生產(chǎn)中發(fā)病面積大、危害損失嚴重的常發(fā)性病害。

化學防治是小麥白粉病防治的重要措施，具有防治效果好、收效快、使用方便、受季節(jié)性限制較小、適于大面積使用等優(yōu)點，但近年來隨著藥劑防治的一些弊端如農(nóng)藥殘留、病菌產(chǎn)生抗藥性的出現(xiàn)，人們急需尋找一種安全、高效、無污染的生物農(nóng)藥來解決這些問題[5]。目前，利用有益微生物防治農(nóng)業(yè)植物病害具有良好的應用前景。國內(nèi)外一些學者在生防菌的研究和開發(fā)方面做了大量工作并取得了良好的成果。據(jù)田小衛(wèi)等報道，鏈霉菌屬次生代謝產(chǎn)物在質量濃度為6 000 mg/L時，對小麥白粉病的保護和治療效果分別為76.13% 和70.78%[6]。于基成等研究測定了植物源殺菌劑對小麥白粉病的保護和治療作用，防效分別為66.78%和73.33%，均優(yōu)于其他生物藥劑[7]。張晶等篩選出的放線菌DL26和PJ2對小麥白粉病抑制能力較強，病情指數(shù)與三唑酮處理差異不顯著，防治效果分別達74.43%和70.01%[8]。Hajlaoui等報道Sporothrix flocculosa對小麥白粉病有一定的防治作用[9]，Timothy 等測定了S. flocculosa對小麥白粉病的防治效果，檢測結果表明其與嗎菌靈和硫磺對白粉菌有一樣的防效[10]。美國Agraquest公司曾利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）QST703株系生產(chǎn)出生物農(nóng)藥產(chǎn)品[10]。本研究報道了從山西、山東、河南、甘肅、南京、黑龍江、遼寧等省份和市區(qū)不同生態(tài)環(huán)境的52份土樣中分離篩選得到的生防菌株TMG-8，明確該菌株對小麥白粉病有良好的防效，并觀察其培養(yǎng)特征，測定部分生化特性，結合16S rDNA序列分析進行初步鑒定，同時研究了它在小麥上的定殖能力，為研制防治小麥白粉病的生防制劑打下基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤：分別于2010—2012年，從山西、山東、河南、甘肅、南京、黑龍江、遼寧等省份和市區(qū)不同生態(tài)環(huán)境里采集土樣52份。

供試病原菌：小麥白粉病菌由沈陽農(nóng)業(yè)大學小麥病害實驗室提供。

供試培養(yǎng)基：分離培養(yǎng)基采用馬鈴薯瓊脂糖固體（PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂糖液體（PDB）培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨固體（NA）培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體（NB）培養(yǎng)基、高氏1號固體培養(yǎng)基、高氏1號液體培養(yǎng)基、1.5%瓊脂液體培養(yǎng)基。

1.2 土壤生防菌分離與篩選

1.2.1 生防菌分離 采用土壤稀釋分離法，制備不同濃度梯度的土壤菌懸液（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），依次分別接入PDA、NA和高氏1號培養(yǎng)基中，置于28 ℃下恒溫培養(yǎng)3～5 d，挑取形態(tài)、顏色等培養(yǎng)性狀不同的單菌落轉接，再經(jīng)劃線培養(yǎng)、純化后轉接到相應的液體培養(yǎng)基中，28 ℃下130 r/min培養(yǎng)4～5 d，離心收集上清液。

1.2.2 孢子萌發(fā)抑制試驗 將菌株發(fā)酵液分別與1.5%融化狀態(tài)的瓊脂培養(yǎng)基以1 ∶1混合，取500 μL滴加到載玻片上，將待測定的小麥白粉菌孢子均勻抖落到培養(yǎng)基上，于 18 ℃ 無光條件下培養(yǎng)48 h，以含1.5%瓊脂的無菌水（1 ∶1）培養(yǎng)基上的孢子萌發(fā)率作對照，以1 g/L 15%的三唑酮可濕性粉劑為對照藥劑。每處理重復3次，鏡檢并計算孢子萌發(fā)抑制率。

1.2.3 小麥離體葉藥效試驗[11-12] 選取萌發(fā)抑制率較高的菌株進行離體藥效試驗。采用三點法接種白粉菌于離體苗期小麥葉片上，待肉眼可見白粉菌侵染時，將10 mL發(fā)酵液均勻噴霧在葉片上，同時以1 g/L 15%的三唑酮可濕性粉劑為對照藥劑。將處理的小麥葉片放在室溫（18～20 ℃）光照培養(yǎng)，待清水對照充分發(fā)病時進行調(diào)查（約10 d）。

1.2.4 溫室盆栽苗期藥效試驗[11-12] 將離體葉片試驗藥效好的菌株再次進行盆栽苗期藥效試驗。待小麥長到2葉1心時接種小麥白粉病菌（在各處理區(qū)域均勻擺放3盆已經(jīng)充分發(fā)病的盆栽小苗），用1 g/L 15%的三唑酮可濕性粉劑為對照藥劑，待病菌侵染發(fā)病后噴灑藥劑，藥劑均采用菌株發(fā)酵液原液（菌量控制在106 CFU/mL），噴藥劑量為15 mL/盆，在施藥后1 d按照小麥白粉病病害分級標準調(diào)查病情指數(shù)，然后每隔5 d 調(diào)查1次，連續(xù)調(diào)查4次，并計算防效。

1.3 生防菌株16S rDNA序列分析

生防菌DNA的提取采用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（型號：SK8255）方法進行。采用細菌鑒定通用引物1（27F和1 492R）和細菌鑒定通用引物2（7F和1 540R）進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL，10×Buffer（加Mg2+）2.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，dNTP Mixture 0.5 μL，Taq DNA polymerase 0.5 μL，基因組DNA（20～50 ng/μL）0.5 μL，ddH2O 20 μL。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物的純化與回收參照生工生物工程（上海）股份有限公司SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（型號：SK8131）說明書，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測得基因在GenBank中進行Blast同源序列檢索，并用MEGA 4.0軟件對所得序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.4 生防菌部分生化特性測定[13]

測定菌株明膠液化、纖維素分解、牛奶分解、淀粉水解及硫化氫產(chǎn)生的生化特性。培養(yǎng)基配制參照《常見細菌鑒定手冊》[14]。培養(yǎng)基置于28 ℃下培養(yǎng)3～15 d。

1.5 生防菌定殖能力測定[15-17]

1.5.1 菌株抗生素標記 將培養(yǎng)48 h的生防菌菌株用無菌水制成懸浮液，接入含有一定量的抗生素（濃度為20 μg/mL）的抗性平板上，以不加抗生素的平板為對照，篩選出菌株不能生長的平板，利用該培養(yǎng)基中含有的抗生素對生防菌株進行標記。將菌株接種于抗生素濃度為20 μg/mL的高氏1號培養(yǎng)基中，逐步增加抗生素濃度篩選出能在含500 μg/mL抗生素的高氏1號培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長且形態(tài)特征與原菌株一致的突變菌株。

1.5.2 生防菌在葉片上定殖能力試驗 將標記后的生防菌發(fā)酵液均勻噴灑在小麥葉片上，立刻取上、中、下部葉片，分離并記錄初始菌量，觀察其能否在葉片上定殖。以后每隔5 d分離1次，計算每克葉上的含菌量，記錄菌量變化。

1.5.3 生防菌在土壤中定殖能力試驗 將標記后的生防菌發(fā)酵液作為菌懸液備用。4.5 kg土壤滅菌裝入花盆中，將 10 mL 發(fā)酵液均勻噴灑于土壤中，并噴灑適量的無菌水，使土壤保持濕潤，拂去表土，采用三點取樣法取土，測每克土含菌量，記錄初始菌量。以后每隔7 d分離1次，計算每克土的含菌量和菌量變化。

1.5.4 菌液浸根后的定殖情況 小麥種子經(jīng)表面消毒后在培養(yǎng)箱中催芽，等種子發(fā)芽后用標記生防菌發(fā)酵液浸根1 d，播種于無菌土壤中。15 d后開始分離小麥（根、莖、葉）上的生防菌，以后每隔10 d分離1次，計算每克根、莖、葉中的含菌量，記錄標記菌數(shù)量的變化情況。

1.5.5 菌液灌根后的定殖情況 小麥種子表面消毒播種于花盆中，待長到1心1葉時，向花盆中注入20 mL標記菌發(fā)酵液，15 d后開始分離根、莖、葉上的生防菌，以后每隔10 d計算每克根、莖、葉中的含菌量，記錄標記菌數(shù)量的變化。

2 結果與分析

2.1 土壤生防菌的分離與篩選

采用稀釋分離法分離得到菌株150株，其中真菌65株，細菌49株，放線菌36株；再加上2010—2011年實驗室分離得到的放線菌菌株100株，共250株用于小麥白粉病潛在生防菌的篩選。通過孢子萌發(fā)試驗共得到6株（放線菌5株，真菌1株）對小麥白粉菌孢子萌發(fā)有抑制作用的生防菌株，其中生防菌株TMG-8對小麥白粉菌孢子萌發(fā)抑制作用較強，抑制率為90.0%。對照組三唑酮可濕性粉劑對孢子萌發(fā)抑制率為97.8%。

對生防菌進行離體葉藥效篩選試驗。結果表明，菌株TMG-8的防效是73.8%，1 g/L 15%三唑酮的防效為85.9%，所以該菌株對小麥白粉病具有良好的防效。

溫室盆栽試驗結果（表1）表明，菌株TMG-8的防效在噴藥后1～15 d內(nèi)穩(wěn)定在63.58%～73.98%之間，三唑酮則穩(wěn)定在85.30%～95.33%之間。在經(jīng)過TMG-8處理后的白粉病病情指數(shù)在1～10 d內(nèi)上升幅度很小，能夠維持在較低較穩(wěn)定的狀態(tài)（圖1）。在15 d時，生防菌防效有所降低，這說明菌株在短時間內(nèi)對小麥白粉病菌有良好的抑制效果，并且有短暫的持效期。

2.2 生防菌株16S rDNA序列分析結果

對菌株TMG-8進行PCR擴增，結果得到約1.5 kb的PCR產(chǎn)物（圖2）。菌株TMG-8的16S rDNA序列長度為 1 402 bp，將菌株序列在GenBank中進行Blast比對（表2），結果表明，菌株TMG-8與NCBI登錄號為JF895817.1的擬諾卡氏菌屬鏈孢擬諾卡氏菌（Streptomyces sp. GxW1）同源性最高，高達100%（圖3）。

2.3 生防菌株培養(yǎng)特征及生化特性測定結果

菌株TMG-8在高氏1號培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈粉色，培養(yǎng)期菌落表面光滑且有明顯的輪紋，菌落呈圓形，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基近菌落周圍開始出現(xiàn)明顯的透明現(xiàn)象。

菌株TMG-8生化特性見表3。結果表明，菌株能夠使明膠液化，可以使牛奶石蕊培養(yǎng)基先凝固后胨化，能夠分解纖維素，可以產(chǎn)生H2S，并能夠水解淀粉。

2.4 生防菌定殖能力測定結果

經(jīng)天然抗藥性檢測，生防菌TMG-8對硫酸鏈霉素不具有抗性，因此選用硫酸鏈霉素對其進行標記。

由表4可知，一般在小麥上部葉片的含菌量小于中部，中部小于下部。生防菌可以在葉面上短暫存在，在15 d時，中部和下部葉片含菌量只有102數(shù)量級。從表4中可以看出，在5～10 d 之間，生防菌可以保持103～104的數(shù)量級。

由表5可見，菌株TMG-8都可以在土壤中短期穩(wěn)定定殖，在土壤中的含量隨著時間逐步增加并趨于穩(wěn)定，但增加的幅度并不大，前后相差1個數(shù)量級，為108～109數(shù)量級，所以菌株TMG-8可以在土壤中短期定殖。

通過生防菌TMG-8在小麥上的定殖試驗（表6）可以得出，無論是浸根處理還是灌根處理，菌株TMG-8都能在小麥苗上定殖，定殖量為根部>莖部>葉部。TMG-8經(jīng)灌根處理后，根部、莖部和葉部含菌量均為先增加后減少并逐步趨于穩(wěn)定；灌根處理55 d后，2株放線菌在根、莖、葉中的含量都還在102數(shù)量級上，且菌株TMG-8含量變化比較穩(wěn)定，上下波動不大。使用灌根和浸根處理均能使菌株TMG-8定殖，但是灌根處理放線菌的含量比浸根處理多。

3 結論與討論

本研究從各省份不同生態(tài)環(huán)境中采集多份土樣，經(jīng)小麥白粉菌孢子萌發(fā)抑制試驗、小麥離體葉片藥效試驗、溫室盆栽苗期試驗等層層篩選，得到了1株生防菌TMG-8，該菌在短時間內(nèi)對小麥白粉病有良好的抑制效果，并且有短暫持效期。孢子萌發(fā)抑制試驗中，菌株TMG-8對小麥白粉菌孢子萌發(fā)的抑制率為90.0%；離體葉片試驗中，菌株TMG-8的防效是73.8%；溫室盆栽苗期試驗中，菌株TMG-8的防效在噴藥后的1～10 d內(nèi)穩(wěn)定在63.58%～73.98%之間，具有一定的生防潛力以及應用價值。根據(jù)16S rDNA序列分析比對結果，初步鑒定菌株TMG-8屬于擬諾卡氏菌屬。通過對其部分生化特性測定可知，菌株TMG-8能夠向胞外分泌蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶，還能分解含硫氨基酸產(chǎn)生H2S。

本試驗選用的抗生素抗性標記法具有快速、簡便且成本低的優(yōu)點，此方法不會導致原始菌株的遺傳穩(wěn)定性以及其他重要特性的變異與喪失[18]。通過試驗可知，生防菌可在葉面和小麥苗上短暫存在，在小麥葉片上的定殖量為下部>中部>上部，在小麥苗上的定殖量為根部>莖部>葉部。在 5～10 d之間，可以保持103～104數(shù)量級，這與其生防效果在5～10 d相對穩(wěn)定一致。菌株TMG-8可在土壤中短期穩(wěn)定定殖，在土壤中的含量逐步增加并趨于穩(wěn)定，但增加的幅度并不大，前后相差1個數(shù)量級，為108～109數(shù)量級。無論是浸根處理還是灌根處理，菌株TMG-8都能在小麥苗上定殖，定殖量為根部>莖部>葉部。使用灌根和浸根處理均能使放線菌定殖，但是灌根處理菌的含量比浸根處理多。這與先前報道有相似之處，如姚佳等研究HD8、CS4、YJ1、BC32在油菜根際土壤中短期定殖，HD8在土壤中含量是先升高后降低，數(shù)量最多達到108數(shù)量級；YJ1施入土壤后，其含量一直上升，且研究4株放線菌在油菜苗上定殖時，灌根處理比浸根處理分離得到的放線菌數(shù)量要多[19]。

植物病害的生物防治受植株、病原菌、生防菌以及環(huán)境等多方面因素的影響。由于放線菌在葉片和苗上的定殖容易受環(huán)境和雨水沖洗等多方面的影響，所以放線菌只能在葉片上短暫存在。本研究在室內(nèi)環(huán)境下測定菌株TMG-8對小麥白粉病有一定的防效，但要想開發(fā)成為生防制劑還需研究其田間環(huán)境下的防治效果以及菌株TMG-8對土壤根際酶的影響。

參考文獻：

[1]何家泌，宋玉立，張忠山，等. 小麥白粉病及其防治 Ⅰ. 小麥白粉病的分布、癥狀和危害[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學，1998，37（1）：17-18.

[2]姚惠明，吳永祥，關鐵生. 中國降水演變趨勢診斷極其新事實[J]. 水科學進展，2013，24（1）：1-10.

[3]梁蘇潔，丁一匯，趙 楠，等. 近50年中國大陸冬季氣溫和區(qū)域環(huán)流的年代際變化研究[J]. 大氣科學，2014，38（5）：974-992.

[4]Hua W，Liu Z J，Zhu J，et al. Identification and genetic mapping of pm42，a new recessive wheat powdery mildew resistance gene derived from wild emmer （Triticum turgidum var. dicoccoides）[J]. Theoretical and Applied Genetics，2009，119（2）：223-230.

[5]劉君麗，司乃國，解匯敏，等. 小麥白粉病化學防治現(xiàn)狀及發(fā)展方向[J]. 農(nóng)藥，2002，41（4）：15-16.

[6]田小衛(wèi)，張陳云，吳文云. 一株放線菌次生代謝產(chǎn)物抗菌活性的初步研究[J]. 植物保護，2004，230（2）：51-54.

[7]于基成，劉秋朱，桂 清，等. 不同生物源藥劑對小麥白粉病的防治效果及機理探討[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2007，38（4）：512-517.

[8]張 晶，曹遠銀，程艷輝，等. 小麥白粉病生防菌株的篩選及其防效的初步研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學，2011，40（6）：97-99.

[9]Hajlaoui M，Belanger R. Antagonism of the yeast-like phylloplane fungus Sporothrix flocculosa against Erysiphe graminis var. tritici[J]. Biocontrol Science & Technology，1993，3（4）：427-434.

[10]Timothy C，Paulitz R，Belanger R. Biological control in greenhouse systems[J]. Annual Reviews of Phytopathology，2001，39（4）：103-133，28-32.

[11]王衛(wèi)紅. 不同殺菌劑對小麥白粉病的防效試驗[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（1）：165-168.

[12]劉積芝. 小麥白粉病的防治指標和藥劑防治[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），1988，19（2）：87-89.

[13]桑利偉，劉愛勤，孫世偉，等. 一株拮抗胡椒瘟病菌的生防菌S的鑒定及其生物學特性研究[J]. 中國生物防治學報，2015，31（2）：291-296.

[14]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001.

[15]梁軍鋒，薛泉宏，牛小磊，等. 7株放線菌在辣椒根部定殖及對辣椒葉片PAL與PPO活性的影響[J]. 西北植物學報，2005，25（10）：2118-2123.

[16]翁啟勇，陳慶河，趙 健，等. 利福平標記菌株BS1在番茄、茄子根部及土壤中的定殖動態(tài)[J]. 福建農(nóng)業(yè)學報，2003，18（2）：87-88.

[17]袁樹忠，周明國. 辣椒疫病生物防治菌株的篩選與定殖[J]. 揚州大學學報（農(nóng)業(yè)與生命科學版），2006，27（4）：93-97.

[18]姚震聲，陳中義，陳志誼，等. 綠色熒光蛋白基因標記野生型生防枯草芽孢桿菌的研究[J]. 生物工程學報，2003，19（5）：551-556.

[19]姚 佳. 放線菌發(fā)酵液對油菜菌核病的生物防治研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2010.魯海菊，李 河，史淑義，等. 云南省石榴干腐病病菌生物學特性及其防治藥劑篩選[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45（1）：99-102.