基于溫度響應(yīng)的生物相容性聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯合成及其可逆的形態(tài)轉(zhuǎn)變

亓 坤，鄒夢君，廖華珍，趙彥芝，2，雷福厚，2，周菊英，2

1. 廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，南寧 530006； 2. 林產(chǎn)化學(xué)與工程國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530006

水溶性聚合物廣泛應(yīng)用在穩(wěn)定劑、 分散劑等領(lǐng)域[1-2]．美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)可的一類水溶性聚合物為聚乙二醇(PEG)，其具有相容性和水溶性好，且價(jià)廉等優(yōu)良性能．聚乙二醇及其衍生物在生物技術(shù)和藥物傳輸?shù)确矫嬲宫F(xiàn)了較好的前景．例如，聚乙二醇可運(yùn)用于降低抗原性與免疫原性[3]、 沉淀蛋白[4]、 防止被酶和細(xì)胞降解等領(lǐng)域[5]．

聚乙二醇作為一種水溶性聚合物，常被用作共軛段與其他疏水聚合物共聚，其高的水合能力有利于調(diào)節(jié)材料的親水性．聚乙二醇基共聚物也是一種溫度響應(yīng)性聚合物，例如當(dāng)其與聚(乙烯醚)、 聚苯乙烯、 聚(降冰片)和聚酯或聚(丙烯酸酯)形成共聚物時(shí)，在某些領(lǐng)域可取代傳統(tǒng)的溫度響應(yīng)性的聚(n-異丙基丙烯酰胺)．聚乙二醇基共聚物[6]在生理介質(zhì)和水溶液中顯示出低的臨界轉(zhuǎn)變溫度，且高分子鏈具有可逆形態(tài)轉(zhuǎn)變，通常應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域．例如，紫杉醇負(fù)載于單甲氧基聚乙二醇(mPEG)-b-聚丙交酯膠束中，并在不損失細(xì)胞毒性的情況下可從膠束中釋放[7]．聚谷氨酸-單甲氧基聚乙二醇納米膠束可被應(yīng)用于血液循環(huán)中[8]．LIN D S等[9]合成了甲氧基聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯三嵌段共聚物并研究了其自組裝行為并用于載藥和釋藥領(lǐng)域．除上述mPEG共聚物外，其他共聚物如接枝殼寡糖共聚物(COS-g-PCL-b-mPEG)[10]，mPEG-殼聚糖雙嵌段共聚物[11]等也可用于藥物載體領(lǐng)域．

松香是一種熱塑性固體樹脂，存在于天然松樹的油脂中[12]．松香不溶于水，但通過引入親水基團(tuán)，松香衍生聚合物可以變成水溶性．如以松香酰亞胺、 馬來酸酐加成物為基礎(chǔ)的非離子表面活性劑可作為石油原油污泥分散劑[13]．兩親性聚乙二醇-聚脫氫松香甲基丙烯酸乙酯嵌段共聚物在阻礙腫瘤生長中表現(xiàn)出優(yōu)越的性能[14]．兩親性松香基共聚物在親水和疏水作用力下可發(fā)生多種高分子鏈形態(tài)轉(zhuǎn)變．固體酸催化法、 酰氯酯化法和質(zhì)子酸催化法是松香酯化共聚的常見方法[15-16]．我們實(shí)驗(yàn)室制備了兩親性脫氫松香酸-丁二酸聚酯并研究了其膠束化和在水中的分子鏈的形態(tài)轉(zhuǎn)變過程[17]．

本研究合成了聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯，得到了其臨界膠束濃度，并探究了聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯在變溫水溶液中的形態(tài)轉(zhuǎn)變及形成膠束的行為，結(jié)果表明其具有溫度響應(yīng)性，可應(yīng)用于溫敏性載體及綠色表面活性劑．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甲氧基聚乙二醇購自阿拉丁(AR，M為1000)； 4-二甲氨基吡啶購于上海雅本(AR，DMAP)； 馬來松香為廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制(純度可達(dá)到99%)； 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽購于三盛生物科技(AR，EDC)； MEM 培養(yǎng)基來源于HYCLONE； T25培養(yǎng)瓶、 96和24孔培養(yǎng)板均來源于CORNING； 胰酶來源于生工生物； Cell Counting Kit-8來源于碧云天(C0042，CCK-8) ； FBS 來源于GIBCO； 活細(xì)胞/死細(xì)胞染色試劑盒來源于貝博(BB-4126)； 其他溶劑皆為分析純．

1.2 合成聚乙二醇單甲醚馬來松香酸聚酯

以干燥的250 mL單口燒瓶為反應(yīng)容器，在氮?dú)獯嬖谙录尤?.05 g DMAP，2.23 g馬來松香，12 g MPEG，加入二氯甲烷與攪拌子，使體系降溫到0 ℃，保持溫度為0 ℃的條件下加入4.6 g EDC，氮?dú)夥諊路磻?yīng)30 min后，移走冰塊，室溫下繼續(xù)反應(yīng)2 d，透析10 d(透析袋分子量為2 000，溶劑為水和乙醇)后在50 ℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸干，產(chǎn)物為聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯．

1.3 聚乙二醇單甲醚馬來松香酸聚酯的表征

使用美國Nicolet Magna公司IR-550(Ⅱ)型傅里葉紅外光譜儀表征其特征基團(tuán)與化學(xué)結(jié)構(gòu)；1H核磁光譜用德國 Bruker 公司 AV600/400型核磁共振光譜儀測定； 用日本島津UV1800型紫外可見分光光度計(jì)測試聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯水溶液的紫外吸收光譜； 用Waters公司W(wǎng)aters 1525型凝膠滲透色譜表征聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯分子量及其分布； 利用德國NETZSCH 公司STA449F3 Jupiter熱重分析儀對材料的熱性能進(jìn)行分析，測試溫度區(qū)間為25～700 ℃，升溫速率控制在10 ℃/min．

1.4 聚乙二醇單甲醚馬來松香酸聚酯細(xì)胞毒性表征

1.4.1 細(xì)胞活性的測定

聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯的細(xì)胞毒性由CCK8 實(shí)驗(yàn)表征．當(dāng)培養(yǎng)瓶內(nèi) L929密度為100%時(shí)，消化并得到細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，在96孔培養(yǎng)板內(nèi)(4×104個(gè)細(xì)胞/孔)連續(xù)培養(yǎng)24 h(5% CO2、 溫度為37 ℃)．分別加入濃度為 50，300，500 μmol/L的聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯，控制組加入滅菌水．繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入CCK8(10 μL)，1 h后室溫下輕輕震蕩10 min，然后以酶標(biāo)儀(Perkinelmer，EnSpire)測定OD450值，各個(gè)樣品平行測定5次．

1.4.2 Live/Dead 細(xì)胞熒光染色實(shí)驗(yàn)

當(dāng)培養(yǎng)瓶內(nèi) L929相對密度為100%時(shí)，消化并得到細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，96孔培養(yǎng)板內(nèi)(1.5×105個(gè)細(xì)胞/孔)培養(yǎng)24 h(5% CO2、 溫度為37 ℃)．加入濃度為 50，300，500 μmol/L的聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯，控制組加入滅菌水，在37 ℃、 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h．以1 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，輕輕除掉上清，沖洗后進(jìn)行染色(calcein AM稀釋濃度1 000倍，PI染料稀釋濃度20 000倍)，采用分開染色方案也即calcein AM染色25 min，PI染色5 min．用熒光顯微鏡(OLYMPUS，U-RFL-T)得到活細(xì)胞與死細(xì)胞圖像，分別為黃綠色與紅色．

1.5 聚乙二醇單甲醚馬來松香酸聚酯溫度響應(yīng)性膠束形成及形態(tài)轉(zhuǎn)變研究

利用BZY-2表面張力儀測定臨界膠束濃度．彈性光散射光譜與強(qiáng)度是通過用美國PE公司LS-55型的熒光分光光度計(jì)來測定的．激發(fā)和發(fā)射狹縫均設(shè)置為2.5 nm[18]．可以進(jìn)行升溫與降溫控制，升溫與降溫速率是1 ℃/min，每一溫度測定3次．

2 結(jié)果與討論

2.1 聚乙二醇單甲醚馬來松香酸聚酯化學(xué)結(jié)構(gòu)與分子

圖1為聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯紅外光譜，亞甲基的伸縮振動(dòng)位于2 870 cm-1處，甲基亞甲基的彎曲振動(dòng)位于1 450 cm-1，1 349 cm-1處[19]； 酯基中C=O的伸縮振動(dòng)位于1 724 cm-1處； 羧基和封端羥基的O—H伸縮振動(dòng)位于3 518 cm-1寬峰處，羧基中O—H的彎曲振動(dòng)位于949 cm-1，C—O—C的伸縮振動(dòng)峰位于1 103 cm-1[20]，且該峰較強(qiáng)，因此認(rèn)為成功得到了聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯．

圖2為聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯的1H核磁共振圖，譜峰的歸屬信息見表1．通過1H核磁共振圖譜可知馬來松香酸C=C上與甲氧基上H個(gè)數(shù)比1∶5，也即2個(gè)聚乙二醇單甲醚通過酯化方法接到一個(gè)馬來松香酸上．聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯結(jié)構(gòu)如圖3所示．

圖1 聚乙二醇單甲醚馬來松香 酸聚酯的紅外光譜

圖2 聚乙二醇單甲醚馬來松香酸 聚酯的1H核磁共振譜圖

表1 聚乙二醇單甲醚馬來松香酸聚酯1H核磁共振譜數(shù)據(jù)

圖3 聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯結(jié)構(gòu)式

根據(jù)聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯凝膠滲透色譜圖(圖4)可知，餾分餾出時(shí)間為30 min，聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯的數(shù)均分子量是2 500，多分散系數(shù)為1.32．

2.2 聚乙二醇單甲醚馬來松香酸聚酯的紫外可見吸收光譜

如圖5所示，聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯最大吸收峰位于195 nm，280 nm左右有一個(gè)吸收峰，而在更高波長處吸收值為0．

圖4 聚乙二醇單甲醚馬來松香酸 聚酯的GPC

圖5 聚乙二醇單甲醚馬來松香酸 聚酯的紫外可見吸收光譜

2.3 聚乙二醇單甲醚馬來松香酸聚酯熱分解溫度

由TG和DTG曲線(圖6)可知，聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯在大概380 ℃開始分解，400 ℃左右分解最為劇烈，420 ℃時(shí)完全分解．分解溫度范圍較窄，這一結(jié)果也表明聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯分子量分布較窄．

2.4 生物相容性

L929細(xì)胞存活率見圖7．當(dāng)聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯濃度為50 μmol/L時(shí)，L929細(xì)胞存活率為102%； 當(dāng)濃度為300 μmol/L時(shí)，L929細(xì)胞存活率為84%； 而當(dāng)濃度為500 μmol/L時(shí)，L929細(xì)胞存活率為72%； 顯示聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯的低毒性．活/死細(xì)胞熒光顯微鏡觀察(圖8)中不同濃度的聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯培養(yǎng)的活/死細(xì)胞染色多數(shù)為黃綠色熒光，少數(shù)為代表死細(xì)胞的紅色熒光，表明聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯具有良好的生物相容性．

圖6 聚乙二醇單甲醚馬來松香酸 聚酯的TG和DTG曲線

圖7 不同濃度聚乙二醇單甲醚馬來松香酸 聚酯下L929細(xì)胞24 h存活率

2.5 聚乙二醇單甲醚馬來松香酸聚酯臨界膠束質(zhì)量濃度的測定

以聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯水溶液的彈性光散射強(qiáng)度對應(yīng)質(zhì)量濃度曲線可得到聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯臨界膠束質(zhì)量濃度．

由理論上可知，當(dāng)散射峰出現(xiàn)在吸收強(qiáng)度減小的波長處時(shí)所得的散射光譜為彈性光散射[21]．由圖9可知，聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯最大散射強(qiáng)度位于390至410 nm區(qū)間，而其紫外在低于280 nm時(shí)存在吸收，280 nm處有1個(gè)小的吸收峰，由此可判斷聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯屬于彈性光散射．聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯水溶液的彈性光散射強(qiáng)度與質(zhì)量濃度大小有關(guān)，各質(zhì)量濃度下的散射強(qiáng)度見圖10(溶液質(zhì)量濃度為2.5，2.2，1.8，1.5，1.0和0.50 g/L)．當(dāng)質(zhì)量濃度較低時(shí)，散射強(qiáng)度幾乎不變，散射強(qiáng)度在高于1.5 g/L時(shí)增大，此時(shí)分子鏈發(fā)生了聚集形成了膠束，因此1.5 g/L為聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯水溶液的臨界膠束質(zhì)量濃度[22]．

圖8 不同濃度聚乙二醇單甲醚-馬來松香聚酯中L929細(xì)胞培養(yǎng)24 h后熒光染色

圖9 聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯的 紫外吸收和彈性光散射光譜

圖10 聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯溶液的 彈性光散射強(qiáng)度-質(zhì)量濃度曲線

2.6 聚乙二醇單甲醚馬來松香酸聚酯在變溫條件下形態(tài)轉(zhuǎn)變

研究了兩種不同質(zhì)量濃度(c=0.13 g/L，1 g/L)的聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯水溶液彈性光散射強(qiáng)度-溫度曲線．兩種樣品的散射強(qiáng)度變化趨勢不盡相同[23]．散射強(qiáng)度-溫度曲線能反映聚集體的尺寸及高分子鏈的形態(tài)轉(zhuǎn)變．而聚集體與高分子鏈的形態(tài)轉(zhuǎn)變主要源于各種相互作用力的大小與變化，如分子間的疏水作用力、 各組分之間的范德華力以及氫鍵等使得聚合物在各個(gè)不同的溫度呈現(xiàn)不同的形態(tài)與聚集態(tài)．

圖11為聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯溶液變溫過程中(c=0.13 g/L)光散射強(qiáng)度變化情況．由25 ℃開始升溫，在此過程中光散射強(qiáng)度增大，45 ℃時(shí)達(dá)到最大值．由于光散射強(qiáng)度表明了聚集體尺寸的大小，25～45 ℃區(qū)間分子鏈形態(tài)發(fā)生變化，產(chǎn)生聚集體組成膠束．馬來松香的疏水段發(fā)生集聚，親水鏈段包裹在馬來松香疏水段周圍形成膠束．高于45 ℃時(shí)，散射強(qiáng)度又開始下降，到達(dá)90 ℃后，散射強(qiáng)度不再改變，即45～90 ℃聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯聚集體分子鏈形態(tài)由較伸展變?yōu)榫o縮，主要是由于親水鏈段與水之間的氫鍵被破壞，親水段的緊縮使膠束尺寸變?。哂?0 ℃時(shí)膠束的大小不變，此時(shí)疏水作用、 各式范德華力與氫鍵作用力達(dá)到平衡狀態(tài)．降溫過程中聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯酯形態(tài)發(fā)生變化、 膠束尺寸變化趨勢與升溫過程相反．升溫過程中的彈性散射強(qiáng)度較小，可能是由于小部分升溫過程中形成的聚集體膠束沉積在溶液底部，難以再次發(fā)生形態(tài)與聚集膠束形態(tài)的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致的．

同時(shí)，當(dāng)質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)也進(jìn)行了相應(yīng)的變溫測試，結(jié)果見圖12．升溫過程中分子鏈形態(tài)轉(zhuǎn)變過程與質(zhì)量濃度為0.13 g/L相似，該濃度下的轉(zhuǎn)折溫度位移到55 ℃左右，降溫過程散射強(qiáng)度變化趨勢與升溫過程相似，形態(tài)轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)折溫度為63 ℃．表明聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯水溶液在變溫條件下發(fā)生的分子鏈形態(tài)與膠束尺寸的轉(zhuǎn)變過程是可逆的，但存在一定的滯后．這可能是由于在較高濃度時(shí)分子團(tuán)聚后，膠束間的互相作用力更強(qiáng)，要打破這種平衡的團(tuán)聚狀態(tài)需要更大能量，所以需要在更高溫度才能進(jìn)行分子鏈形態(tài)的轉(zhuǎn)變及膠束的解離．由此可知，聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯在各質(zhì)量濃度下均表現(xiàn)出優(yōu)良的溫度響應(yīng)性．聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯分子鏈形態(tài)與聚集體膠束轉(zhuǎn)變見圖13．

圖11 c=0.13 g/L時(shí)聚乙二醇單甲醚馬來酸 聚酯在溫度變化時(shí)的光散射強(qiáng)度-溫度曲線

圖12 c=1 g/L時(shí)聚乙二醇單甲醚馬來酸 聚酯在溫度變化時(shí)的光散射強(qiáng)度-溫度曲線

圖13 聚乙二醇單甲醚馬來酸聚酯在加熱和冷卻過程中的形態(tài)轉(zhuǎn)變示意圖

3 結(jié) 論

本研究通過酯化的方法制備了具有溫度響應(yīng)性的聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯，對其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征、 熱性能研究及細(xì)胞毒性研究．考察了聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯各質(zhì)量濃度溶液在變溫條件下的高分子鏈及聚集膠束形態(tài)轉(zhuǎn)變．結(jié)果證明，聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯表現(xiàn)出溫度響應(yīng)性，形態(tài)轉(zhuǎn)變具有溫度可逆性．聚乙二醇單甲醚-馬來松香酸聚酯制備簡便，具有良好的生物相容性與溫度響應(yīng)性，可應(yīng)用于綠色表面活性劑及溫度響應(yīng)性載體．