NtPHYB1與儲(chǔ)藏溫度互作調(diào)控?zé)煵莘N子光休眠和后熟

王堯，董帥，張民，李振華

摘? 要：為了解煙草種子光休眠與后熟的分子機(jī)理，本研究以野生型（WT）、NtPHYB1過(guò)表達(dá)（NtPHYB1-OE）和NtPHYB1 RNA干擾（NtPHYB1-RNAi）3種煙草種子為材料，在恒溫和變溫2種環(huán)境下進(jìn)行后熟。結(jié)果表明，與WT新采收種子相比，NtPHYB1-RNAi新采收種子光休眠顯著加深，而NtPHYB1-OE新采收種子光休眠未顯著變淺。與恒溫后熟相比，變溫下WT和NTPHYB1-OE種子后熟加快，而NTPHYB1-RNAi種子變化不顯著。與WT新采收種子相比，NtPHYB1-RNAi新采收種子中NtABI3的表達(dá)量顯著提高，NtPHYB1-OE新采收種子中NtABI5的表達(dá)量顯著降低。在變溫下后熟，WT種子中NtNCED6和NtGA2ox2下降變緩，NtCYP707A1和 NtGA3ox2上升變緩;NtPHYB1-RNAi種子中NtNCED6下降變緩，而NtCYP707A1上升變緩;NtPHYB1-OE種子中NtNCED6下降變緩，而NtCYP707A1、NtGA3ox2、NtGA2ox2和NtGAI下降均加快。綜上所述，NtPHYB1能夠協(xié)同儲(chǔ)藏溫度影響ABA和GA的信號(hào)和代謝基因表達(dá)從而調(diào)控種子光休眠和后熟。

關(guān)鍵詞：光休眠;后熟;NtPHYB1;變溫;種子萌發(fā);植物激素

NtPHYB1 Interacts with Storage Temperature to Regulate Seed Photodormancy and After-ripening in Nicotiana tabacum L.

WANG Yao， DONG Shuai， ZHANG Min， LI Zhenhua*

（College of Agronomy， Guizhou University， Guiyang 550025， China）

Abstract： To reveal the molecular mechanism of seed photodormancy and after-ripening in tobacco， wild-type （WT）， NtPHYB1 over expression （NtPHYB1-OE） and deficient （NtPHYB1-RNAi） tobacco seeds were used in this study， in conducting after-ripening experiments in two environments with constant or natural temperature. The results showed that NtPHYB1-RNAi fresh seeds had a significant increase in photodormant level compared with WT fresh seeds; However， the photodormancy of NtPHYB1-OE fresh seeds did not show significant change. The after-ripening of WT and NtPHYB1-OE seeds was accelerated under variable temperature compared with under constant temperature storage， while that of NtPHYB1-RNAi seeds was not significantly changed. Compared with WT fresh seeds， the expression of NtABI3 in NtPHYB1-RNAi fresh seeds was significantly increased， while the expression of NtABI5 in NtPHYB1-OE fresh seeds was significantly decreased. In WT seeds， expression of NtNCED6 and NtGA2ox2 decreased slowly when after-ripening under variable temperature， while NtCYP707A1 and NtGA3ox2 were up-regulated slowly. In NtPHYB1-RNAi seeds， NtNCED6 expression decreased slowly then， while NtCYP707A1 expression increased slowly. In NtPHYB1-OE seeds， NtNCED6 expression decreased slowly then， while expression of NtCYP707A1， NtGA3ox2， NtGA2ox2 and NtGAI decreased faster. In conclusion， NtPHYB1 interacts with storage temperature to regulate photodormancy and after-ripening by regulating expressions of genes involved in ABA and GA signal and metabolism in tobacco seeds.

Keywords： photodormancy; after-ripening; NtPHYB1; variable temperature; seed germination; phytochrome

種子光休眠（photodormancy）是指具有生活力的種子在黑暗環(huán)境下暫時(shí)不能萌發(fā)的現(xiàn)象。至今，已經(jīng)在上千物種中發(fā)現(xiàn)種子光休眠，特別是小粒種子物種，種子光休眠較為普遍。在生產(chǎn)上，丸化有利于小粒種子播種，但丸化后，喜光性（photophil）種子易出現(xiàn)光休眠，嚴(yán)重影響出苗率。因此，研究種子光休眠和后熟的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于指導(dǎo)光敏感種子制種和播種均具有重要意義。

光照和后熟均具有解除種子休眠和促進(jìn)萌發(fā)

的作用。目前關(guān)于光解除種子休眠和促進(jìn)萌發(fā)的分子機(jī)制研究較為深入，它通過(guò)激發(fā)光敏色素（Phytochrome，PHY）信號(hào)通路解除種子休眠和促進(jìn)萌發(fā)[1-2]。早在1934年，F(xiàn)LINT[3]在萵苣中發(fā)現(xiàn)光調(diào)控種子休眠和萌發(fā)現(xiàn)象。1952年，BORTHWICK等[4]發(fā)現(xiàn)萵苣種子萌發(fā)受紅光和遠(yuǎn)紅光可逆轉(zhuǎn)換調(diào)控并發(fā)現(xiàn)PHY。90年代末，在萵苣種子中發(fā)現(xiàn)PHY調(diào)節(jié)赤霉素（GA）的合成[5]和脫落酸（Abscisic acid，ABA）的分解[6]，從而促進(jìn)喜光性種子萌發(fā)[7-8]。2012年，LEE等[9]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了PHYB和PHYA時(shí)空特異性調(diào)控ABA和GA代謝基因（GA3ox1，GA2ox2，NCED6，NCED9，GA3ox2CYP707A2）與信號(hào)基因（ABI3，ABI5，RGA）表達(dá)控制種子萌發(fā)?？臻g上PHYA和PHYB分別定位于胚和胚乳中，時(shí)間上胚的作用晚于胚乳[10]。2016年，JIANG等[11]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中PHYB不僅參與調(diào)控紅光/遠(yuǎn)紅光可逆轉(zhuǎn)換的種子萌發(fā)，而且調(diào)控種子初生休眠。2019年，MERAI等[12]發(fā)現(xiàn)光促進(jìn)需光性種子萌發(fā)和抑制厭光性種子萌發(fā)均需要PHY的參與;而且激素ABA和GA調(diào)控需光性種子、光中性種子和抑制厭光性種子萌發(fā)是保守的，均表現(xiàn)為ABA抑制而GA促進(jìn)萌發(fā)。

新采收的煙草種子普遍存在光休眠，在黑暗條件下，即使延長(zhǎng)培育時(shí)間，種子亦不能萌發(fā)。LEUBNER-METZGER等[13]發(fā)現(xiàn)后熟（After-ripening）有利于打破煙草種子光休眠，在自然條件下干燥儲(chǔ)藏6個(gè)月后，煙草種子將完成后熟，具備在黑暗下萌發(fā)的能力。適宜的含水量（7%～10%）加速煙草種子后熟，而含水量過(guò)高（>15%）或者過(guò)低（<7%）減緩種子后熟。宋碧清等[14]發(fā)現(xiàn)較高溫度下（25 ℃）下煙草種子后熟時(shí)間較低溫下（18℃）明顯縮短。然而，關(guān)于后熟解除種子光休眠的分子機(jī)理知之甚少。因此，本研究以野生型（WT）、NtPHYB1過(guò)表達(dá)（NtPHYB1-OE）和NtPHYB1 RNAi種子為材料，在變溫和恒溫2種環(huán)境下進(jìn)行儲(chǔ)藏，研究新采收和后熟種子萌發(fā)差異;在此基礎(chǔ)上，研究后熟過(guò)程種子對(duì)ABA和GA的敏感性變化及ABA和GA代謝和信號(hào)基因表達(dá)變化。研究結(jié)果將有助于深入理解后熟解除種子光休眠和促進(jìn)萌發(fā)的分子機(jī)理。

1? 材料與方法

1.1? 供試材料

煙草品種K326的WT、NtPHYB1-OE和NtPHYB1-RNAi種子由貴州省煙草科學(xué)研究院提供。NtPHYB1基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化和進(jìn)化分析詳見(jiàn)課題組已公開(kāi)發(fā)表的論文[15]。

1.2? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以K326的WT、NtPHYB1-OE和NtPHYB1- RNAi T3代種子為供試材料，分析基因型和后熟處理（包括后熟溫度和后熟時(shí)間）對(duì)種子光休眠的影響（表1）。5種處理分別為新采收種子（FS），在變溫條件下（日均溫15 ℃，日較差6 ℃）后熟1（NT1）和2個(gè)月（NT2）的種子，和在恒溫（25 ℃）條件下后熟1（CT1）和2個(gè)月（CT2）的種子，基因型×后熟共計(jì)15個(gè)處理。

1.3? 試驗(yàn)方法

1.3.1? 種子萌發(fā)試驗(yàn)? 采用本課題組已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表的方法[16]。將經(jīng)0.5% CuSO4消毒后的100粒種子均勻點(diǎn)播在0.8%的瓊脂發(fā)芽床表面，將培養(yǎng)皿置于25 ℃全天黑暗的人工氣候箱內(nèi)萌發(fā)。重復(fù)3次。從第2天開(kāi)始每隔24 h記錄一次種子萌發(fā)數(shù)（以種子露白計(jì)為萌發(fā)），連續(xù)記錄至第7天為止。計(jì)算萌發(fā)勢(shì)（第4天）、萌發(fā)率（第7天）和萌發(fā)指數(shù)。

1.3.2? 激素敏感性試驗(yàn)? 稱(chēng)取一定量的GA3、ABA、PAC（多效唑，GA3合成抑制劑）、FLU（氟啶酮，ABA合成抑制劑）粉末用少量無(wú)水乙醇溶解后，分別加入蒸餾水配制成10-6、10-5、10-4、10-3 mol/L的GA3溶液;10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L的ABA溶液;5×10-6、5×10-5 mol/L的PAC溶液;5×10-6、5×10-5 mol/L的FLU溶液。在培養(yǎng)皿內(nèi)分別加入1 mL上述濃度的溶液，然后加入0.8%瓊脂滅菌液，制作發(fā)芽床。然后用1.3.1的方法測(cè)定種子在不同發(fā)芽床上的發(fā)芽能力。

1.3.3? ABA和GA代謝和信號(hào)基因表達(dá)測(cè)定? RT-PCR采用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表的方法[16]。分別取0.1 g不同基因型FS、NT1、CT1、NT2、CT2、的煙草種子裝入1.5 mL的離心管，迅速放入液氮中冷凍3 min，再放入?80 ℃超低溫冰箱備用。采用TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，中國(guó)）提取煙草種子RNA。采用TaKaRaPrimeScript? II 1st Strand

cDNA Synthesis 試劑盒（寶生物工程有限公司，中國(guó)）進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。采用TaKaRaTB Green? Premix Ex Taq?（TliRNaseH Plus）熒光定量試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：10 ?L TBGreen Premix Ex TaqII（2X），0.4 ?L ROX Reference Dye（50X），2 ?L稀釋為40 ng/?L的cDNA，上下游引物各0.8 ?L（表2），用水補(bǔ)足至20 ?L。PCR反應(yīng)的條件為：95 ℃預(yù)變性0.5 min，然后95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用StepOnePlusReal-Time PCR儀（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國(guó)）進(jìn)行基因的擴(kuò)增。依據(jù)2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平[17]。目標(biāo)基因及其引物見(jiàn)表2。

1.3.4? 統(tǒng)計(jì)分析? 用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。運(yùn)用SPSS Statistics 25對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重（圖基HSDa）比較;采用GLM模型（General Linear Model， GLM）中的全因子模型及Ⅲ型平方和評(píng)價(jià)基因型、后熟溫度、后熟期及其互作對(duì)種子萌發(fā)的影響。最后采用Origin 8.5作圖。

2? 結(jié)? 果

2.1? NtPHYB1和溫度對(duì)種子后熟的影響

煙草種子萌發(fā)情況見(jiàn)表3。3種基因型新采收種子萌發(fā)勢(shì)、萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)均存在一定差異：NtPHYB1-RNAi種子萌發(fā)勢(shì)、萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)均顯著低于WT種子;NTPHYB1-OE種子萌發(fā)勢(shì)和萌發(fā)指數(shù)與WT種子無(wú)顯著差異，但萌發(fā)率顯著低于WT種子?？梢?jiàn)NtPHYB1-RNAi種子光休眠水平加深，而NtPHYB1-OE種子光休眠未顯著變淺。方差分析結(jié)果（表4）也表明，基因型顯著影響了種子光休眠與后熟。

與新采收種子相比，3種基因型種子恒溫或變溫后熟1月或2月，其種子萌發(fā)勢(shì)、萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)均顯著提高;且后熟2月的種子萌發(fā)勢(shì)和萌發(fā)指數(shù)均高于或顯著高于后熟1個(gè)月的處理，而萌發(fā)率沒(méi)有顯著差異。后熟1月時(shí)，經(jīng)恒溫后熟處理的WT和NTPHYB1-OE種子的萌發(fā)勢(shì)顯著低于變溫后熟處理;后熟2月時(shí)，恒溫后熟處理的WT種子的萌發(fā)勢(shì)依然顯著低于變溫后熟處理。

由方差分析結(jié)果（表4）可知，后熟時(shí)間和后熟溫度均顯著影響種子萌發(fā)，后熟時(shí)間延長(zhǎng)更有利于打破種子光休眠，變溫儲(chǔ)藏種子后熟普遍快于常溫儲(chǔ)藏。基因型、后熟溫度和后熟時(shí)間之間存在不同程度的互作，影響種子萌發(fā)勢(shì)、萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)。

2.2? 煙草種子后熟過(guò)程中GA和ABA敏感性變化

由圖1可知，WT、NtPHYB1-OE和NtPHYB1-RNAi等3種基因型新采收種子萌發(fā)率均較低，10-6～10-3 mol/L的GA3可促進(jìn)種子萌發(fā)。變溫或恒溫后熟處理1或2月，種子萌發(fā)率均顯著提高，幾乎達(dá)到最大值，GA3的促進(jìn)作用不再明顯。

由圖2-3可知，PAC和ABA具有抑制新采收煙草種子萌發(fā)的作用，且隨著濃度增加，二者對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用顯著增強(qiáng)。后熟1個(gè)月，煙草種子萌發(fā)率顯著提高，二者對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用依然較強(qiáng)且隨濃度增加而增強(qiáng);后熟2個(gè)月，抑制作用明顯減弱，但高濃度處理仍有較強(qiáng)抑制作用。3種基因型種子和2種后熟溫度處理基本表現(xiàn)為相似規(guī)律。

由圖4可知，5×10-5 mol/L FLU具有抑制WT和NtPHYB1-OE新采收種子萌發(fā)的作用，而對(duì)

NtPHYB1-RNAi種子的抑制作用不顯著。隨著后熟期延長(zhǎng)，F(xiàn)LU對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用在逐漸減弱。3種基因型種子和2種后熟溫度處理基本表現(xiàn)為相似規(guī)律。

上述結(jié)果說(shuō)明不同基因型種子后熟過(guò)程中對(duì)ABA和GA敏感性變化是相似的，新采收種子對(duì)GA3和ABA均較為敏感，它們分別促進(jìn)和抑制種子萌發(fā)。隨著后熟時(shí)間延長(zhǎng)，外源GA3促進(jìn)種子萌發(fā)和外源ABA抑制種子萌發(fā)的作用在逐漸減弱。

2.3? 煙草種子后熟過(guò)程中ABA和GA代謝和信號(hào)基因表達(dá)變化

由圖5可知，NtPHYB1-RNAi新采收種子中ABA合成關(guān)鍵基因NtNCED6，ABA分解關(guān)鍵基因NtCYP707A1和ABA信號(hào)關(guān)鍵調(diào)控基因NtABI3表達(dá)量顯著高于WT種子;NtPHYB1-OE新采收種子中NtNCED6、NtCYP707A1和NtABI3表達(dá)量也顯著高于WT種子，而NtABI5表達(dá)量則顯著低于WT種子。上述結(jié)果說(shuō)明與野生型新采收種子相比，NtPHYB1-RNAi新采收種子中ABA合成和分解代謝水平提高，ABA信號(hào)增強(qiáng);而NtPHYB1-OE新采收種子中僅ABA合成和分解代謝水平提高。

隨著后熟的進(jìn)行，WT種子中NtNCED6和NtABI3，NtABI5表達(dá)量逐漸或波動(dòng)下降，NtCYP707A1表達(dá)量逐漸升高;NtPHYB1-RNAi種子中NtNCED6、NtCYP707A1和NtABI3，NtABI5表達(dá)變化與WT種子基本一致，說(shuō)明WT與NtPHYB1-RNAi煙草種子后熟過(guò)程中ABA合成代謝水平下降，分解代謝水平提高，信號(hào)也減弱，ABA對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用逐漸降低。而NtPHYB1-OE種子中NtNCED6和NtABI3表達(dá)變化與WT種子基本一致，但NtCYP707A1和NtABI5表達(dá)變化與WT種子相反，顯示NtPHYB1-OE煙草種子后熟過(guò)程中ABA合成和分解代謝水平均降低。

與恒溫后熟相比，變溫后熟時(shí)WT種子中NtNCED6下降變緩，而NtCYP707A1上升變緩，NtPHYB1-RNAi種子與WT種子變化規(guī)律基本一致，說(shuō)明在變溫后熟過(guò)程中NtPHYB1-RNAi與WT種子中ABA合成代謝水平下降，分解代謝水平上升，但與恒溫后熟相比，變化減緩。NtPHYB1-OE種子中NtNCED6下降變緩，而NtCYP707A1下降加快，顯示在變溫后熟過(guò)程中NtPHYB1-OE煙草種子ABA合成代謝水平下降，但較恒溫后熟減緩;ABA分解代謝水平下降，且較恒溫后熟加快。

由圖6可知，NtPHYB1-RNAi新采收種子中GA合成關(guān)鍵基因NtGA3ox2，GA信號(hào)關(guān)鍵基因NtGAI和細(xì)胞壁松弛關(guān)鍵基因NtXTH2的表達(dá)量顯著高于WT新采收種子，但增加幅度較低;而NtPHYB1-OE新采收種子中NtGA3ox2、NtGA2ox2、NtGAI和NtXTH2的表達(dá)量均較WT種子顯著增加數(shù)倍。顯示與野生型種子相比，NtPHYB1-RNAi新采收種子中GA代謝和信號(hào)變化較小;而NtPHYB1-OE新采收種子GA代謝和信號(hào)變化較大。

后熟過(guò)程中，WT種子中NtGA3ox2表達(dá)量顯著增加，NtGA2ox2表達(dá)量顯著降低，顯示煙草種子后熟過(guò)程中GA合成代謝水平提高，分解代謝水平降低，GA對(duì)種子萌發(fā)的促進(jìn)作用逐漸升高。與WT種子中變化一致，NtPHYB1-RNAi和NtPHYB1-OE種子中NtGA2ox2的表達(dá)量隨著后熟逐漸或波動(dòng)下降，顯示后熟過(guò)程中不同基因型煙草種子GA分解代謝水平均在降低。

與恒溫后熟相比，在變溫下WT種子中NtGA3ox2上升減緩，而NtGA2ox2下降減緩，顯示變溫后熟過(guò)程中WT種子中GA合成代謝水平提高，分解代謝水平降低，但與恒溫后熟相比，變化減緩。恒溫后熟NtPHYB1-RNAi種子中NtGA3ox2表達(dá)量升高，而變溫后熟其表達(dá)量降低;顯示NtPHYB1-RNAi種子在恒溫后熟時(shí)GA合成代謝水平提高而變溫后熟時(shí)GA合成代謝水平降低。在變溫下NtPHYB1-OE種子中NtGA3ox2、NtGA2ox2和NtGAI下降加快，顯示變溫后熟過(guò)程中NtPHYB1-OE煙草種子GA合成代謝、分解代謝和信號(hào)水平均較恒溫后熟顯著提高。

3? 討? 論

新采收的煙草種子普遍存在光休眠，在黑暗條件下，即使延長(zhǎng)培育時(shí)間，種子亦不能萌發(fā)。LEUBNER-METZGER等[13]研究表明室溫儲(chǔ)藏6個(gè)月后，種子完成后熟，具備在黑暗條件下萌發(fā)的能力。與前人研究結(jié)果一致，本研究表明3種基因型的煙草新采收種子均呈現(xiàn)光休眠，室溫儲(chǔ)藏后種子完成后熟。與前人研究結(jié)果不同之處在于后熟期明顯縮短為2個(gè)月，這種差異可能是由于儲(chǔ)藏環(huán)境不同所致，宋碧清等[14]發(fā)現(xiàn)適溫（25 ℃）下比相對(duì)低溫條件下（18 ℃）下利于種子后熟。說(shuō)明在一定范圍內(nèi)高溫更利于種子后熟，而本研究卻發(fā)現(xiàn)日均溫15 ℃自然儲(chǔ)藏較25 ℃恒溫儲(chǔ)藏更利于種子后熟，這可能是源于自然儲(chǔ)藏過(guò)程中溫度在不斷變化，而變溫較恒溫更利于種子后熟，但自然儲(chǔ)藏過(guò)程中其他多種因素亦影響試驗(yàn)結(jié)果，如若得出確切結(jié)果還值得今后進(jìn)一步研究。

后熟解除種子光休眠和促進(jìn)萌發(fā)的機(jī)理是較為復(fù)雜的，目前學(xué)界依然未得出確切結(jié)論。LEUBNER-METZGER等[18-19]研究表明后熟促進(jìn)煙草種子光休眠解除可能是基于以下幾個(gè)方面的作用：（1）拓寬了種子萌發(fā)所需求溫度范圍;（2）降低種子中ABA水平和其對(duì)ABA的敏感性，提升種子對(duì)GA的敏感性或者促進(jìn)種子萌發(fā)時(shí)失去對(duì)GA的需求;（3）解除種子萌發(fā)對(duì)光的需求;（4）增加在光下不能萌發(fā)種子對(duì)光的敏感性;（5）促進(jìn)種皮和胚乳破裂，加速種子萌發(fā)。本研究也發(fā)現(xiàn)新采收煙草種子萌發(fā)需要光的參與，而后熟種子萌發(fā)并不依賴(lài)于光的存在;新采收煙草種子對(duì)ABA和GA3均較為敏感，隨著后熟種子對(duì)ABA的敏感性在降低，而對(duì)GA3的敏感性在升高，這與前人研究結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)后熟過(guò)程中的ABA和GA3代謝基因和信號(hào)基因發(fā)生變化，從而影響種子光休眠水平和后熟期。近來(lái)。王堯等[16]研究也表明在種子儲(chǔ)藏過(guò)程ABA代謝和信號(hào)被抑制，而GA合成和信號(hào)被激發(fā)，從而促進(jìn)種子后熟。

近年來(lái)，光調(diào)控種子休眠與萌發(fā)的分子機(jī)制已經(jīng)取得顯著進(jìn)展，光、ABA和GA調(diào)控?cái)M南芥種子休眠與萌發(fā)存在交互作用[1-2]。PHY感知光信號(hào)從而影響下游的ABA和GA信號(hào)和代謝基因表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控種子休眠和萌發(fā)[11， 20]。而關(guān)于光敏色素是否參與種子光休眠和后熟調(diào)控卻知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn)與WT種子相比，NtPHYB1-RNAi種子光休眠水平顯著加深，說(shuō)明NtPHYB1可能負(fù)調(diào)控種子光休眠。然而，NtPHYB1-OE種子光休眠卻未顯著變淺，這與預(yù)期結(jié)果不一致，可能是因?yàn)榉N子休眠和萌發(fā)存在不同的調(diào)控機(jī)制，依據(jù)萌發(fā)率判斷種子光休眠水平和后熟期存在一定局限性。

ARANA等[21]研究表明變溫較常溫更利于擬南芥種子萌發(fā)，在變溫下PHYB調(diào)節(jié)ABA和GA代謝和信號(hào)基因（GA3ox1、NCED9、CYP707A2等）及細(xì)胞壁松弛基因（Expansion10）的表達(dá)，促進(jìn)GA/ABA比值提高和細(xì)胞壁松弛，進(jìn)而促進(jìn)種子萌發(fā)。而本研究發(fā)現(xiàn)NtPHYB1協(xié)同變溫通過(guò)改變種子ABA信號(hào)調(diào)控?zé)煵莘N子光休眠和后熟。如：與恒溫后熟相比，變溫后熟過(guò)程中，不同基因型種子中ABA和GA3相關(guān)基因表達(dá)量上升或下降的趨勢(shì)有的加速，有的減緩，呈現(xiàn)出不同的變化。上述結(jié)果說(shuō)明NtPHYB1能夠協(xié)同變溫調(diào)控種子休眠、后熟與萌發(fā)，其調(diào)控機(jī)制值得今后研究。

4? 結(jié)? 論

新采收的煙草種子存在光休眠，在黑暗條件下萌發(fā)困難，而后熟有利于解除種子光休眠，促進(jìn)種子在暗下萌發(fā)。與WT種子相比，NtPHYB1-RNAi種子光休眠水平加深，后熟期延長(zhǎng)。與恒溫相比，變溫加速種子后熟。煙草的基因型與溫度協(xié)同影響種子后熟，變溫下WT和NTPHYB1-OE種子后熟加快，而NTPHYB1-RNAi種子變化不顯著。植物激素水平和信號(hào)影響種子光休眠和后熟，新采收種子對(duì)GA和ABA較為敏感，隨著后熟時(shí)間延長(zhǎng)，外源ABA抑制和GA3促進(jìn)種子萌發(fā)的作用在逐漸減弱;NtPHYB1協(xié)同變溫通過(guò)改變ABA和GA代謝和信號(hào)水平調(diào)控?zé)煵莘N子光休眠和后熟。

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