薄層色譜法鑒別槐枝及高效液相色譜法測(cè)定其中蘆丁含量

于姍姍，王云，李敏，張秋紅

（濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，濟(jì)南 250102）

槐枝為常用中藥，最早收載于《別錄》，《新修本草》中又名嫩槐枝，為豆科植物槐的嫩枝，具有散瘀止血，清熱燥濕，祛風(fēng)殺蟲(chóng)之功效，主治崩漏、赤白帶下、痔瘡、陰囊濕癢、心痛、目赤、疥癬等，每年4～5月采收，曬干或鮮用?？杉鍦?、浸酒或燒灰內(nèi)服，亦可煎水熏洗、燒瀝涂［1］。

槐枝含有較多的黃酮類(lèi)化合物，臨床上常用于治療咽炎、中耳炎、膿皰瘡等［2-4］，其中蘆丁為主要藥效成分。蘆丁又稱(chēng)蕓香苷，是一種存在于多種植物中的黃酮類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，因此用蘆丁含量作為測(cè)定槐枝的質(zhì)量控制指標(biāo)具有重要意義。

槐枝在歷版國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、《山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》及《山東省中藥飲片炮制規(guī)范》中均未收載，在部分省級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中有收載。但是檢驗(yàn)項(xiàng)目及內(nèi)容比較單一，有的地方標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)檢驗(yàn)項(xiàng)目［5-9］，有的地方標(biāo)準(zhǔn)中檢驗(yàn)項(xiàng)目有性狀、顯微鑒別、薄層鑒別及常規(guī)的藥材檢查項(xiàng)目［10-11］。上述標(biāo)準(zhǔn)中均無(wú)含量測(cè)定方法，《遼寧省中藥材標(biāo)準(zhǔn)：第二冊(cè)》2019 年版中薄層鑒別前處理方法復(fù)雜，展開(kāi)劑用到易制毒試劑丁酮，因此優(yōu)化槐枝的薄層色譜鑒別方法及建立高效液相色譜法測(cè)定蘆丁含量具有重要意義。

目前文獻(xiàn)中對(duì)槐枝的質(zhì)量評(píng)價(jià)多采用其高麗槐素、蘆丁、槲皮素以及揮發(fā)油的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。但成麗等［12］采用高效液相色譜法測(cè)定槐枝中高麗槐素含量，方法重現(xiàn)性好，但是因?yàn)楦啕惢彼貙?duì)照品制備繁瑣，不利于廣泛普及。陳華國(guó)等［13］采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定槐枝中蘆丁和槲皮素含量，以甲醇-0.01 mol／L 乙酸銨(體積比為47∶53)混合溶液為流動(dòng)相，流動(dòng)相中需要加入鹽溶液，配制比較復(fù)雜，操作不當(dāng)容易阻塞色譜柱，損壞高效液相色譜儀。熊維政等［14］利用高效液相色譜法測(cè)定國(guó)槐槐枝及槐葉中蘆丁含量，并進(jìn)行了比較，采用的流動(dòng)相配制簡(jiǎn)便，但是樣品提取過(guò)程中沒(méi)有考察溶劑的影響，不能精準(zhǔn)地測(cè)定槐枝中蘆丁含量。趙超等［15］以蘆丁為對(duì)照品，利用分光光度法測(cè)定槐枝中總黃酮類(lèi)含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制及樣品處理過(guò)程繁瑣，操作復(fù)雜。張艷焱等［16］采用水蒸汽蒸餾法分別提取新鮮和干燥槐枝中的揮發(fā)油，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析和鑒定其化學(xué)成分，方法對(duì)儀器及操作者水平要求較高，不適用于槐枝的日常檢驗(yàn)。

筆者收集了10 批槐枝飲片樣品，以蘆丁含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)樣品提取條件、薄層色譜展開(kāi)劑、色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了槐枝的薄層色譜鑒別法及高效液相色譜法測(cè)定其中蘆丁含量的方法。該方法操作簡(jiǎn)單、分離度好、經(jīng)濟(jì)環(huán)保，準(zhǔn)確度高，為槐枝質(zhì)量控制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定了研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-20AT 型，LCsolution 工作站，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-600GDV 型，昆山市超聲儀器有限公司。

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：FW100 型，天津市泰斯特儀有限公司。

電子天平：MS204TS 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器公司。

蘆丁對(duì)照品：批號(hào)為100080-201811，含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為91.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

硅膠G 薄層板，青島海洋化工廠(chǎng)分廠(chǎng)。

甲醇：色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

冰醋酸：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

槐枝飲片樣品：10 批，編號(hào)分別為1～10，均為豆科植物槐Sophora japonica L.的嫩枝，經(jīng)干燥，切片制得，產(chǎn)地均為山東。其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

1.2 薄層色譜鑒別

1.2.1 對(duì)照品溶液制備

取蘆丁對(duì)照品適量，加入甲醇溶解，配制成蘆丁的質(zhì)量濃度為2 mg／mL 的對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液制備稱(chēng)取2 g 槐枝粉末（過(guò)二號(hào)篩，篩孔直徑為2 000 μm），加入30 mL 石油醚（30～60 ℃）超聲處理（500 W，頻率40 kHz）20 min，過(guò)濾，棄去濾液，濾渣揮干溶劑后，加入50 mL 甲醇超聲處理（500 W，頻率40 kHz）30 min，過(guò)濾，取濾液蒸干，殘?jiān)尤? mL 甲醇溶解，所得溶液即為供試品溶液。

1.3 高效液相色譜法測(cè)定

1.3.1 色譜條件

色 譜 柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，瑞典諾力昂公司）；流動(dòng)相：甲醇-1%冰醋酸溶液（體積比為32∶68）；檢測(cè)波長(zhǎng)：257 nm；流量：1.0 mL／min；柱溫：36 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品0.102 82 g，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至標(biāo)線(xiàn)，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液2 mL，置于250 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至標(biāo)線(xiàn)，搖勻，配制成蘆丁的質(zhì)量濃度為15.1 μg／mL 的對(duì)照品溶液。

1.3.3 供試品溶液制備

精密稱(chēng)取槐枝粉末（過(guò)二號(hào)篩）約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，密塞，稱(chēng)量并記錄質(zhì)量，超聲處理（500 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻，再次稱(chēng)量質(zhì)量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，續(xù)濾液即為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 薄層色譜鑒別條件選擇

按照《中國(guó)藥典》2020 年版［17］槐米的薄層鑒別方法，選擇1 號(hào)槐枝樣品粉末（過(guò)二號(hào)篩）2 g，加入50 mL 甲醇超聲處理（500 W，頻率40 kHz）30 min，過(guò)濾，取濾液蒸干，殘?jiān)尤? mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。按1.2.1 方法制備對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法（2020 年版《中國(guó)藥典：四部》 通則0502）試驗(yàn)方法，分別吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各2 μL和5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（體積比為8∶1∶1）溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，待乙醇揮干后，置于紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可以看出，供試品色譜圖中，沿著展開(kāi)過(guò)程，有明顯的未完全分離的熒光斑條，在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置上，有相應(yīng)的未分離完全的熒光斑點(diǎn)，點(diǎn)樣量2 μL 及5 μL 無(wú)明顯區(qū)別，結(jié)果表明，供試品色譜圖中，雖然含有蘆丁，但是因?yàn)闃悠冯s質(zhì)較多，提取條件或展開(kāi)劑選擇不恰當(dāng)，導(dǎo)致斑點(diǎn)未完全分離。

圖1 槐枝的薄層色譜圖

考慮到槐枝樣品中含有色素等極性較大的物質(zhì)較多，先對(duì)樣品進(jìn)行脫色處理。稱(chēng)取3 份槐枝粉末（過(guò)二號(hào)篩）樣品，各2 g，分別加入石油醚（30～60℃）、石油醚（60～90 ℃）、乙醚各30 mL，分別超聲處理20 min；再稱(chēng)取3 份槐枝粉末（過(guò)二號(hào)篩）樣品，各2 g，分別加入石油醚（30～60 ℃）、石油醚（60～90℃）、乙醚各30 mL，分別回流提取20 min，將處理后的6 份樣品分別過(guò)濾，棄去濾液，濾渣揮干溶劑后，加入50 mL 甲醇超聲處理（500 W，頻率40 kHz）30 min，過(guò)濾，取濾液蒸干，加入2 mL 甲醇使殘?jiān)芙?，制? 份供試品溶液。以乙酸乙酯-甲醇-水（體積比為8∶1∶1）溶液為展開(kāi)劑，考察不同提取溶劑及提取方法的展開(kāi)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以石油醚（30～60℃）、超聲處理20 min 展開(kāi)結(jié)果最好，供試品色譜圖在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)位置上，能顯示出相同顏色的斑點(diǎn)，但是斑點(diǎn)有拖尾。在展開(kāi)劑中加入少量甲酸，斑點(diǎn)分離效果好，無(wú)拖尾現(xiàn)象，故樣品提取方法選擇先加入石油醚（30～60 ℃），超聲處理20 min，然后加入50 mL 甲醇提取，展開(kāi)劑選擇乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（體積比為8∶1∶1∶1）溶液。

2.2 薄層色譜鑒別結(jié)果

根據(jù)2.1 薄層色譜鑒別條件，建立槐枝的薄層色譜鑒別方法：稱(chēng)取槐枝粉末（過(guò)二號(hào)篩）2 g，加入石油醚（30～60 ℃）30 mL 超聲處理20 min，過(guò)濾，棄去濾液，濾渣揮干溶劑后，加入50 mL 甲醇超聲處理（500 W，頻率40 kHz）30 min，過(guò)濾，取濾液蒸干，加入2 mL 甲醇溶解殘?jiān)礊楣┰嚻啡芤?。?.2.1 方法制備對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法（2020年版《中國(guó)藥典：四部》 通則 0502）試驗(yàn)方法，分別吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（體積比為8∶1∶1∶1）溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴三氯化鋁試液，待乙醇揮干后，置于紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可以看出，供試品色譜圖在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)位置上，呈現(xiàn)相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

圖2 槐枝的薄層色譜圖

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密吸取1.3.2 中的對(duì)照品溶液和1.3.3 中的供試品溶液，各10 μL，按1.3.1 色譜條件測(cè)定，理論板數(shù)按蘆丁色譜峰計(jì)不低于3 000，系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)符合要求。對(duì)照品溶液、供試品溶液色譜圖如圖3 所示。

圖3 對(duì)照品溶液、供試品溶液的色譜圖

2.4 蘆丁含量測(cè)定提取條件選擇

選擇編號(hào)為1＃的槐枝樣品粉末，分別選擇甲醇、70%乙醇溶液、50%甲醇溶液及50%乙醇溶液4 種提取溶劑對(duì)蘆丁進(jìn)行提取，考察不同提取溶劑的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以50%甲醇溶液為提取溶劑時(shí)，色譜峰面積最大，基線(xiàn)平穩(wěn)，故采用50%甲醇為提取溶劑。以50%甲醇溶液為提取溶劑，分別采用超聲法（30、60 min）、回流法（30、60 min）對(duì)蘆丁進(jìn)行提取，考察不同提取方法的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提?。?0、60 min）及回流提?。?0、60 min）的色譜峰面積無(wú)明顯差異，故選用超聲法（30 min）對(duì)樣品進(jìn)行提取。

2.5 色譜條件優(yōu)化

分別選用瑞典N(xiāo)ouryon 的Kromasil 100-5-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱、島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司的VP-ODS C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱及美國(guó)安捷倫科技有限公司的Agilent Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同色譜柱之間無(wú)明顯差異，均能實(shí)現(xiàn)色譜分離，理論板數(shù)，分離度及拖尾因子均符合《中國(guó)藥典》2020 年版的規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)選用瑞 典N(xiāo)ouryon 的Kromasil 100-5-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱作為分離柱。

在1.3.1 色譜條件下，分別考察了甲醇-0.01 mol／L 乙酸銨(體積比為47∶53)溶液、甲醇-1%冰醋酸（體積比為32∶68）溶液、乙腈-2.5%冰醋酸（體積比為13∶87）溶液3 種流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-2.5%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，色譜圖中的溶劑峰明顯；采用甲醇-0.01 mol／L 乙酸銨溶液、甲醇-1%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，蘆丁的色譜峰尖銳，理論板數(shù)高，分離度良好。由于甲醇-0.01 mol／L 乙酸銨溶液配制較復(fù)雜，使用鹽溶液操作不當(dāng)容易阻塞色譜柱，損壞高效液相色譜儀，而甲醇-1%冰醋酸溶液配制簡(jiǎn)單，操作容易。綜合考慮，選擇甲醇-1%冰醋酸（體積比為32∶68）溶液為流動(dòng)相。

2.6 線(xiàn)性方程與檢出限

自動(dòng)進(jìn)樣器分別精密吸取1.3.2 中的對(duì)照品溶液3、7、10、13、15 μL 注入液相色譜儀，在1.3.1 色譜條件下，依次進(jìn)樣測(cè)定，以蘆丁的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性方程和相關(guān)系數(shù)。

用甲醇將對(duì)照品溶液稀釋10 倍，然后逐級(jí)稀釋進(jìn)樣分析，以3 倍信號(hào)和噪音的比值（S／N）對(duì)應(yīng)的質(zhì)量作為方法檢出限，5 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量作為定量限。蘆丁的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見(jiàn)表1。

表1 蘆丁的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選擇1 號(hào)槐枝樣品粉末（過(guò)二號(hào)篩），精密稱(chēng)取約0.5 g，按照1.3.3 方法制備供試品溶液，在1.3.1色譜條件下，分別于制備完成后第0、1、2、3、5、7、10、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可知，在24 h 內(nèi)色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.19%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 精密度試驗(yàn)

取1 號(hào)槐枝樣品粉末（過(guò)二號(hào)篩）6 份，每份約0.5 g，精密稱(chēng)定，按照1.3.3 方法制備供試品溶液，在1.3.1 色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%，表明該方法精密度較好，滿(mǎn)足測(cè)定要求。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.9 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱(chēng)取1 號(hào)槐枝樣品粉末（過(guò)二號(hào)篩）6 份，每份約0.25 g，分別加入質(zhì)量濃度為7.54 μg／mL的蘆丁對(duì)照品溶液20 mL，再精密加入25 mL 水和5 mL 甲醇，密塞，稱(chēng)量并記錄溶液質(zhì)量，超聲處理（500 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻，再次稱(chēng)量溶液質(zhì)量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，在1.3.1 色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4 可知，樣品加標(biāo)回收率為98.7%～102.2%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.1 實(shí)際樣品測(cè)定

分別精密稱(chēng)取1～10 號(hào)槐枝樣品粉末（過(guò)二號(hào)篩），各約0.5 g，按1.3.3 方法制備供試品溶液，在1.3.1 色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 槐枝樣品蘆丁含量測(cè)定結(jié)果 %

由表5 可知，10 批槐枝樣品中蘆丁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.10%～0.16%之間。不同槐枝樣品之間蘆丁含量差異較大，可能是在槐枝采集過(guò)程中，存在以老枝摻入嫩枝入藥的情形，而老枝中蘆丁的含量較低。

3 結(jié)語(yǔ)

樣品先加石油醚（30～60 ℃）脫色，然后用甲醇進(jìn)行提取，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（體積比為8∶1∶1∶1）為展開(kāi)劑，顯色后斑點(diǎn)清晰，分離度好，可用于槐枝的定性鑒別。采用50%甲醇作為提取溶劑，以甲醇-1%冰醋酸溶液（體積比為32∶68）為流動(dòng)相，建立了高效液相色譜法測(cè)定槐枝中蘆丁含量的方法。該方法簡(jiǎn)便易行、準(zhǔn)確可靠，可為槐枝質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。