太子參須提取物對小鼠免疫功能的影響

張炎達，潘慧青，衣偉萌，王 新，趙 齊，馬玉芳*

（1.福建貝迪藥業(yè)有限公司寧德市企業(yè)技術(shù)中心，福建 寧德 355300；2.中西獸醫(yī)結(jié)合與動物保健福建省高等學(xué)校重點實驗室，福建 福州 350002；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021）

太子參為石竹科植物孩兒參的干燥塊根，主產(chǎn)于福建柘榮等地[1]。太子參富含多糖、皂苷、環(huán)肽等組分[2]，其藥性平和，具有益氣健脾、潤肺、生津、保健之效。臨床證明，太子參具有抗氧化、抗皮炎、增強免疫力及改善肺功能等作用[3-5]。研究表明，中藥對動物機體免疫組織器官的發(fā)育有積極作用，有利于提高動物的免疫力[6]。補益中藥太子參目前已在畜禽和水產(chǎn)中多有研究和應(yīng)用[7-8]，且太子參須在動物養(yǎng)殖中的研究也相繼報道，如太子參須可增強仔豬免疫[9]、抑制鴨H9N2亞型流感病毒在MDCK細胞上的體外增殖等[7]。太子參須為太子參的側(cè)須和尾根，占太子參質(zhì)量的10%～15%，且藥效組分相同[10]。研究發(fā)現(xiàn)，太子參須提取物可改善免疫抑制小鼠的血清免疫指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)[11]。陳小英等[12]報道，太子參須多糖粗提物對隱球菌感染模型小鼠的免疫功能具有調(diào)理作用。本文通過太子參須提取物低、中、高劑量灌服健康小鼠，探究其對健康小鼠免疫功能的影響，為太子參須中藥資源在畜牧業(yè)中的開發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 太子參須提取物

太子參須提取物（RPFRE）由福建貝迪藥業(yè)有限公司寧德市企業(yè)技術(shù)中心提供。

1.1.2 試驗動物

試驗動物為購自福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心的清潔級KM小鼠，雄性，體重（20±2）g。

1.1.3 試劑與儀器

刀豆蛋白（ConA）、胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、脂多糖（LPS）、Hank′s 平衡鹽溶液（HBSS）、碳酸鈉、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、印度墨汁。

X-22R 臺式高速冷凍離心機、SE202F 型電子天平、V-1200可見分光光度計等。

1.2 試驗設(shè)計

清潔級雄性KM小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，稱量體質(zhì)量，隨機分為4 組，空白對照組（CK）、RPFRE 低劑量組、RPFRE中劑量和RPFRE高劑量組，每組20只。CK組小鼠灌胃蒸餾水，試驗組小鼠均灌服RPFRE，連續(xù)14 d。試驗設(shè)計見表1。日常給予充足的水和食物，自由采食。各組小鼠于第15 d均隨機分配，其中5只用于碳粒廓清法測定試驗小鼠吞噬功能，5 只用于MTT 法測定試驗小鼠脾T、B淋巴細胞增值。

表1 試驗設(shè)計Tab.1 Experimental design

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 體質(zhì)量

小鼠購回適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后，稱體質(zhì)量為初重。第15 d時再次稱量小鼠體質(zhì)量為末重，記錄數(shù)值。

1.3.2 免疫器官指數(shù)

試驗第15 d，稱量小鼠的體重后，使用頸椎脫臼法處死小鼠，稱量小鼠的脾臟、胸腺和肝臟，根據(jù)文獻[13]計算方法計算正常小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

1.3.3 吞噬功能

試驗小鼠尾靜脈注射印度墨汁（0.1 mL/10 g），分別于注射后第2、10 min 眼底靜脈叢取血，加入碳酸鈉溶液中，最好測定吸光度（OD值），根據(jù)文獻[13]試驗與計算吞噬指數(shù)α的方法計算獲得α值。

1.3.4 小鼠脾臟T、B淋巴細胞刺激指數(shù)

試驗組各取5只小鼠，用頸椎脫臼法處死，無菌取脾。詳細試驗方法和步驟參考文獻[13]，制備的樣本材料供脾細胞增殖備用。

采用96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL 上述脾細胞懸液，空白孔和試驗孔添加分別參照文獻[13]，每只小鼠脾淋巴細胞設(shè)4復(fù)孔。置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h，每孔分別添加50μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩5 min，570 nm 波長測定各孔吸光度值。參考文獻[13]計算T、B淋巴細胞刺激指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25 軟件進行單因素方差分析（ANOVA），采用LSD 法進行多重比較分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05 表示差異顯著。采用組間均聯(lián)法進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPFRE對小鼠體質(zhì)量的影響（見表2）

由表2 可知，RPFRE 各劑量組較CK 均可提高小鼠體質(zhì)量，且臨床上未見不良作用。RPFRE低劑量組小鼠體質(zhì)量較空白對照組顯著提高（P<0.05）。

表2 RPFRE對小鼠體質(zhì)量的影響Tab.2 Effect of RPFRE on the body weight of mice 單位：g

2.2 RPFRE對小鼠免疫器官指數(shù)的影響（見圖1）

由圖1（a）可知，RPFRE低劑量組小鼠脾臟指數(shù)顯著高于空白對照組（P<0.05）；由圖1（b）可知，RPFRE 高劑量組小鼠胸腺指數(shù)顯著高于空白對照組（P<0.05）。研究表明，RPFRE能夠促進小鼠免疫器官發(fā)育。

圖1 RPFRE對小鼠免疫器官指數(shù)的影響Fig.1 Effect of RPFRE on the immune organ index of mice

2.3 RPFRE對小鼠巨噬細胞吞噬指數(shù)的影響（見圖2）

由圖2 可知，與空白對照組相比，RPFRE 高劑量組可顯著提高小鼠吞噬指數(shù)α值（P<0.05）。

圖2 RPFRE對小鼠巨噬細胞吞噬指數(shù)的影響Fig.2 Effect of RPFRE on the phagocytic index of mouse macrophages

2.4 RPFRE 對小鼠T、B 淋巴細胞刺激指數(shù)的影響（見圖3）

由圖3（a）可知，與空白對照組相比，RPFRE 中劑量組小鼠的T淋巴細胞刺激指數(shù)顯著升高（P<0.05）；由圖3（b）可知，RPFRE低、中、高劑量組小鼠B淋巴細胞刺激指數(shù)影響均不顯著（P>0.05）。研究表明，RPFRE對小鼠的T、B淋巴細胞有一定的正向作用，其中對T淋巴細胞的影響更為顯著。

圖3 RPFRE對小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響Fig.3 Effect of RPFRE on the proliferation of mouse T and B lymphocytes

2.5 RPFRE對小鼠免疫功能的聚類分析（見圖4）

圖4 RPFRE對小鼠免疫指標(biāo)的聚類分析Fig.4 Cluster analysis of RPFRE on immune indexes of mice

藥物臨床試驗評價中針對檢測單一指標(biāo)的結(jié)果進行評價藥物作用具有一定的缺陷性和不準(zhǔn)確性。在本研究中，通過對RPFRE不同劑量組影響小鼠5項生化指標(biāo)進行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，實現(xiàn)與輸出分析得到綜合指標(biāo)聚類分析結(jié)果，以期減少單一或某個指標(biāo)評價結(jié)果的誤差性，實現(xiàn)各監(jiān)測指標(biāo)分析結(jié)果的整體性和合理性。

由圖4可知，當(dāng)相近系數(shù)ε=5時，RPFRE不同劑量試驗組對小鼠免疫功能5 項指標(biāo)的綜合聚類評價分為3 類，即Ⅰ：RPFRE（0.1 g/kg）、RPFRE（0.2 g/kg），Ⅱ：RPFRE（0.4 g/kg），Ⅲ：RPFRE（0 g/kg）；當(dāng)相近系數(shù)ε=10時，具體結(jié)果同ε=5 時；當(dāng)相近系數(shù)ε≥15 時，綜合聚類評價分為2 類。Ⅰ：RPFRE（0.1 g/kg）、RPFRE（0.2 g/kg）、RPFRE（0.4 g/kg），Ⅱ：RPFRE（0 g/kg）。正常小鼠5項生化指標(biāo)綜合聚類分析表明，RPFRE能夠改善正常小鼠免疫功能的生理生化指標(biāo)，具有一定的免疫增強作用，其中RPFRE低、中劑量的作用較為明顯。

3 討論

太子參須為太子參的側(cè)須和尾根，約占太子參質(zhì)量的10%～15%，且藥效組分與太子參相同[10]。本試驗中，RPFRE 各劑量組較CK 均可提高小鼠體質(zhì)量。RPFRE 低劑量組小鼠體質(zhì)量顯著提高，且臨床上未見不良作用。前期Meta分析表明，太子參提取物在細胞水平上具有良好的安全性，RPFRE 在一定劑量范圍內(nèi)為安全的，這也符合補益中藥的特點。同時，RPFRE灌服小鼠后對其脾臟和胸腺指數(shù)均有提高。脾臟和胸腺是動物機體主要的免疫器官，參與機體的細胞免疫和體液免疫，脾臟可分化大量T、B淋巴細胞參與免疫，是重要的外周免疫器官。因此，動物機體的免疫器官發(fā)育的狀況直接影響其免疫力的高低[14]。另外，RPFRE 各劑量組均可提升小鼠T、B 細胞刺激指數(shù)。RPFRE 中劑量組小鼠T 淋巴細胞數(shù)量顯著提高，表明RPFRE可通過促進正常小鼠免疫器官胸腺、脾臟的發(fā)育和免疫細胞免疫活性的增強，實現(xiàn)提升小鼠的機體免疫力。前期研究發(fā)現(xiàn)，RPFRE對正常小鼠血清抗氧化指標(biāo)存在影響，RPFRE有提升總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）含量的效果[10]。因此，RPFRE 是否可以通過其抗氧化的藥理作用發(fā)揮或影響其免疫調(diào)節(jié)作用需要相關(guān)性分析研究。

4 結(jié)論

太子參須提取物對小鼠體質(zhì)量有提高作用，臨床未見不良影響；可以改善小鼠免疫功能。綜合聚類分析表明，低、中劑量的太子參須提取物作用較為明顯。研究結(jié)果表明，太子參須提取物具有一定的免疫增強作用，具有開發(fā)免疫增強制劑新產(chǎn)品的潛力。