微環(huán)境下Wnt/β-catenin通路參與牙周膜干細(xì)胞骨向分化機(jī)制的研究進(jìn)展

沈振國，趙榮權(quán)，歐琳琳，周 檸 綜述 邢 田 審校

牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)以其多向分化的能力以及易于獲取的組織來源優(yōu)勢，成為非常理想的組織工程種子細(xì)胞，在牙周再生領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。然而，PDLSCs成骨分化能力受到多種因素的調(diào)控，其分化機(jī)制也是近年來的研究熱點(diǎn)，Wnt/β-catenin作為調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的重要信號途徑，在PDLSCs的分化中發(fā)揮重要的作用。

1 牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)特性

Seo et al于2004年成功從離體牙牙周組織中分離培養(yǎng)出PDLSCs，發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的克隆形成能力，及成牙骨質(zhì)、成神經(jīng)、成脂等多項分化能力，且高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)表面標(biāo)志物STRO-1和CD 146/MUC 18，可成為最具牙周組織修復(fù)潛力的干細(xì)胞之一。自Lindroos et al揭示PDLSCs成骨分化具有臨床應(yīng)用價值后，圍繞這方面的研究取得較大進(jìn)展。體外實驗采用含地塞米松、β-磷酸甘油和抗壞血酸的成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)PDLSCs，發(fā)現(xiàn)成骨相關(guān)基因表達(dá)升高，如堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、特異性Runt相關(guān)性轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor，Runx)2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)2、膠原蛋白(collagen，Col)Ⅰ、骨鈣素(osteocalcin，OCN)，細(xì)胞體外長期培養(yǎng)能夠形成鈣化結(jié)節(jié)。

PDLSCs遷移和增殖對修復(fù)缺損具有重要作用，而其遷移和增殖受細(xì)胞周圍環(huán)境、代謝產(chǎn)物、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子等的影響?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal cell derived factor，SDF)1、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)、和成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)2等細(xì)胞因子能夠促進(jìn)PDLSCs的增殖和遷移。

2 Wnt/β-catenin通路

1982年Nusser et al在小鼠乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了Integration-1(INT-1)基因。之后的研究表明，果蠅中的的無翅基因與INT-1基因功能類似，屬于同源基因，因此將二者并稱為Wnt基因，此基因調(diào)控的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)為Wnt通路。此通路對細(xì)胞的生長、分化以及募集等多種生物學(xué)過程發(fā)揮重要作用，且與腫瘤、炎性疾病和心血管疾病等密切相關(guān)。

Wnt通路由4部分組成：①細(xì)胞外的配體蛋白Wnt蛋白，由Wnt家族基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)而來；②細(xì)胞膜上的卷曲蛋白受體(frizzled，F(xiàn)zd)及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein，LRP)5/6；③細(xì)胞漿中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)部分；④細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控部分。

Wnt/β-catenin通路，即經(jīng)典Wnt通路：胞膜外配體Wnts蛋白與受體結(jié)合后，開啟通路的傳導(dǎo)并活化胞內(nèi)的蓬亂蛋白(dishevelled，Dsh/Dvl)從而降低由腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白(adenomatous polyosis coli，APC)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、Axin、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)等形成的降解復(fù)合體中關(guān)鍵成分GSK-3β的活性，進(jìn)而阻止β-catenin降解，使β-catenin積聚并轉(zhuǎn)移入核與胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(TCF/LEFs)結(jié)合，激活下游靶基因，引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)。

3 局部微環(huán)境調(diào)控Wnt通路影響PDLSCs成骨分化

3.1 炎癥微環(huán)境

Wnt/β-catenin通路在炎癥微環(huán)境中對PDLSCs的成骨起著重要的作用。慢性牙周炎患者炎癥牙齦和齦溝液中高表達(dá)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-33，體外實驗中牙齦卟啉單胞菌可活化牙齦上皮細(xì)胞高表達(dá)IL-33。IL-33可促進(jìn)增殖和克隆形成率，但是抑制ALP的活性和礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生，給予PNU(β-catenin抑制劑)的處理，可以恢復(fù)這種抑制效應(yīng)，表明IL-33通過Wnt/β-catenin通路調(diào)控PDLSCs的成骨分化潛力。

低濃度(≤1 μg/ml)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是否抑制PDLSCs成骨分化尚存爭議。Xing et al使用低濃度(0.5μg/ml)大腸桿菌LPS活化PDLSCs，發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin通路蛋白Cyclin和激活轉(zhuǎn)錄共刺激因子(transcriptional activator with a PDZ motif，TAZ)表達(dá)增高，成骨關(guān)鍵基因Runx 2、ALP、Col-Ⅰ表達(dá)增高，茜素紅染色顯示鈣化結(jié)節(jié)增多。降低TAZ同時可以降低LPS誘導(dǎo)的成骨增強(qiáng)作用。此外，阻斷Wnt/β-catenin通路可以抑制LPS引起的成骨分化。然而，文獻(xiàn)報道，高濃度LPS(≥10μg/ml)可顯著抑制PDLSCs增殖和成骨分化，同時促進(jìn)炎性因子表達(dá)，加重牙周組織的損傷?？梢姡琇PS通過Wnt/β-catenin通路調(diào)控干細(xì)胞成骨分化作用依賴LPS濃度。

Peng et al體外分離培養(yǎng)患者的PDLSCs，發(fā)現(xiàn)源自牙周炎患者炎癥組織的細(xì)胞較正常受試者，其成骨分化能力明顯降低。長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)可能參與Wnt信號通路的調(diào)控來調(diào)節(jié)干細(xì)胞成骨分化能力。在PDLSCs成骨分化過程中，ALP、Runx 2和成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體(osterix，OSX)的表達(dá)增加，而lncRNA-ANCR的表達(dá)減少。lncRNA-ANCR可能通過抑制microRNA(miR)-758，進(jìn)一步激活Notch2/Wnt/β-catenin通路，從而抑制PDLSCs成骨分化。

Wang et al分離培養(yǎng)牙周炎患者炎癥局部PDLSCs，高通量測序發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，lncRNA-POIR顯著降低。lncRNA-POIR作為顯著的促進(jìn)成骨的基因，可能作為miR-182的競爭性內(nèi)源性RNA，調(diào)控其靶基因FoxO1表達(dá)，繼而，F(xiàn)oxO1通過與TCF-4競爭β-catenin，抑制經(jīng)典Wnt通路，增加其成骨分化。然而，Wnt通路參與調(diào)控成骨可能與其他信號通路存在串聯(lián)關(guān)系，如NF-кB。炎癥通過NF-кB通路增加miR-182的表達(dá)，同時miR-182在炎癥微環(huán)境中的過表達(dá)導(dǎo)致了lncRNA-POIR/miR-182調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的失衡。

3.2 高糖微環(huán)境

體外試驗中，當(dāng)暴露于高糖環(huán)境時，PDLSCs產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)，成骨能力降低。清除ROS可激活PI3K/Akt進(jìn)而促使β-catenin入核結(jié)合TCF/LEF，阻斷高糖介導(dǎo)的PDLSCs成骨抑制。這表明高糖環(huán)境使PDLSCs內(nèi)產(chǎn)生氧化損傷，通過抑制PI3K/Akt/Wnt/β-catenin通路抑制其成骨分化。

糖尿病大鼠牙周膜組織DNA甲基化水平升高，牙槽骨骨量和密度降低。體外實驗，高糖處理PDLSCs可降低β-catenin、p-GSK-3β和LEF 1表達(dá)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-2-脫氧胞苷(5-Aza-DC)，可降低PDLSCs DNA甲基化水平，并挽救了PDLSCs在高糖環(huán)境下降低的成骨分化。然而，采用Wnt通路的拮抗劑Dickkopf相關(guān)蛋白(Dickkopf-related protein，DKK)-1，可以阻斷5-Aza-DC在高糖中對細(xì)胞成骨分化的保護(hù)作用。這一研究首次提出，在高糖環(huán)境下，抑制DNA甲基化可通過Wnt信號通路促進(jìn)PDLSCs的成骨分化。以上研究表明，糖尿病導(dǎo)致的PDLSCs 成骨分化能力降低可能是通過DNA甲基化抑制Wnt/β-catenin通路造成的。

然而，體外將PDLSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，用晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)處理細(xì)胞，細(xì)胞成骨能力降低，表現(xiàn)出ALP活性降低，礦化結(jié)節(jié)形成減少，成骨特異性基因Runx 2、OSX、ALP、OPN、Col-Ⅰ和OCN表達(dá)下調(diào)。經(jīng)典Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV-939部分挽救了AGE誘導(dǎo)的PDLSCs成骨潛能的抑制。可見AGEs激活了經(jīng)典Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)了β-catenin的核轉(zhuǎn)位，從而減弱了PDLSCs的成骨分化能力。

3.3 生物應(yīng)力

用循環(huán)液壓模擬生理性的咀嚼，壓力刺激下乳牙PDLSCs成骨能力受抑制。在循環(huán)液壓下，乳牙PDLSCs中α7煙堿型乙酰膽堿受體(alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors，α7 nachr)被激活，GSK-3β去磷酸化，激活Wnt/β-catenin通路，核因子кB受體活化因子配體(receptor activator of NK-κB ligand，RANKL)上調(diào)、Runx 2、ALP和骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)的降低，PDLSCs表現(xiàn)出誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的能力。抑制α7 nachr或Wnt/β-catenin通路可逆轉(zhuǎn)成骨抑制。

然而，PDLSCs在液壓壓力模擬的正畸力的作用下成骨分化，且短期作用(1 h)較長期作用(12 h)的成骨效應(yīng)較強(qiáng)。在力的作用下，PDLSCs中的GSK-3β磷酸化，活化β-catenin入核，激活Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)PDLSCs成骨分化。這可能與PDLSCs不同年齡來源(乳牙和恒牙)相關(guān)?？梢娫赑DLSCs分化的不同階段，生物應(yīng)力作用下的Wnt/β-catenin通路起到正向或負(fù)向的調(diào)控作用，以滿足機(jī)體發(fā)育的不同階段的需求。

3.4 藥物

阿奇霉素(azithromycin，AZM)結(jié)合非手術(shù)牙周療法可緩解臨床癥狀，同時抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收。體外試驗中，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α活化PDLSCs致使ALP活性降低，鈣化結(jié)節(jié)減少。AZM的加入使得降低PDLSCs成骨分化能力得到回升。同時β-catenin、磷酸化p65和磷酸化IκB-α蛋白表達(dá)下降。這表明，AZM通過同時抑制Wnt/β-catenin和NF-κB通路，促進(jìn)PDLSCs在炎癥微環(huán)境中的成骨分化。

積雪草苷(asiaticoside，AC)可促進(jìn)傷口愈合，具有抗炎、抗氧化和抗?jié)兊幕钚?。體外實驗中，AC可促進(jìn)PDLSCs成骨分化，能夠顯著上調(diào)PDLSCs中Wnt 3a基因的表達(dá)，并呈劑量依賴性(最適濃度100 μmol/L)，同時抑制Wnt的負(fù)調(diào)節(jié)因子Axin 2，激活Wnt/β-catenin通路，進(jìn)而誘導(dǎo)OSX和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(dentin matrix protein，DMP)1表達(dá)，促進(jìn)PDLSCs成骨分化。

作為胰高血糖素樣肽-1類似物，腸促胰島素類似物(exendin-4，Ex-4)在細(xì)胞和分子水平上都具有快速的抗炎作用，對MSCs成骨分化有積極的影響。Ex-4同樣增強(qiáng)PDLSCs的成骨分化能力，Ex-4處理使細(xì)胞核與細(xì)胞漿的β-catenin蛋白表達(dá)均上調(diào)，GSK-3β磷酸化增加，Wnt/β-catenin通路激活，同時促進(jìn)IκBα磷酸化來抑制NF-κB通路的活化。Ex-4亦可以通過相同機(jī)制減輕高濃度LPS(10μg/ml)對PDLSCs的成骨分化抑制作用。

吸煙已被公認(rèn)為牙周炎的獨(dú)立危險因素之一，煙草的有效成分尼古丁可以抑制膠原合成、破壞上皮結(jié)構(gòu)，引起牙周局部組織損傷。尼古丁對PDLSCs的成骨分化的抑制作用具有劑量依賴性。尼古丁處理可激活α7 nachr從而激活Wnt/β-catenin通路，抑制PDLSCs成骨。分別抑制α7 nachr和Wnt/β-catenin通路可挽回受抑制的PDLSCs成骨分化。

3.5 生物支架

近年來隨著種植技術(shù)臨床應(yīng)用增多，研究者多聚焦于傳統(tǒng)材料的改良和新型材料的研發(fā)。體外實驗中，將PDLSCs培養(yǎng)于聚苯乙烯(TCPS)上，和四種沒有骨誘導(dǎo)因子的鈦盤[光滑的拋光處理(PT)、親水性拋光處理(pmodPT)、粗糙噴砂-大顆粒-酸蝕(sandblasted，large-grit，acid-etched，SLA)和親水性(mod)SLA]，然后檢測成骨活性。與TCPS和其他鈦表面相比較，培養(yǎng)在SLA上的細(xì)胞出現(xiàn)較高的成骨活性。SLA和modSLA上培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)Wnt3a和β-catenin，但在PT和pmodPT上細(xì)胞卻高表達(dá)鈣依賴性Wnt信號分子Wnt5a、鈣調(diào)素；此外，不同的表面修飾也會改變細(xì)胞整合素α2/β1、sonic hedgehog和Notch信號分子的表達(dá)。總之，表面粗糙度和親水性可以影響不同的Wnt通路和信號分子參與調(diào)控PDLSCs的成骨分化。

Mao et al以α-磷酸三鈣顆粒為前驅(qū)體，在水溶液中通過水熱反應(yīng)制備了具有微納米雜化表面的羥基磷灰石(HA)生物陶瓷(mnHA)，與具有平坦致密表面的HA生物陶瓷相比，mnHA生物陶瓷能夠促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖、ALP活性以及成骨/成牙骨質(zhì)基因的表達(dá)。此外，mnHA生物陶瓷還能引起經(jīng)典Wnt信號通路中LRP5和β-catenin的表達(dá)上調(diào)。DKK-1可抑制ALP活性和ALP、OCN、CAP、CEMP和Runx 2基因的表達(dá)?？梢姡軌虺蔀檠乐芙M織再生的材料mnHA通過Wnt通路促進(jìn)成骨/成牙骨質(zhì)。