感染赤星病后煙草葉片的蛋白質(zhì)表達(dá)差異

耿莉娜，趙 敏，張 艷，徐 宸，汪代斌

重慶煙草科學(xué)研究所，重慶 400715

煙草屬于收獲葉片的作物，在我國經(jīng)濟(jì)中占有比較重要的地位．煙草病害發(fā)生后對煙葉產(chǎn)量與質(zhì)量影響很大，嚴(yán)重時會造成毀滅性的經(jīng)濟(jì)損失．目前，煙草赤星病是嚴(yán)重制約我國煙葉生產(chǎn)的一類真菌病害，該病具有潛育期短、 爆發(fā)快的特點(diǎn)，在溫濕度適宜的條件下，短時間內(nèi)即可大面積流行，給煙葉生產(chǎn)造成巨大損失．長期使用化學(xué)藥劑防治該病害會引起環(huán)境污染、 農(nóng)藥殘留、 抗藥性等問題； 生物防治雖無毒無害無污染，但其作用緩慢、 穩(wěn)定性差、 易受外界環(huán)境影響等缺點(diǎn)成為開發(fā)的難點(diǎn)，因此研究煙草的抗病性和選育抗赤星病煙草品種是防治該病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑[1-2]．

目前，對于煙草自身抗病性機(jī)理的研究，主要集中在抗病性誘導(dǎo)[3-5]、 抗病基因定位[6-7]、 分子標(biāo)記篩選[8-9]及抗性基因的轉(zhuǎn)化[10]．這些研究都集中在分子水平上，而在蛋白質(zhì)水平上的研究報道很少．煙草自身的抗病性與蛋白的表達(dá)與調(diào)控密切相關(guān)，因此本研究從蛋白質(zhì)水平入手，研究不同煙草品種接種赤星病菌后差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，旨在探討不同抗性煙草品種在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上存在的差異及其對赤星病抗性的影響，為進(jìn)一步明確煙草的抗赤星病機(jī)制提供新內(nèi)容．

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試煙草品種為“云煙87” “K326”和“Beinhart1000-1”，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供．播種于溫室花盆內(nèi)，后移栽于溫室，常規(guī)管理，當(dāng)8～10片真葉完全展開時接種．供試菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d后待用．

1.2 取 樣

在煙草植株10葉期，選擇煙株下部未變黃的葉片接種菌餅，每張葉片上接種2個菌餅，接種3片葉片，接種后25 ℃保濕培養(yǎng)，每天觀察葉片受病菌侵染后情況，感染后第6 d取樣，取接種葉片的上部第一片葉片，以接種前作空白對照，“云煙87”感染前(Y0d)、 “云煙87”感染后第6 d(Y6d)、 “K326”感染前(K0d)、 “K326”感染后第6 d(K6d)、 “Beinhart1000-1”感染前(B0d)和“Beinhart1000-1”感染后第6 d(B6d)共6個樣本．每個樣本稱取2 g葉片，樣品液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3 雙向電泳

取2 g葉片樣品液氮研磨成細(xì)粉狀，加入10 mL預(yù)冷的TCA-丙酮(1∶9)，渦旋混勻，置于-20 ℃沉淀過夜，4 ℃離心40 min(6 000 r/min)，棄上清．加入預(yù)冷丙酮，洗滌3次．通風(fēng)櫥中干燥沉淀．分別加入500 μL 2D裂解液(9.5 mol/L尿素，4% CHAPS，60 mmol/L DTT，體積分?jǐn)?shù)為2%的ampholytes，使用時每500 μL裂解液加入10 μL 50×Protein Inhibitor Cocktail Set I)，震蕩混勻重懸沉淀，冰浴超聲處理(100 W，持續(xù)10 s，間隔8 s，重復(fù)8次)，4 ℃離心30 min(12 000 r/min)，取上清，使用Bradford 法進(jìn)行定量，測蛋白質(zhì)濃度后，分裝于-80 ℃冰箱保存．取處理好的蛋白樣品20 μL，使用12% 分離膠，5% 濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE，再經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色檢測．

分別取樣品100 μg，進(jìn)行雙向電泳，13 cm IPG預(yù)制膠條(pH值為3～10，非線性膠條)，采用EttanTMIPGphorTM等電聚焦系統(tǒng)(GE Amersham)進(jìn)行等電聚焦，IPG膠條在水化緩沖液中再水化12 h，IEF分4步進(jìn)行： 30 V，12 h； 500 V，1 h； 1000 V，1 h； 8000 V，8 h．等電聚焦結(jié)束后，使用兩步法進(jìn)行平衡[11]，然后轉(zhuǎn)移到12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上之后將條帶進(jìn)行第二維電泳．使用Hofer SE 600系統(tǒng)(GE Amersham)以15 mA/塊凝膠進(jìn)行電泳30 min，待樣品完全轉(zhuǎn)移出IPG膠條，加大電流至30 mA/塊凝膠，直到溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠下沿0.5 cm處，電泳結(jié)束．

電泳結(jié)束后取出凝膠，加入固定液(40% 乙醇，10% 冰醋酸)固定過夜，再加入浸泡液(30% 乙醇，6.8% NaAc，0.312% NaS2O3·5H2O)處理30 min，倒掉，用MilliQ水沖洗3次，每次5 min； 將清洗后的膠加入染色液(0.25 % 硝酸銀)中染色20 min，倒掉染色液，用MilliQ水沖洗2次，每次1 min； 放置于顯影液(2.5%無水碳酸鈉，0.04%甲醛)中顯色，直至蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰可見，加入終止液(1.46% EDTA-2Na·2H2O)，終止反應(yīng)； 加入MilliQ水洗3次，每次5 min，再加入10%冰醋酸保存．

1.4 圖像分析

使用UMax Powerlook 2110XL(UMax)掃描染色的凝膠，并使用ImageMaster 2D Platinum(版本5.0，GE Amersham)完成圖像分析．手動驗(yàn)證每個配對斑點(diǎn)以確保在3份數(shù)據(jù)中產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)化點(diǎn)膠體之間的高度再現(xiàn)性．選擇重疊測量比以發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)變化，并且具有1.2倍或更大重疊率閾值過濾的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是差異表達(dá)的．確定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，并從膠上挖取差異點(diǎn)．

1.5 MALDI-TOF/TOF分析及數(shù)據(jù)庫檢索

1.5.1 膠內(nèi)酶解及Ziptip脫鹽

將目標(biāo)蛋白點(diǎn)切下，裝入離心管中做好標(biāo)記，將膠粒切碎后加入50 μL銀染脫色液(銀染脫色液：V30 mmol/L鐵氰化鉀∶V100 mmol/L硫代硫酸鈉=1∶1混合)脫色，清洗脫色至透明，吸棄上清，再加入100 μL 100 mmol/L碳酸氫銨，室溫孵育15 min，吸棄上清凍干，之后加入5 μL 10 mg/L測序級Trypsin(胰蛋白酶，Promega)溶液，37 ℃反應(yīng)過夜(20 h左右)； 將過夜消化的酶解液吸出，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，在原管加入 100 μL 60% ACN/0.1% TFA，超聲溶解 15 min，合并酶解液凍干； 若有較多鹽分，則用 Ziptip(millipore)進(jìn)行脫鹽．首先用50% 的ACN濕潤吸嘴，再用60% ACN/0.1% TFA潤洗兩次，然后用吸嘴反復(fù)吸打樣品液，以除去鹽類和雜質(zhì)，最后用60% ACN/0.1% TFA清洗吸嘴兩次，將所有溶液合并凍干．

1.5.2 質(zhì)譜分析

將凍干后的酶解樣品，取 2 μL 20% 乙腈復(fù)溶．取1 μL溶解后的樣品，直接點(diǎn)于樣品靶上，讓溶劑自然干燥后，再取 0.5 μL過飽和 CHCA 基質(zhì)溶液(溶劑為 50% ACN0.1% TFA)點(diǎn)至對應(yīng)靶位上并自然干燥．樣品靶經(jīng)氮?dú)獯祪舴湃雰x器進(jìn)靶槽并用串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(5800 MALDI-TOF/TOF，AB SCIEX)進(jìn)行測試分析，激光源為355 nm波長的Nd： YAG激光器，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)，一級質(zhì)譜(MS)掃描范圍為800～4 000 Da，選擇信噪比大于50的母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜(MS/MS)分析，每個樣品點(diǎn)上選擇8個母離子，二級質(zhì)譜(MS/MS)累計疊加2 500次，碰撞能量 2 kV，CID關(guān)閉．

1.5.3 數(shù)據(jù)庫檢索

質(zhì)譜測試原始文件用 Mascot 2.2 軟件檢索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果．搜庫參數(shù)設(shè)置如下： Database： NCBI； Taxonomy： XXX； Type of search： Combined(MS+ MS/MS)； Enzyme： Trypsin； Fixed modifications： Carbamidomethyl (C) ； Dynamical modifications： Oxidation(M)； Mass values： Monoisotopic； Protein Mass： Unrestricted； Peptide Mass Tolerance： ± 100×10-6； Fragment Mass Tolerance： ± 0.4 Da； Peptide Charge State： 1+； Max Missed Cleavages： 1．

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)定量及SDS-PAGE電泳檢測

對提取的樣品使用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定，樣品質(zhì)量濃度見表1，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢

圖1 煙葉樣品蛋白SDS-PAGE電泳圖

測(圖1)，根據(jù)結(jié)果顯示“云煙87”對照(Y0d)濃度較低，后續(xù)雙向電泳上樣量為100 μg，根據(jù)樣品質(zhì)量濃度計算雙向電泳上樣體積．

表1 煙葉樣品的蛋白質(zhì)量濃度

2.2 雙向電泳圖譜及差異點(diǎn)分析

將提取的蛋白進(jìn)行雙向電泳分析，使用pH值為3～10，13 cm的IPG預(yù)制膠條，蛋白上樣量為100 μg，雙向電泳銀染結(jié)果見圖2，提取的蛋白在各pH段都有分布，蛋白質(zhì)點(diǎn)較清晰，分離較好．

將蛋白質(zhì)凝膠雙向電泳圖譜經(jīng)Image Master軟件分析，通過比較感染前和感染后第6 d的雙向電泳圖譜，檢測差異蛋白點(diǎn)(圖3)．比較B6d和B0d膠圖有41個表達(dá)差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)，比較K6d和K0d膠圖有46個表達(dá)差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)，比較Y6d和Y0d膠圖有61個表達(dá)差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)，共有148個表達(dá)差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)．根據(jù)軟件分析結(jié)果，結(jié)合電泳圖譜，共選取48個表達(dá)差異顯著的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，其中上調(diào)表達(dá)的蛋白33個，下調(diào)表達(dá)的蛋白15個，具體見表2．

2.3 差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

對選取的48個差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，成功鑒定出38個蛋白質(zhì)點(diǎn)(質(zhì)譜匹配肽段得分高于60，并且匹配得分可信度大于95%)，結(jié)果見表3，其中上調(diào)表達(dá)蛋白28個，下調(diào)表達(dá)蛋白10個．根據(jù)這38個蛋白所參與的代謝途徑和生化功能將它們歸納成以下類群： 碳代謝途徑相關(guān)的蛋白質(zhì)有甘油醛-3-磷酸脫氫酶(B308，K328)和羧甲烯丁烯羥酸內(nèi)酯酶同系物(B559)； 光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)包括鐵氧還蛋白酶還原酶(B412，Y607)，PsbP結(jié)構(gòu)域蛋白6(B619)，類囊體腔15kDa蛋白1(B889)，葉綠素a-b結(jié)合蛋白8(K581)，類PsbP蛋白1(K774)，果糖二磷酸醛縮酶1(Y537)，類囊體內(nèi)腔19 kDa蛋白(Y875)和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCo)相關(guān)蛋白(K820，Y440，Y462，Y1172)； 能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)包括類DNA甲基化因子4(B728)，磷酸甘油酸激酶(K270)，蘋果酸脫氫酶(K342，Y579)，PNSL5(K742)，ATP 合成酶CF1ε亞基(K789)，磷酸甘油酸激酶(Y449)和碳酸酐酶(Y769)； 防御相關(guān)的蛋白質(zhì)包括過氧化物酶N1(K421)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(K607)，PR-5(K633)，GGAT(Y331)，PP2-B11(Y1039)和銅/鋅超氧化物歧化酶(Y1088)； 蛋白合成相關(guān)的蛋白質(zhì)包括2-亞甲基-3-呋喃酮還原酶(B330，Y535，Y538)和FKBP19(Y958)； 同時還有5個未知蛋白(B319，B531，K409，K427，Y637)．

圖2 煙葉樣品蛋白雙向電泳圖(13 cm，pH=3～10，12.5% SDS-PAGE)

圖3 雙向電泳圖譜差異點(diǎn)分析

表2 差異點(diǎn)選取

續(xù)表2

表3 差異表達(dá)蛋白的MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜結(jié)果

3 討 論

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)是糖酵解反應(yīng)中一種非常關(guān)鍵的酶，常用作研究其他基因和蛋白表達(dá)的內(nèi)參．隨著研究的深入，越來越多的試驗(yàn)證實(shí)GAPDH蛋白功能的多樣性，如GAPDH在植物中與各種環(huán)境的壓力表現(xiàn)出抗逆性有關(guān)[12]．有研究人員在分子水平上檢測到馬鈴薯的GAPDH基因受病原物侵染誘導(dǎo)表達(dá)[13]，并且在致病疫霉侵染馬鈴薯最初的24 h內(nèi)就有反應(yīng)[14]，本研究鑒定到的兩個甘油醛-3-磷酸脫氫酶(B308，K328)在受到病原菌侵染后均上調(diào)表達(dá)，也進(jìn)一步在蛋白水平上驗(yàn)證了GAPDH蛋白在病原菌侵染過程中發(fā)揮作用，另外，根據(jù)結(jié)果也可以得出在研究病菌侵染過程中GAPDH基因不適合作為基因表達(dá)的內(nèi)參．

本研究共鑒定到12個與光合作用有關(guān)的蛋白質(zhì)，其中有8個上調(diào)表達(dá)的蛋白： 鐵氧還蛋白酶還原酶(B412，Y607)，PsbP結(jié)構(gòu)域蛋白6(B619)，果糖二磷酸醛縮酶1(Y537)，類囊體內(nèi)腔19 kDa蛋白(Y875)，1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCo)相關(guān)蛋白(Y440，Y462，Y1172)； 4個下調(diào)表達(dá)的蛋白： 類囊體腔15kDa蛋白1(B889)，葉綠素a-b結(jié)合蛋白8(K581)，類PsbP蛋白1(K774)和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基(K820)．其中1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCo)是光合作用中的一個關(guān)鍵酶，本研究發(fā)現(xiàn)4個RuBisCo相關(guān)蛋白，其中在“K326”中鑒定到的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基在被赤星病菌侵染后下調(diào)表達(dá)，“云煙87”中有2個二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶2和1個二磷酸核酮糖羧化酶小鏈在被赤星病菌侵染后上調(diào)表達(dá)．光合作用是植物中最重要的代謝過程，赤星病侵染顯著影響光合作用的速率，RuBisCo作為光合作用中的一個關(guān)鍵酶，其表達(dá)量增加會增強(qiáng)光合作用以供給更多能量從而抵抗病毒侵染，而酶的減少表明植株在受到病菌侵染后光合作用下降，同時部分蛋白開始降解，植株開始逐漸衰弱，進(jìn)一步降低了對病原菌的抵抗能力，從而加速了植株的發(fā)病，這也表明了“云煙87”和“K326”對赤星病侵染的抗性不同．

本研究共鑒定到能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)8個，其中有6個上調(diào)表達(dá)的蛋白： 類DNA甲基化因子4(B728)，磷酸甘油酸激酶(K270)，蘋果酸脫氫酶(Y579)，PNSL5(K742)，磷酸甘油酸激酶(Y449)，碳酸酐酶(Y769)； 2個下調(diào)表達(dá)的蛋白蘋果酸脫氫酶(K342)和ATP 合成酶CF1ε亞基(K789)．ATP合成酶是參與能量代謝的關(guān)鍵酶，有研究提出病原菌的侵染初期，作為細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換核心酶的ATPase下調(diào)表達(dá)，表明煙草在被侵染初期電子傳遞和能量傳遞能力減弱，即在病原物侵染初期某些生理途徑被病原菌破壞，或被病原菌產(chǎn)生的降解酶和毒素抑制從而降低植株呼吸作用強(qiáng)度，觸發(fā)植物的主動抗病機(jī)制，是植株主動防御機(jī)制起作用的必要過程[15]．

本研究共鑒定到防御相關(guān)的蛋白質(zhì)6個，其中有4個上調(diào)表達(dá)的蛋白： 過氧化物酶N1(K421)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(K607)，PR-5(K633)和GGAT(Y331)； 2個下調(diào)表達(dá)的蛋白PP2-B11(Y1039)和銅/鋅超氧化物歧化酶(Y1088)．研究表明，在植物受到外界脅迫時，植株體內(nèi)的GST活性會顯著升高，以保護(hù)生物體免受逆境的損害[16]．本研究也鑒定到了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(K607)在感染赤星病后上調(diào)表達(dá)，與前期研究一致．本研究還鑒定到一個感染赤星病后上調(diào)表達(dá)的osmotin-like protein(K633)類滲調(diào)蛋白(OLP)，它屬于PR-5蛋白．PR-5蛋白包含了具有多種抗逆功能的滲調(diào)蛋白(osmotin)和類滲調(diào)蛋白(OLP)．有研究表明，馬鈴薯被致病疫霉(P.infestans)感染后能檢測到OLP蛋白的增加[17]．PR-5蛋白具有抗真菌、 抗凍和抗?jié)B透壓力等多種生物學(xué)活性，參與植物系統(tǒng)獲得性反應(yīng)(SAR)和超敏反應(yīng)(HR)，在植物抵御生物和非生物脅迫中具有重要作用[18]．當(dāng)受到病原侵害時植物可以產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性，發(fā)生系統(tǒng)獲得性抗性過程時植物的細(xì)胞內(nèi)會發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)，其中就包括PR蛋白表達(dá)．

綜上所述，在本研究中，接種病菌后煙草葉片中參與各個代謝過程的相關(guān)蛋白并不是呈現(xiàn)單一的變化趨勢，煙草的抗性機(jī)制是十分復(fù)雜的，涉及大量基因的誘導(dǎo)表達(dá)與調(diào)控，這些基因的表達(dá)結(jié)果往往導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變化．本研究得到了煙草對赤星病菌應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中表達(dá)量發(fā)生顯著變化的差異蛋白，但所得到的差異蛋白在應(yīng)答機(jī)制中的具體作用有待進(jìn)一步的深入研究．總之，煙草對赤星病抗性機(jī)制復(fù)雜，其中涉及眾多的信號物質(zhì)和抗性相關(guān)蛋白，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，將會有更多的抗性相關(guān)基因和蛋白被挖掘，進(jìn)而大大提高人們對煙草與赤星菌互作機(jī)理的認(rèn)識．