• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    多黏類芽孢桿菌HT16對梨采后黑斑病的抑制效果

    2017-02-27 11:01:11曹麗亞陳大歡郭榮艷
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:黑斑病生物防治

    曹麗亞+陳大歡+郭榮艷

    摘要:研究了多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病菌(Alternaria kikuchiana)的抑制作用,并對其應(yīng)用效果進(jìn)行了評價。結(jié)果表明,多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病菌的體外抑制率為53.2%,其粗提蛋白嚴(yán)重破壞了梨黑斑病菌的菌絲和孢子,顯著抑制了梨采后黑斑病的發(fā)生,呈現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力。

    關(guān)鍵詞:梨;黑斑??;多黏類芽孢桿菌;生物防治

    中圖分類號: TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2017)01-0107-03

    梨黑斑病是一種由鏈格孢菌(Alternaria kikuchiana)引起的世界性氣傳真菌病害,主要侵染葉片,造成大量落葉,也危害果實(shí)和新梢,嚴(yán)重危害果品的生產(chǎn)和儲存。我國是梨種植和出口大國,梨產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的2/3,出口量約占世界總出口量的1/6,梨的出口是增加國民生產(chǎn)總值、農(nóng)民收入的重要途徑。然而,病原微生物的侵染造成梨采后腐爛損失嚴(yán)重[1]。其中,黑斑病是梨采后的重要病害之一,嚴(yán)重時可使梨采后損失達(dá)50%以上,在我國和韓國都曾嚴(yán)重暴發(fā)[2]。近年,法國也發(fā)現(xiàn)有梨黑斑病的發(fā)生與危害[3]。目前,農(nóng)業(yè)上主要使用化學(xué)殺菌劑來控制病害發(fā)生。然而,大量使用化學(xué)農(nóng)藥引起的病菌抗藥性、食品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)、環(huán)境污染等問題日益嚴(yán)重。因此,尋求高效、安全的生物殺菌制劑成為防治農(nóng)作物、果蔬等病害的主要出路之一,也是近年來研究的熱點(diǎn)[4-8]。

    多黏類芽孢桿菌對植物具有非致病性,且細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素,對人畜無害,在產(chǎn)品開發(fā)中活菌數(shù)量高、性能穩(wěn)定,是一種理想的生防菌。多黏類芽孢桿菌HT16 是筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離并保存的1株能有效抑制真菌病害的菌株。前期試驗(yàn)表明,該菌及發(fā)酵液對多種植物病原菌具有廣譜的抑制作用,其抗菌物質(zhì)為耐熱、耐酸堿、耐紫外線的蛋白質(zhì)[9]。本研究評價了多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病菌的抑制活性及對梨采后黑斑病的控制效果,并探討其抑菌機(jī)理,為進(jìn)一步深入研究其生防效果和開發(fā)微生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    供試?yán)鏋楹颖笔≮w縣白梨(水晶梨)。供試生防菌株多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) HT16由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存,梨黑斑病病原菌由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。

    儀器設(shè)備包括BM-103CE光學(xué)顯微鏡,上海比目儀器有限公司;YT-CJ-1N 超凈工作臺,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SYQ-DSX-280B 不銹鋼手提式,山東新華醫(yī)療器械廠;TCL-15B離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;生化培養(yǎng)箱,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;pH211 酸度計(jì),壓力蒸汽滅菌鍋等。

    1.2 培養(yǎng)基

    發(fā)酵培養(yǎng)基[10]:馬鈴薯30%,(NH4)2SO4 0.4%,蔗糖 1.5%,K2HPO4 0.05%,MgSO4·7H2O 0.05%,黃豆餅粉0.1%,pH值6.5。PDA培養(yǎng)基:葡萄糖2%、馬鈴薯20%、瓊脂2%、1 000 mL 蒸餾水,pH值6.5。PDB培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基):葡萄糖2%、馬鈴薯20%、1 000 mL 蒸餾水,pH值6.5。

    1.3 多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病病原菌的抑制活性

    1.3.1 菌體抑制活性的測定 采用對峙法測定HT16對梨黑斑病病原菌的抑制活性。將梨黑斑病病原菌接種于PDA平板上,置于25 ℃條件下培養(yǎng)7 d。在平板培養(yǎng)物上用打孔器取直徑6 mm的菌塊,接種在另一PDA平板中央,將HT16菌株均勻接種于距平板邊緣20 mm處的4個點(diǎn)上,28 ℃培養(yǎng)7 d,采用十字交叉法測量病原菌直徑,以不接種HT16的PDA平板作對照,參照文獻(xiàn)[10]計(jì)算抑菌率,抑菌率= (對照病菌直徑-處理病菌直徑-6 mm)/對照病原菌直徑×100%。每個處理作3個重復(fù),該試驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.3.2 不同處理液抑菌活性的測定

    1.3.2.1 HT16發(fā)酵液的制備 將24 h 種齡的HT16 種子培養(yǎng)液以體積分?jǐn)?shù)為10% 的接種量轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,置于30 ℃培養(yǎng)箱中,186 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h,備用。

    1.3.2.2 HT16菌懸液的制備 將培養(yǎng)24 h的HT16種子培養(yǎng)液,以8 000 r/min離心10 min,棄上清,菌體沉淀以無菌水清洗2次,離心,最終以無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌體濃度 1億CFU/mL 左右,備用。

    1.3.2.3 蛋白粗提液的制備 將上述HT16發(fā)酵液以 8 000 r/min 離心10 min,取上清,用6 mol/L HCl 調(diào)pH值至2.5,并用80%硫酸銨沉淀,4 ℃靜置過夜;然后在4 ℃條件下,10 000 r/min離心15 min,棄上清液;沉淀用1/20發(fā)酵液體積的磷酸鹽緩沖液(pH值7.2)溶解,裝入透析袋,透析過夜;用固體聚乙二醇2000進(jìn)行濃縮,濃縮至原體積的1/5,作為HT16發(fā)酵液的粗提蛋白,備用。

    1.3.2.4 不同處理液抑菌活性的測定 將100 μL梨黑斑病病原菌的孢子懸液(孢子濃度約10萬個/mL)均勻涂布于 20 mL PDA培養(yǎng)基上,晾干后,放入牛津杯,分別加入上述不同處理液,28 ℃培養(yǎng)2 d,觀察測量抑菌圈大小。

    1.4 多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病發(fā)病率的抑制

    選取個體均勻、表面無明顯損傷且未發(fā)病的梨果實(shí),以2%次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒,并以水清洗,晾干備用。

    在梨果實(shí)的腰部兩側(cè)進(jìn)行無菌刺傷接種,傷口大小約為3 mm(直徑)×3 mm(深)。向傷口中注入100 μL上述不同處理液,以無菌水作為對照。晾干后再向同一個傷口上接種50 μL梨黑斑病病原菌的孢子懸液(孢子濃度約為10萬個/mL),室溫下晾干后,將果實(shí)放入有隔層的紙箱內(nèi),并在紙箱外套上塑料袋使其保持相對濕度(90±5)%,置于28 ℃下貯藏。每隔24 h觀察1次,記錄病斑直徑并計(jì)算發(fā)病率。

    發(fā)病率=發(fā)病果個數(shù)/調(diào)查個數(shù)×100%。

    1.5 多黏類芽孢桿菌HT16的抑菌機(jī)理

    1.5.1 HT16對梨黑斑病病原菌孢子萌發(fā)的影響 將2 mL梨黑斑病病原菌的孢子懸液(孢子濃度約為10萬個/mL)加入到滅菌的2 mL PDB培養(yǎng)基中,同時接種500 μL上述蛋白粗提液,以不加蛋白粗提液的作為對照,28 ℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)14 h,在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況。

    孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子個數(shù)/觀察孢子個數(shù)×100%。

    1.5.2 HT16對梨黑斑病病原菌菌絲生長的影響 將 500 μL 梨黑斑病病原菌的孢子懸液(孢子濃度10萬個/mL左右)加入到滅菌的50 mLPDB培養(yǎng)基中,于28 ℃下 150 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h,加入500 μL蛋白粗提液,繼續(xù)培養(yǎng)8 h,在掃描電鏡下比較菌絲的生長情況[11]。以不加蛋白粗提液的作為對照。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病病原菌的抑制效果

    由圖1可以看出,多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病病原菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制效果,其抑制率為53.2%。多黏類芽孢桿菌HT16的不同處理液對梨黑斑病病原菌的生長也表現(xiàn)出不同的抑制作用(圖2)。其中,HT16粗提蛋白的抑菌效果最顯著,抑菌圈直徑達(dá)到17.6 mm。HT16菌懸液和發(fā)酵液對梨黑斑病病原菌的抑菌圈直徑分別為10.4、14.7 mm。

    2.2 多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病發(fā)病率的影響

    對健康的梨果實(shí)進(jìn)行刺傷,接種不同的處理液后,接種黑斑病病原菌,再進(jìn)行貯藏,結(jié)果如圖3、圖4所示。由圖3可以看出,多黏類芽孢桿菌HT16的發(fā)酵液、菌懸液、蛋白粗提液對梨黑斑病病原菌均有不同程度的抑制效果,處理組的梨黑斑病發(fā)病率明顯低于對照。在保存的第2天,對照和菌懸液組的梨發(fā)病率達(dá)到100%,發(fā)酵液處理組的梨發(fā)病率為 83.3%,而蛋白粗提液處理的梨果實(shí)未發(fā)病。保存到第12天,對照的梨黑斑病病斑直徑達(dá)到 39.61 mm,而發(fā)酵液組、菌懸液組、蛋白粗提液組的梨黑斑病病斑直徑分別為36.53、35.17、0 mm。由此可以看出,粗提蛋白抑菌效果最好,無發(fā)病狀況。菌懸液處理后的傷口梨黑斑生長旺盛,發(fā)酵液處理組雖有傷口腐爛但無梨黑斑菌絲出現(xiàn)。可見,發(fā)酵液比菌懸液處理組更能抑制梨黑斑病菌的生長,這與體外抑菌結(jié)果一致。

    2.3 多黏類芽孢桿菌HT16的抑菌機(jī)理

    2.3.1 對孢子萌發(fā)的影響 多黏類芽孢桿菌HT16蛋白粗提液對梨黑斑菌病原菌孢子萌發(fā)的影響如圖4所示。由圖4-A中可以看出,梨黑斑的對照組孢子已經(jīng)萌發(fā),經(jīng)測定其萌發(fā)率為96.67%,并生長出菌絲,而圖4-B 中的孢子未萌發(fā)并且有消融現(xiàn)象出現(xiàn)。

    2.3.2 對菌絲生長的影響 在掃描電鏡下觀察了HT16處理梨黑斑菌絲生長的形態(tài),結(jié)果如圖5所示。圖5-B-1、圖5-B-2為粗提蛋白處理后菌絲狀況。由此可以看出,蛋白粗提液處理的梨黑斑菌絲扭曲并且萎縮,菌絲外表皮有脫落現(xiàn)象,菌絲變成畸形狀態(tài),且有斷裂現(xiàn)象。而正常的菌絲光滑、均勻(圖5-A-1、圖5-A-2)。

    3 結(jié)論與討論

    對峙法和牛津杯法的結(jié)果均顯示,多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑病菌鏈格孢菌有顯著的抑制作用。HT16菌懸液、發(fā)酵液和粗提蛋白對梨采后黑斑病均表現(xiàn)出一定的抑制效果。其中,粗提蛋白的效果最顯著。掃描電鏡和電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),粗提蛋白處理過的病原菌孢子基本不萌發(fā),并有消融現(xiàn)象,且菌絲扭曲、萎縮,菌絲外表皮出現(xiàn)脫落和斷裂。這些結(jié)果顯示了多黏類芽孢桿菌HT16作為生防細(xì)菌的可行性。

    HT16菌株發(fā)酵過程中產(chǎn)生的粗提蛋白對梨采后黑斑病的防治效果非常顯著, 抑菌機(jī)制試驗(yàn)也證實(shí)了粗提蛋白對梨黑斑及其孢子和菌絲的抑制作用。近年來,利用微生物自身的拮抗、競爭作用及其產(chǎn)生的抗菌蛋白防治果蔬采前和采后病原真菌的報道很多。其中,枯草芽孢桿菌H110的粗提蛋白對梨采后因青霉菌和黑斑病菌引起的腐敗表現(xiàn)出很好的抑制效果[10]。周防震將番茄表面分離到的酵母菌L-1-6和 H-2 用于控制番茄的腐敗,菌懸液處理后的番茄腐爛率、失水率和總損耗均顯著降低,對采后番茄的根霉病及早疫病病害的控制也起到了顯著效果[12]。Wichitea等報道,分離自土壤中的枯草芽孢桿菌對柑橘類水果由青霉引起的病害抑制效果顯著[13]。Arun等發(fā)現(xiàn),畢赤酵母和假絲酵母對炭疽病菌有防治作用,能顯著降低辣椒炭疽及其他病害的發(fā)病率[14]。細(xì)菌 P-FS08 所產(chǎn)生的拮抗蛋白對果蔬和糧食作物致病真菌也表現(xiàn)出廣譜的抑菌作用,可使病原菌菌絲斷裂、原生質(zhì)體濃縮[15]。但對于多黏類芽孢桿菌HT16對梨黑斑的防治未見報道。

    為使菌株真正在生產(chǎn)中應(yīng)用,達(dá)到有效防治果蔬采前和采后病害的目的,在后續(xù)研究中還將對該菌株及其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)進(jìn)行安全性評價,同時聯(lián)合農(nóng)業(yè)相關(guān)企業(yè)嘗試開發(fā)該微生物制劑,探討該菌株與其他物質(zhì)如殼聚糖、水楊酸等[16-17]的聯(lián)合使用效果和使用方式,并進(jìn)行田間藥效試驗(yàn),以期為生物農(nóng)藥的研發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)際參考,為果蔬病害的生物防治及食品安全提供保障。

    參考文獻(xiàn):

    [1]楊曉蕾,錢國良,范加勤,等. 梨黑斑病菌拮抗細(xì)菌的篩選鑒定及其拮抗活性的研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,37(1):68-74.

    [2]Simmons E G. Alternaria themes and variations[J]. Mycotaxon,1993,48:109-140.

    [3]Baudry A,Morzieres J P,Larue P. First report of Japanese pear black spot caused by Alternaria Kikuchiana in France[J]. Plant Disease,2001,19(4):19-22.

    [4]趙 爽,劉偉成,裘季燕,等. 多黏類芽孢桿菌抗菌物質(zhì)和防病機(jī)制之研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報,2008,24(7):347-350.

    [5]陳雪麗,王光華,金 劍,等. 多黏類芽孢桿菌BRF-1和枯草芽孢桿菌BRF-2對黃瓜和番茄枯萎病的防治效果[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報,2008,16(2):446-450.

    [6]Liu W W,Mu W,Zhu B Y,et al. Antagonistic activities of volatiles from four strains of Bacillus spp. and Paenibacillus spp. against soil-borne plant pathogens[J]. Agricultural Sciences in China,2008,7(9):1104-1114.

    [7]王 宏,常有宏,陳志誼. 梨黑斑病病原菌生物學(xué)特性研究[J]. 果樹學(xué)報,2006,23(2):247-251.

    [8]Zhang H Y,Ma L C,Wang L,et al. Biocontrol of gray mold decay in peach fruit by integration of antagonistic yeast with salicylic acid and their effects on postharvest quality parameters[J]. Biological Control,2008,47(1):60-65.

    [9]毛 亮,周 怡,張婷婷,等. 多黏性芽孢桿菌HT16抗真菌物質(zhì)

    的分離及特性研究[J]. 食品科技,2009,34(10):2-9.

    [10]齊東梅,惠 明,梁啟美,等. 枯草芽孢桿菌H110對蘋果梨采后青霉病和黑斑病的抑制效果[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2005,11(2):171-174.

    [11]張 偉,艾啟俊,吳小虎. 鹿蹄草素對兩種果品致腐真菌的抑菌作用及其掃描電鏡觀察[J]. 食品科技,2008,33(1):182-185.

    [12]周防震. 番茄采后病害拮抗酵母菌的篩選和應(yīng)用[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

    [13]Wichitra L P,Samerchai C. Growth inhibitory properties of Bacillus subtilis strains and their metabolites against the green mold pathogen(Penicillium digitatum Sacc.)of citrus fruit[J]. Postharvest Biology and Technology,2008,48:113-121.

    [14]Chanchaichaovivat A R P. Identification of yeast strains from fruits,vegetables:potential for biological control of postharvest chilli anthracnose(Colletotrichum capsici)[J]. Biological Control,2007,42(3):326-335.

    [15]石志琦,胡梁斌,于淑池,等. 細(xì)菌P-FS08的鑒定及其對幾種植物病原真菌的拮抗作用[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005,28(3):48-52.

    [16]Meng X H,Qin G Z,Tian S P. Influences of preharvest spraying Cryptococcus laurentii combined with postharvest chitosan coating on postharvest diseases and quality of table grapes in storage[J]. LWT-Food Science and Technology,2010,43(4):596-601.

    [17]崔 旸,李 健,曹建康,等. 葡萄籽提取物、殼聚糖及其復(fù)合處理對鴨梨貯藏品質(zhì)的影響[J]. 食品工業(yè)科技,2009,30(1):282-285. 張金萍,蔣 萍. 新疆楊樹葉紋斑病病原菌分離及致病性測定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(1):110-113.

    猜你喜歡
    黑斑病生物防治
    植物內(nèi)生菌在植物病害中的生物防治
    農(nóng)藥與五味子提取物的復(fù)配對梨黑斑病的研究
    河北果樹(2020年2期)2020-05-25 06:58:10
    多管齊下 防好甘薯黑斑病
    淺談林業(yè)有害生物防治
    林業(yè)有害生物防治技術(shù)分析
    柑桔黑斑病病原菌的研究進(jìn)展
    加強(qiáng)有害生物防治,保護(hù)林木生態(tài)安全——方城縣有害生物防治工作成效顯著
    植物病害生物防治
    牛甘薯黑斑病中毒的鑒別診斷與防治
    棉花黃萎病拮抗菌的篩選及其生物防治效果
    人妻 亚洲 视频| 97在线人人人人妻| 特大巨黑吊av在线直播| 熟妇人妻不卡中文字幕| 日日啪夜夜爽| 涩涩av久久男人的天堂| av在线app专区| 在线观看人妻少妇| eeuss影院久久| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 在线观看一区二区三区| 亚洲国产av新网站| 亚洲国产欧美在线一区| 一边亲一边摸免费视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 有码 亚洲区| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 日韩中字成人| 黄片wwwwww| 少妇人妻久久综合中文| 美女主播在线视频| 久久久成人免费电影| 亚洲怡红院男人天堂| 国产亚洲91精品色在线| 777米奇影视久久| 日韩三级伦理在线观看| 高清av免费在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 夫妻午夜视频| 激情 狠狠 欧美| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 成人特级av手机在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲欧洲日产国产| 欧美性感艳星| 青青草视频在线视频观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 91在线精品国自产拍蜜月| 深爱激情五月婷婷| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久97久久精品| 91久久精品国产一区二区三区| 国产成年人精品一区二区| 在线观看三级黄色| 2018国产大陆天天弄谢| 亚州av有码| 久久久久久伊人网av| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲精品成人久久久久久| 婷婷色综合大香蕉| 成人黄色视频免费在线看| 成人国产麻豆网| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲怡红院男人天堂| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 夫妻午夜视频| 丰满乱子伦码专区| 麻豆国产97在线/欧美| 高清日韩中文字幕在线| 大片电影免费在线观看免费| 搡老乐熟女国产| 超碰av人人做人人爽久久| 久久6这里有精品| 黄色怎么调成土黄色| 免费大片18禁| 亚洲,一卡二卡三卡| 精品少妇久久久久久888优播| 嫩草影院新地址| 亚洲国产精品成人综合色| 能在线免费看毛片的网站| 热99国产精品久久久久久7| 国产成人aa在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲人成网站在线播| 97在线人人人人妻| 成人综合一区亚洲| 国产精品人妻久久久久久| 99re6热这里在线精品视频| 插逼视频在线观看| 男人舔奶头视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久久久伊人网av| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 久久ye,这里只有精品| 欧美一区二区亚洲| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 一本一本综合久久| 51国产日韩欧美| 嘟嘟电影网在线观看| 国产爽快片一区二区三区| av专区在线播放| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日本免费在线观看一区| 久久精品人妻少妇| 婷婷色综合大香蕉| 日韩av免费高清视频| 国产精品久久久久久av不卡| 好男人在线观看高清免费视频| 美女视频免费永久观看网站| 国产高清三级在线| 内射极品少妇av片p| 日本-黄色视频高清免费观看| freevideosex欧美| 少妇丰满av| 亚洲欧美一区二区三区国产| 2021少妇久久久久久久久久久| 天堂俺去俺来也www色官网| 99久久人妻综合| 美女被艹到高潮喷水动态| 欧美激情久久久久久爽电影| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 日日啪夜夜撸| 亚洲伊人久久精品综合| 高清av免费在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 精品人妻熟女av久视频| 午夜精品国产一区二区电影 | 少妇的逼水好多| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 国内揄拍国产精品人妻在线| 夫妻午夜视频| 国产精品久久久久久av不卡| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲av不卡在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲精品视频女| 美女国产视频在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 极品教师在线视频| 99热这里只有是精品50| 在线播放无遮挡| 国产老妇女一区| 亚洲自拍偷在线| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久久久精品性色| 久久久久久久大尺度免费视频| 联通29元200g的流量卡| 精品少妇黑人巨大在线播放| 午夜福利高清视频| 精品国产三级普通话版| 青春草亚洲视频在线观看| 久久久色成人| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产淫语在线视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲精品,欧美精品| 国产成人福利小说| 久久韩国三级中文字幕| 国产老妇伦熟女老妇高清| 成人亚洲精品av一区二区| 少妇的逼水好多| 色网站视频免费| av播播在线观看一区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 在线观看美女被高潮喷水网站| 老司机影院成人| 直男gayav资源| 内射极品少妇av片p| av在线蜜桃| 国产精品久久久久久精品电影| 一级二级三级毛片免费看| 六月丁香七月| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 边亲边吃奶的免费视频| 看非洲黑人一级黄片| 搡老乐熟女国产| 在线免费十八禁| 又爽又黄a免费视频| 免费看光身美女| 亚洲av国产av综合av卡| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 免费观看性生交大片5| 亚洲成人久久爱视频| 新久久久久国产一级毛片| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久影院123| 国产亚洲av嫩草精品影院| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品一及| 国精品久久久久久国模美| 午夜爱爱视频在线播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| www.av在线官网国产| 91aial.com中文字幕在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 好男人视频免费观看在线| 久热久热在线精品观看| 国产在线男女| 我的老师免费观看完整版| 亚洲精品色激情综合| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 超碰97精品在线观看| 另类亚洲欧美激情| 国产午夜福利久久久久久| 99热网站在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 男人狂女人下面高潮的视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久精品国产自在天天线| 久久97久久精品| 97精品久久久久久久久久精品| 国产 一区 欧美 日韩| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 26uuu在线亚洲综合色| 国产成人免费无遮挡视频| 韩国av在线不卡| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产精品久久久久久久电影| 久久久久久伊人网av| 日韩视频在线欧美| 亚洲色图av天堂| eeuss影院久久| 免费观看性生交大片5| 日本黄色片子视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 免费观看av网站的网址| 久久久成人免费电影| 在线观看免费高清a一片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲国产日韩一区二区| 日本与韩国留学比较| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 一本久久精品| 免费黄频网站在线观看国产| 成年版毛片免费区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 精品一区在线观看国产| 亚洲精品第二区| 国产午夜精品一二区理论片| 久久热精品热| 成人特级av手机在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久精品人妻少妇| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产亚洲精品久久久com| 国产一区有黄有色的免费视频| 网址你懂的国产日韩在线| av国产免费在线观看| 亚洲av一区综合| 特大巨黑吊av在线直播| 国产成人精品福利久久| 少妇丰满av| 69av精品久久久久久| av线在线观看网站| 欧美日韩综合久久久久久| 国产伦精品一区二区三区视频9| 丝袜美腿在线中文| 香蕉精品网在线| 久久久久国产网址| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲精品国产av蜜桃| 波野结衣二区三区在线| 99久久精品热视频| 欧美zozozo另类| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日日撸夜夜添| 在现免费观看毛片| 久热这里只有精品99| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 色视频在线一区二区三区| 极品教师在线视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 最近手机中文字幕大全| 国产免费又黄又爽又色| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲国产欧美人成| 秋霞在线观看毛片| 日本熟妇午夜| 少妇人妻 视频| 毛片一级片免费看久久久久| 99热这里只有精品一区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久久久久久久大av| 热99国产精品久久久久久7| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲真实伦在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 免费看av在线观看网站| 黄色一级大片看看| 亚洲怡红院男人天堂| 久久久久网色| 在线播放无遮挡| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 精品熟女少妇av免费看| 久久久精品94久久精品| 欧美丝袜亚洲另类| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产 一区精品| 久久午夜福利片| 国产大屁股一区二区在线视频| 中文天堂在线官网| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲不卡免费看| av.在线天堂| 国国产精品蜜臀av免费| 免费看av在线观看网站| 亚洲色图av天堂| 五月玫瑰六月丁香| 最近的中文字幕免费完整| 国产一区二区三区综合在线观看 | 伦理电影大哥的女人| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲国产色片| 熟女av电影| 精品国产三级普通话版| 99久国产av精品国产电影| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲自拍偷在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 欧美高清成人免费视频www| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久色成人| 国产精品不卡视频一区二区| 男女下面进入的视频免费午夜| 男插女下体视频免费在线播放| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 中文字幕久久专区| 国产极品天堂在线| 丝袜美腿在线中文| 免费少妇av软件| 国产精品福利在线免费观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 在线观看一区二区三区激情| 日本与韩国留学比较| 六月丁香七月| 人人妻人人看人人澡| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲国产色片| 伊人久久精品亚洲午夜| 日日撸夜夜添| 免费黄色在线免费观看| 高清在线视频一区二区三区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 综合色av麻豆| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 日本色播在线视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久久久精品免费免费高清| 日本色播在线视频| 久久久久九九精品影院| 久久久欧美国产精品| 亚洲国产av新网站| 国产黄色视频一区二区在线观看| www.av在线官网国产| 黑人高潮一二区| 欧美丝袜亚洲另类| 日韩国内少妇激情av| 日韩大片免费观看网站| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩国内少妇激情av| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品久久久久久精品古装| 国产精品一区二区在线观看99| a级毛片免费高清观看在线播放| 欧美极品一区二区三区四区| 永久网站在线| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久久午夜欧美精品| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久久精品免费免费高清| 精品久久久久久电影网| 少妇熟女欧美另类| 99视频精品全部免费 在线| 有码 亚洲区| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩欧美一区视频在线观看 | 涩涩av久久男人的天堂| 男人舔奶头视频| 成人漫画全彩无遮挡| 国产久久久一区二区三区| 成人毛片a级毛片在线播放| av卡一久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 一级毛片 在线播放| 成人鲁丝片一二三区免费| 日本免费在线观看一区| 黄色怎么调成土黄色| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久久午夜欧美精品| 一级毛片我不卡| 亚洲,欧美,日韩| 国产成人福利小说| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 色网站视频免费| 亚洲最大成人av| 99热全是精品| 亚洲经典国产精华液单| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 少妇 在线观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 中文字幕久久专区| 少妇丰满av| 麻豆乱淫一区二区| 寂寞人妻少妇视频99o| 丝袜美腿在线中文| 18+在线观看网站| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲美女视频黄频| 国产乱来视频区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 大片免费播放器 马上看| 久久久久久久久久成人| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 日韩精品有码人妻一区| 日韩一区二区三区影片| 两个人的视频大全免费| 亚洲高清免费不卡视频| a级一级毛片免费在线观看| 日日撸夜夜添| 如何舔出高潮| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 在线a可以看的网站| 视频中文字幕在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 免费电影在线观看免费观看| 久久精品久久久久久久性| 日韩人妻高清精品专区| 午夜福利视频1000在线观看| 特级一级黄色大片| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 爱豆传媒免费全集在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久久久网色| 国产成人精品福利久久| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产日韩欧美在线精品| 视频区图区小说| 久久精品久久久久久久性| 国产黄片美女视频| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 男男h啪啪无遮挡| 日韩电影二区| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲最大成人手机在线| 天堂网av新在线| 久久久亚洲精品成人影院| 国产av国产精品国产| 夫妻午夜视频| 国产亚洲一区二区精品| 国产精品久久久久久久电影| 偷拍熟女少妇极品色| 观看免费一级毛片| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久精品国产亚洲av天美| 欧美xxⅹ黑人| 国产精品爽爽va在线观看网站| 在线播放无遮挡| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美日韩精品成人综合77777| 少妇 在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美成人a在线观看| 国产毛片a区久久久久| 色视频在线一区二区三区| 中文字幕久久专区| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲精品成人av观看孕妇| 人妻夜夜爽99麻豆av| 午夜福利视频1000在线观看| av天堂中文字幕网| 亚洲色图综合在线观看| 国产成人一区二区在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产精品久久久久久精品古装| freevideosex欧美| 亚洲国产精品成人久久小说| 九九在线视频观看精品| 国产成人a∨麻豆精品| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲国产av新网站| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲真实伦在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 成人亚洲精品一区在线观看 | 亚洲国产高清在线一区二区三| 青青草视频在线视频观看| 联通29元200g的流量卡| 亚洲av.av天堂| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲欧美精品专区久久| 麻豆乱淫一区二区| 国产黄色免费在线视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 少妇 在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 最近手机中文字幕大全| 看十八女毛片水多多多| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲,欧美,日韩| 校园人妻丝袜中文字幕| 中国美白少妇内射xxxbb| 嫩草影院精品99| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产综合懂色| av免费在线看不卡| 狠狠精品人妻久久久久久综合| av免费观看日本| 国产精品久久久久久精品古装| 久久国产乱子免费精品| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 国产69精品久久久久777片| 久久精品人妻少妇| 久久人人爽人人片av| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久人人爽人人片av| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久久久国产精品人妻一区二区| 身体一侧抽搐| 亚洲综合精品二区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 成人亚洲精品一区在线观看 | 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 精品人妻熟女av久视频| 国产免费福利视频在线观看| 插阴视频在线观看视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 最后的刺客免费高清国语| 精品熟女少妇av免费看| 男人和女人高潮做爰伦理| .国产精品久久| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 熟女av电影| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产成人精品福利久久| 六月丁香七月| 国产男女超爽视频在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产精品久久久久久av不卡| 成人免费观看视频高清| 国产精品久久久久久av不卡| 日本免费在线观看一区| 国产亚洲精品久久久com| 国产午夜福利久久久久久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 99热6这里只有精品| 日本与韩国留学比较| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 性色avwww在线观看| 日本免费在线观看一区| 亚洲精品日本国产第一区| 国产永久视频网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 亚洲国产日韩一区二区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 三级经典国产精品| 成人无遮挡网站| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲成人久久爱视频| 日韩欧美精品v在线| 如何舔出高潮| 精品久久久久久电影网| 国产成人a区在线观看| 有码 亚洲区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 成人漫画全彩无遮挡| 天天一区二区日本电影三级| 丝袜美腿在线中文| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲真实伦在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 七月丁香在线播放| 国产探花在线观看一区二区| 综合色av麻豆| 日本熟妇午夜| 大片免费播放器 马上看| 国内精品美女久久久久久| 国产精品99久久99久久久不卡 |