生活污水對濕地光合細菌種類和豐度的影響
——以馬鞍溪濕地公園為例

宋 潔，易 琴

1. 西南大學(xué) 附屬中學(xué)校，重慶 400700； 2. 西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究所，重慶 400715

濕地在生態(tài)恢復(fù)中發(fā)揮著重要作用．濕地具有多種生態(tài)功能，包括元素生物地球化學(xué)循環(huán)、 作為有機碳庫減少溫室氣體如CO2，N2O和CH4釋放等．人工濕地具有較好的景觀效果和污染物處理效率，因而在生活污水處理中得到了廣泛的應(yīng)用[1]．濕地影響著細菌多樣性、 豐度和均勻度[2]，同時，細菌的種類與群落結(jié)構(gòu)對于濕地生態(tài)功能至關(guān)重要．目前對濕地細菌群落及其功能的研究主要集中在紅樹林濕地的硫代謝微生物[3]以及影響紅樹林濕地細菌區(qū)系的因素[4]，杭州西溪濕地公園的細菌多樣性、 組成和類型，用標(biāo)記基因nrfA研究上海濕地公園細菌硝酸異化性還原為氨(Dissimilatory nitrate reduction to ammonia，DNRA)涉及的高豐度微生物．有研究[5]發(fā)現(xiàn)細菌豐度從高到低依次為湖球菌屬(Lacunisphaera)、 堆囊菌(Sorangium)、 氣單胞菌(Aeromonas)、 珊瑚球菌(Corallococcus)和地桿菌(Geobacter)．在濕地中還發(fā)現(xiàn)了其他細菌，如動桿菌(Proteobacteria)、 綠彎菌(Chloroflexi)、 硬壁菌門(Firmicutes)、 酸桿菌(Acidobacteria)、 擬桿菌門(Bacteroidetes)、 硝化螺菌門(Nitrospirae)、 放線菌(Actinobacteria)、 螺旋菌門(Spirochaetae)、 浮霉菌(Planctomycetes)、 綠菌門(Chlorobi)、 脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、 藍細菌(Cyanobacteria)、 OP8，WS3，TA06和OP11，其中優(yōu)勢細菌為動桿菌(Proteobacteria)、 綠彎菌門(Chloroflexi)和硬壁菌門(Firmicutes)[6]．還有研究在濕地中發(fā)現(xiàn)了降解甲苯等污染物的細菌如皮氏羅爾斯頓菌(Ralstoniapickettii)[7]．

光合細菌主要分為紫色非硫細菌、 紫色硫細菌、 綠色硫細菌和綠色絲狀菌等4類．光合細菌可以降解富營養(yǎng)水體中的污染物，是濕地發(fā)揮生態(tài)恢復(fù)功能的關(guān)鍵細菌．在廢水處理過程中，可進行光合作用而不產(chǎn)氧的光合細菌既可去除污染物，還可以通過生物煉制回收蛋白質(zhì)、 輔酶Q10、 5-ALA、 類胡蘿卜素、 細菌葉綠素和生物可降解塑料-聚羥基脂肪酸酯等物質(zhì)和能量，是生態(tài)友好型微生物[8]．PSB對各營養(yǎng)型廢水的化學(xué)需氧量、 氨氮及總磷降解率可達到90%以上．光合細菌還能去除養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝態(tài)氮．光合紫色非硫細菌沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)可以作為水質(zhì)凈化的添加劑[9]．外硫紅螺菌屬(Ectothiorhodospira) 以單硫代砷酸鹽為電子供體并將其完全轉(zhuǎn)化為砷酸鹽，參與硫和碳的生物地球化學(xué)循環(huán)[10]．光合細菌還可以利用光能進行生物脫鹽[11]．類球紅桿菌(Rhodobactersphaeroides)可以用作生物監(jiān)測和生物修復(fù)，去除放射性污染和汞污染[12]．為了防止光照產(chǎn)生活性氧和紫外損傷，光合細菌光合基因的表達受到獨特的調(diào)控．其中包括調(diào)控RNA和反義RNA，反式作用的小非編碼RNA[13]等．

但是，目前未見濕地光合細菌的研究報道，也未見生活污水對濕地光合細菌群落組成和多樣性的影響的研究．研究濕地光合細菌群落及其變化，將有助于豐富對濕地細菌區(qū)系及其功能的認識．光反應(yīng)中心復(fù)合體的M亞基的編碼基因pufM是目前研究光合細菌的主要標(biāo)記基因．單拷貝的pufM基因廣泛用在光合細菌的鑒定[14-22]或者定量[23]．pufM用作光合細菌生態(tài)研究的一般流程是擴增樣品的pufM基因，構(gòu)建文庫、 測序．本研究第一次揭示了濕地光合細菌種類、 群落結(jié)構(gòu)，以及生活污水排放的影響，為認識濕地中光合細菌群落結(jié)構(gòu)、 生態(tài)學(xué)作用，以及關(guān)鍵功能菌的富集培養(yǎng)、 分離和后續(xù)的基因組、 生物化學(xué)、 菌種之間相互作用提供了基礎(chǔ)．

1 材料和方法

1.1 樣品的材料和處理

采集重慶北碚馬鞍溪濕地公園淤泥樣品(上游T1608A_B28和下游T1608A_B27，北緯29°49′33″，東經(jīng)106°25′0″，上下游距離300 m，排污口位于上下游中間，距離上游50 m處)，裝入含DNA保護液的采集管．樣品用MIO-BIO PowerSoil DNA Isolation Kit抽提基因組DNA．樣品一式3份．

1.2 PCR 擴增及文庫構(gòu)建

文庫構(gòu)建采用兩步PCR擴增的方法，首先采用特異引物(即內(nèi)側(cè)引物)擴增目的片段，pufM基因引物序列F 5′-TACGGSAACCTGTWCTAC-3′，R 5′-AYNGCRAACCACCANGCCCA-3′．膠回收目的片段作為模板進行二次PCR擴增(即外側(cè)引物)，將illumina平臺測序所需的接頭，測序引物，barcode添加到目的片段的兩端．

引物如下：

F內(nèi)側(cè)引物： 5′-TTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-特異引物-3′

F外側(cè)引物： 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-barcode-TCTTTCCCTACACGACGCTC-3′

R內(nèi)側(cè)引物： 5′-GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-特異引物-3′

R外側(cè)引物： 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-3′

第1次PCR擴增 PCR擴增體系： 5xBuffer 10 μL，dNTP (10 mmol/L) 1 μL，Phusion超保真DNA聚合酶1U，F(xiàn)/R內(nèi)側(cè)引物(10 μmol/L) 各1 μL，模板5～50 ng，ddH2O補至50 μL．ABI9700 PCR儀PCR擴增程序： 94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)，72 ℃ 5 min，10 ℃保溫．取3 μL PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測．

第2次PCR擴增 切取第1次PCR凝膠電泳產(chǎn)物，采用AXYGEN 公司的 AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒回收．回收產(chǎn)物進行第2次PCR擴增．第2次PCR擴增的體系與第一次類似，只是循環(huán)為8次．取3 μL PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測．

文庫構(gòu)建 將PCR擴增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收(電泳槽保持干凈，更換電泳緩沖液)．采用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收．回收產(chǎn)物進行qPCR定量．FTC-3000TM real-time PCR儀實時熒光定量，樣本按照等摩爾比混勻后完成文庫制備．

1.3 測序與系統(tǒng)發(fā)育分析

微基生物科技(上海)有限公司Illumina MiSeq 2×300 bp多個樣品混合測序．根據(jù)標(biāo)示樣本來源的barcode標(biāo)簽序列區(qū)分、 提取各個樣品的數(shù)據(jù)，以fastq格式保存．特異引物去除序列中可能含有的模糊堿基、 單堿基高重復(fù)區(qū)以及PCR過程中產(chǎn)生嵌合體．過濾拼接的長Reads中的singletons(對應(yīng)reads只有一條的序列)，進行聚類OTU(operational taxonomic units)．采用軟件為mothur V.1.39.5．

1.3.1 OTU聚類

將OTU代表序列與NCBI進行Blast比對，找到相似度最高的已知物種的信息，排除未培養(yǎng)的環(huán)境樣本信息，將該物種的分類信息注釋為對應(yīng)OTU的物種分類信息，通過物種信息的登錄號得到各個級別的分類信息．

1.3.2 物種分類學(xué)統(tǒng)計

將OTU綜合分類表中的信息按門、 綱、 目、 科、 屬、 種6個分類水平提取，分別統(tǒng)計各樣品在不同分類水平比對上的序列數(shù)．

1.4 BLAST分析

序列用NCBI數(shù)據(jù)庫手動去掉載體，應(yīng)用BLASTn程序與數(shù)據(jù)庫進行相似性比對搜索，選擇同源性最高的3條序列為參比序列．采用ClustalX 2軟件進行序列多重比對，然后以Kimura-2模型計算進化距離，以鄰接法和MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹．

1.5 多樣性指數(shù)和樣品聚類分析

通過MOTHUR (http： //www.mothur.org/wiki/Main_Page)軟件進行序列的操作OTU的聚類，以Cutoff=0.03為閾值劃分OTU．并用GenoDive軟件(http： //genodive.org/)計算出多樣性相關(guān)指數(shù)： 有效基因型數(shù)、 基因型多態(tài)性指數(shù)、 均勻度指數(shù)、 香農(nóng)-威納指數(shù)、 修正香農(nóng)-威納指數(shù)、 未校正的基因型多樣性指數(shù)．覆蓋率運用公式：Rcov=1-(N/nInd)計算，N為整個文庫中只出現(xiàn)一次的克隆子數(shù)目；nInd為文庫中篩選出來的總的陽性序列數(shù)目．稀釋曲線運用POST軟件計算，Excel繪圖．

2 結(jié)果與分析

2.1 擴增獲得了pufM片段

取第1次擴增的3 μL PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1a．顯示成功擴增pufM．圖1b為第2次PCR擴增結(jié)果．圖中可見條帶單一，亮度適中，可進行后續(xù)膠回收實驗．

分子量Marker為DL2000，從上至下條帶依次為2 000 bp，1 000，bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp，上樣量為3 μL，亮帶為30 mg/L，其余條帶均為10 mg/L．圖1 兩次PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 兩個樣點的光合細菌測序深度合理

每個采樣點采集3個樣品，以下數(shù)據(jù)僅呈現(xiàn)代表性的結(jié)果．T1608A_B27和T1608A_B28兩個樣本的優(yōu)化序列數(shù)分別為10，576和16，494．為了確定樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理，比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，從樣本序列中隨機抽樣，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線．當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU．從稀釋曲線(圖2)可看出光合細菌的測序數(shù)量合理，多樣性采集較為充分．

2.3 生活污水排放影響光合細菌物種豐度和物種均勻度

為了分析生活污水排放對光合細菌多樣性的影響，統(tǒng)計兩個采樣點6份樣品的結(jié)果．下文描述其中代表性樣品中每一個OTU所含的序列數(shù)，將OTUs按豐度(所含有的序列條數(shù))由大到小的等級排序，再以O(shè)TU等級為橫坐標(biāo)，以每個OTU中所含的序列數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，構(gòu)建豐度等級圖．從圖3可見，生活污水排放影響馬鞍溪濕地光合細菌的多樣性，這體現(xiàn)在生活污水排放影響樣品中光合細菌群落的豐富度，即群落中光合細菌的種類多少，不考慮群落中每種光合細菌的豐度．這可以用chao指數(shù)和ace指數(shù)衡量，指數(shù)越大，說明樣品中的物種越豐富．

圖中水平方向，曲線的寬度反映物種的豐度，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大； 曲線的形狀(平滑程度)反映了樣品中物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻．

圖2 稀釋曲線表明兩處樣品的測序深度符合要求

圖3 生活污水排放影響濕地光合細菌多樣性

從表1中可見，無生活污水排放的樣品T1608A_B27中，光合細菌的種類較多，但進一步分析顯示主要集中在低豐度的光合細菌．生活污水排放降低了低豐度光合細菌的種類和數(shù)量．

表1 兩個采樣點的多樣性指數(shù)

生活污水排放影響群落的多樣性．群落多樣性受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響．相同物種豐富度的情況下，群落中各物種均勻度越大，則群落多樣性越大．香農(nóng)-威納指數(shù)越大，說明物種越豐富．從表中可見，無生活污水排放的T1608A_B27樣品中，香農(nóng)-威納指數(shù)更大，提示光合細菌群落多樣性更大．而生活污水排放，降低了光合細菌的多樣性．辛普森指數(shù)越小，說明樣品中的物種越豐富．從表中可見，未受生活污水排放樣品的辛普森指數(shù)更小，說明其中物種更豐富．

為了找出兩個樣點中相同的光合細菌，選用相似水平為 97%的OTU樣品，構(gòu)建維思圖．從圖4a可見，兩個樣本中115個OTU相同，相似度達到76%，提示OTU組成非常相似．

為了分析兩個樣點間的差異和距離，我們分析兩個代表性樣品OTU(97%相似性)組成，進行主成分分析PCA(Principal Component Analysis)．根據(jù)每個樣品OTU在每個樣品的豐度文件計算出每個OTU在每個樣品的比例，利用這個比例信息進行OTU的PCA分析．從圖4b可見，生活污水排放對光合細菌的影響大．

生活污水排放對兩個樣點的光合細菌多樣性影響很大．圖4c顯示生活污水排放后，光合細菌的beta多樣性也明顯降低，辛普森指數(shù)更高，提示β多樣性降低．

2.4 生活污水通過影響光合細菌群落中的少數(shù)種類而改變?nèi)郝浣Y(jié)構(gòu)

為了確定生活污水排放對光合細菌群落中哪些具體類群有顯著影響，比較了兩個樣品中具體的微生物種類和相對豐度(序列數(shù))．我們分別從綱、 屬和種3個水平進行了分析．從圖5a可見，在綱水平上，組成都是α-變形菌、 β-變形菌和γ-變形菌．但是，生活污水排放處的β-變形菌是無生活污水的近3倍，α-變形菌和γ-變形菌在無生活污水排放點則是有污水排放的近3倍．這提示生活污水排放顯著改變綱水平的光合細菌群落結(jié)構(gòu)．從圖5b可見，在屬水平上，生活污水排放后，明顯增多的是紅長命菌(Rubrivivaxgelatinosus)，湖棲菌(Limnohabitanssp. Hippo3)，明顯降低的是甲基桿菌(Methylobacteriumaquaticum)，海洋著色菌(Marichromatiumpurpuratum)，檸檬色微菌(Citromicrobiumsp. JL477)和紅桿菌(Rhodobacter)．

圖4 生活污水排放顯著影響光合細菌

圖5c顯示，生活污水排放后，在種水平上明顯增多的是膠狀紅長命菌(Rubrivivaxgelatinosus)和湖棲菌(Limnohabitanssp. Hippo3)，明顯降低的有水生甲基桿菌(Methylobacteriumaquaticum)、 紫色海洋著色菌(Marichromatiumpurpuratum)和檸檬色微菌(Citromicrobiumsp. JL477)．

3 討 論

為了探討生活污水排放對濕地光合細菌群落組成和結(jié)構(gòu)的影響，采用pufM標(biāo)記基因，比較了濕地生活污水排放口上下游兩個樣點中光合細菌的差異．pufM基因是光合操縱子中的一個相對保守的基因，在億萬年的演化后依然同源性很高，常被作為光合細菌分子生態(tài)的標(biāo)記基因．

圖5 生活污水排放影響光合細菌多樣性

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)的差異較大的幾種光合細菌都報道過在污水處理中具有重要作用．膠狀紅長命菌是紫色非硫細菌類光合細菌(non-sulfur photosynthetic bacterium)，可以改善水質(zhì)[24]，是兼性光異養(yǎng)，生活在淡水環(huán)境如小池塘、 食品加工廢水、 活性污泥和下水道中．這與生活污水排放處該菌數(shù)量增加比較吻合．根據(jù)環(huán)境條件，膠狀紅長命菌可以在浮游狀態(tài)和生物膜狀態(tài)下生長[25-26]．同時，其代謝能力多樣，可以光能營養(yǎng)，也可以化能營養(yǎng)，發(fā)酵，產(chǎn)氫(H2)[27]，全基因組序列也包含了相應(yīng)基因[28]．Mg2+[29]、 Fe3+[30]均可提高膠狀紅長命菌生物量．膠狀紅長命菌可以一氧化碳作為唯一碳源、 水作為電子受體產(chǎn)生CO2和H2[31]．

湖棲菌(Limnohabitans)屬細菌是全球淡水生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌[32]，也是硫氧化菌，還參與氮循環(huán)，利用細菌葉綠素a捕獲光能[33]進行光自養(yǎng)，是好氧不產(chǎn)氧光合細菌．湖棲菌基因組具有光合基因簇、 RuBisCO、 一氧化碳脫氫酶、 氨單加氧酶和硫氧化基因[32]，提示代謝能力多樣化．營養(yǎng)會影響湖棲菌豐度[34-36]．城市河流中，湖棲菌屬細菌的豐度與溶解有機物的數(shù)量正相關(guān)[37]．這與我們發(fā)現(xiàn)生活污水排放處其豐度顯著增加也非常吻合．根據(jù)營養(yǎng)條件不同，Limnohabitans 屬菌可能入侵，改變原有細菌區(qū)系生態(tài)，維持細菌多樣性[38]．Limnohabitans 屬菌也是研究入侵物種對微生物區(qū)系影響的理想模式菌．

生活污水排放降低了水生甲基桿菌(Methylobacteriumaquaticum)豐度．鑭系元素是甲基營養(yǎng)細菌XoxF-型甲醇脫氫酶的必需因子[39]．與植物共棲的水生甲基桿菌基因組具有促進植物生長和利用植物釋放的甲醇的基因[40]，這提示該類菌可能與水生植物一起發(fā)揮作用．

紫色海洋著色菌(Marichromatiumpurpuratum)屬于紫色硫細菌，其硫代硫酸脫氫酶含有兩個血紅素，屬于c-型細胞色素[41]，它們會積累元素硫[42]．

檸檬色微菌(Citromicrobium)在寡營養(yǎng)的環(huán)境中廣泛存在[43]，也屬于好氧不產(chǎn)氧光合細菌．生活污水排放點其豐度降低，與其在寡營養(yǎng)環(huán)境中廣泛存在吻合．

當(dāng)然，本研究DNA水平的結(jié)果只能反映環(huán)境中光合細菌整體的多樣性，不能反映出群落中光合細菌的生存能力、 代謝活力以及生長力，也不知優(yōu)勢光合細菌pufM表達水平高低和功能．下一步需要在轉(zhuǎn)錄水平以及生態(tài)功能水平研究濕地光合細菌，特別是分離這些光合細菌，比較它們處理生活污水的能力．