新疆部分地區(qū)牛環(huán)形泰勒蟲優(yōu)勢(shì)種媒介蜱的分子生物學(xué)鑒定及種群結(jié)構(gòu)分析

謝小婉，朱馬別克·胡斯曼，加那爾·努和買提，木哈里·吾汗，王志斌

（達(dá)坂城區(qū)柴窩堡片區(qū)管理委員會(huì)獸醫(yī)站，新疆 烏魯木齊 830052）

牛環(huán)形泰勒蟲病是環(huán)形泰勒蟲引起的一種蜱傳血液原蟲病。該病在南歐、中亞和中東等地區(qū)均有不同程度的流行。我國在西北、東北、華北地區(qū)均對(duì)該病的流行情況進(jìn)行過調(diào)查[1-2]，結(jié)果顯示，吐魯番為該病最為嚴(yán)重的疫區(qū)之一。雖然每年都會(huì)定期針對(duì)該病進(jìn)行疫苗接種，但該病的感染率和發(fā)病率仍呈上升趨勢(shì)，其中吐魯番市發(fā)病率高達(dá)40%[3]，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。該病的主要傳播媒介是璃眼蜱屬的璃眼蜱[4]。調(diào)查顯示，媒介蜱的區(qū)系分布、病原攜帶率和遺傳多樣性是蜱傳疾病的主要影響因素。因此，掌握璃眼蜱的區(qū)系分布、群落結(jié)構(gòu)和物種組成，對(duì)媒介蜱的防控以及蜱傳疾病的防控具有參考意義。本試驗(yàn)通過體視顯微鏡對(duì)8個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)所采集的璃眼蜱（N=9 141）進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，分析區(qū)系分布特點(diǎn)、種類組成及相對(duì)優(yōu)勢(shì)度，明確璃眼蜱種群分布和活動(dòng)范圍的變化，對(duì)該地區(qū)媒介璃眼蜱及蜱傳牛環(huán)形泰勒蟲病的流行和流行區(qū)的變化提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2016～2017年是蜱類活動(dòng)的高峰期。在吐魯番和阿勒泰地區(qū)的8 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，隨機(jī)抽取56 頭牛以及璃眼蜱9 141 枚。按照文獻(xiàn)記載采集牛體表的全部硬蜱[5-6]，記錄采集時(shí)間、地點(diǎn)等[7]。

1.2 試劑與儀器

ITS2璃眼蜱引物（由上海生工生物工程有限公司合成）；樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒和快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；高純度質(zhì)粒小提取試劑盒分別購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA的提取

璃眼蜱屬特異性引物[8]序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

50 μL 反應(yīng)體系：2×EcoTaq PCR SuperMix25 μL，10 μmol/L 的上游引物、下游引物各1 μL，璃眼蜱DNA 3 μL，雙蒸水加至50 μL。

PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查、PCR擴(kuò)增得到結(jié)果。目的片段純化、克隆，對(duì)所獲得的菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行同源性分析。

1.3.2 璃眼蜱群落組成參數(shù)的計(jì)算[9-16]

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 媒介蜱分子生物學(xué)鑒定結(jié)果（見圖1）

圖1 璃眼蜱ITS2基因序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR product of Hyalomma ITS2 gene

由圖1 可知，以璃眼蜱屬ITS2基因序列，采用PCR 的方法擴(kuò)增璃眼蜱DNA，于490 bp擴(kuò)增出目的條帶。

2.1.2 重組質(zhì)粒Peasy-T1-ITS-2的序列對(duì)比結(jié)果

測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST 檢索，顯示本次實(shí)驗(yàn)室獲得目的片區(qū)與GenBank 中小亞璃眼蜱、殘緣璃眼蜱、嗜駝璃眼蜱和亞洲璃眼蜱核苷酸相似性在99%～100%之間，為本研究的目的片段。經(jīng)PCR鑒定：小亞璃眼蜱3 750枚，殘緣璃眼蜱2 468枚，亞洲璃眼蜱914枚，嗜駝璃眼蜱2 009枚。

2.2 新疆部分地區(qū)璃眼蜱的群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 新疆部分地區(qū)璃眼蜱相對(duì)優(yōu)勢(shì)度、染蜱率和蜱指數(shù)（見表2）

表2 采集璃眼蜱相對(duì)優(yōu)勢(shì)度、蜱指數(shù)和染蜱率Tab.2 Relative dominance,infested indexes and infested ratesof Hyalomma

由表2可知，試驗(yàn)所抽檢的8個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)中的56頭牛，共計(jì)采集媒介璃眼蜱9 141 枚。其中，小亞璃眼蜱相對(duì)優(yōu)勢(shì)度、染蜱率及蜱指數(shù)均為最高分別為41.02%、100%、66.96；亞洲璃眼蜱的相對(duì)優(yōu)勢(shì)度最低為10.00%；染蜱率最低的是嗜駝璃眼蜱，為30.00%；亞洲璃眼蜱蜱指數(shù)最低，為16.32。

2.2.2 新疆部分地區(qū)牛體表寄生璃眼蜱群落結(jié)構(gòu)參數(shù)（見表3）

由表3 可知，采集到牛體表的璃眼蜱的物種豐富度為4，多樣性指數(shù)為1.282 3，物種均勻度指數(shù)為0.925 0，優(yōu)勢(shì)度指數(shù)為0.299 4。

表3 寄生璃眼蜱種群、群落組成參數(shù)Tab.3 Community structure parameters of parasitic Hyalomma

2.2.3 新疆部分地區(qū)璃眼蜱的區(qū)系分布（見表4）

由表4 可知，4 種璃眼蜱中，小亞璃眼蜱蜱指數(shù)最高，為625.00，占總體的41.02%（625.00/1 523.51），亞洲璃眼蜱蜱指數(shù)最小為10.00%（152.34/1 523.51）。由采集地點(diǎn)來看，吐魯番市（包括夏鄉(xiāng)、吐魯番市、伊拉湖鄉(xiāng)、博斯坦鄉(xiāng)4 個(gè)地區(qū)）蜱總指數(shù)為937.67，占蜱總數(shù)指數(shù)的61.55%（937.67/1 523.51），其中夏鄉(xiāng)的蜱總指數(shù)最高，為19.84（302.34/1 523.51）；阿勒泰地區(qū)（包括富蘊(yùn)縣、清河縣、哈巴河縣和福?？h四個(gè)地區(qū)）蜱總指數(shù)為502，占總數(shù)的32.95%（502.00/1 523.51），其中青河縣的蜱指數(shù)較低，占蜱總指數(shù)的 6.12%（93.17/1 523.51）。

表4 不同生境寄生媒介璃眼蜱的蜱指數(shù)Tab.4 Infested indexes of parasitic Hyalomma in different regions

2.2.4 新疆部分地區(qū)牛體表寄生璃眼蜱群落結(jié)構(gòu)參數(shù)（見表5）

由表5可知，伊拉湖鄉(xiāng)種類豐富度為2，較其他7個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)低；富蘊(yùn)縣多樣性指數(shù)最高，為1.171 0；伊拉湖鄉(xiāng)物種均勻度指數(shù)最高，為0.966 4。清河縣多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)均最低，分別為0.5649、0.4075；但優(yōu)勢(shì)度指數(shù)最高，為0.7089。

表5 不同生境璃眼蜱的群落結(jié)構(gòu)參數(shù)數(shù)據(jù)Tab.5 Community structure parameters of parasitic Hyalomma in different regions,Xinjiang

3 討論

璃眼蜱的鑒定主要依據(jù)形態(tài)學(xué)[17-18]。分子生物學(xué)具有操作簡單、準(zhǔn)確率高、適用范圍廣等優(yōu)勢(shì)，不僅能鑒定形態(tài)較為完整的媒介蜱外，還可以精確鑒定殘缺、飽血和不成熟的媒介蜱[18]，被廣泛運(yùn)用于媒介蜱的鑒定。ITS2基因因進(jìn)化速率快且GenBank 數(shù)據(jù)量豐富，被用于媒介蜱屬內(nèi)、種間或種內(nèi)的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究[6,19]。文章通過ITS2基因檢測(cè)采集的9 141璃眼蜱，共鑒定出4種璃眼蜱：小亞璃眼蜱、亞洲璃眼蜱、殘緣璃眼蜱和嗜駝璃眼蜱，分別為3 750、914、2 468、2 009枚。1959年，肖成恩[20]首次報(bào)道新疆地區(qū)媒介硬蜱分類情況。1963年和1977年，于心等[5，21]詳細(xì)地記載了新疆媒介蜱的種類、形態(tài)特征、生物學(xué)特性、地理分布、攜帶病原情況以及媒介蜱的防治，均為媒介蜱及蜱傳疫病提供詳細(xì)的參考資料。但隨著全球氣候變暖，璃眼蜱的種群分布有所變化[22]。王冰潔[23]從綿羊和山羊體表獲得了寄生于牛、馬、駱駝的殘緣璃眼蜱，在馬體表采集到了僅寄生于駱駝的嗜駝璃眼蜱。朱玉濤[24]在布爾津縣、福?？h首次采集到刻點(diǎn)血蜱和圖蘭扇頭蜱，在富蘊(yùn)縣首次采集到銀盾革蜱和森林革蜱，在碩縣首次采集到銀盾革蜱和草原革蜱。因此，研究不同生境、不同宿主體表寄生媒介蜱的種群結(jié)構(gòu)、區(qū)系分布十分必要。通過分子生物學(xué)結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)吐魯番和阿勒泰地區(qū)牛體表媒介蜱進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，小亞璃眼蜱蜱指數(shù)、染蜱率、相對(duì)優(yōu)勢(shì)度均最高，其相對(duì)優(yōu)勢(shì)度高達(dá)41.02%，多樣性指數(shù)為1.282 3，物種均勻度指數(shù)為0.925 0，優(yōu)勢(shì)度指數(shù)為0.299 4。吐魯番市多樣性指數(shù)和物種均勻度指數(shù)均較高，但是優(yōu)勢(shì)度指數(shù)較低，優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和多樣性指數(shù)呈反比的關(guān)系。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，吐魯番和阿勒泰地區(qū)寄生媒介璃眼蜱無差異，豐富度均為4，分析與牛的調(diào)出、調(diào)入有直接關(guān)系，要做好調(diào)出、調(diào)入牛檢疫工作，檢測(cè)牲畜時(shí)也要做好媒介蜱檢測(cè)。此外，吐魯番市氣候類型屬于大陸性暖溫帶荒漠氣候，阿勒泰地區(qū)屬于的溫帶大陸性寒冷氣候表現(xiàn)均為降水量少，蒸發(fā)量大；吐魯番坎兒井及大范圍種植葡萄樹，而阿勒泰擁有遼闊的草原；獨(dú)特的氣候條件和復(fù)雜的地貌環(huán)境和土壤結(jié)構(gòu)，為媒介璃眼蜱的滋生提供可行、適宜的生存條件。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采集試驗(yàn)點(diǎn)的牛體表寄生的媒介璃眼蜱與以往記載媒介蜱的分布基本相符，通過對(duì)媒介蜱體表璃眼蜱群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為該區(qū)的媒介璃眼蜱的分類及其蜱傳疾病防治提供數(shù)據(jù)參考。