生防枯草芽孢桿菌B29對黃瓜根際功能細(xì)菌及土壤酶活性的影響

高吉坤，孫雨薇，曹 旭，于麗萍，李 晶*

(1.長春恒晨生物科技有限責(zé)任公司，吉林長春 130000;2.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150080;3.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱 150010)

土壤是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)與能量交換的樞紐，而土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的功能群體，擔(dān)負(fù)維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定、加快土壤生態(tài)系統(tǒng)中養(yǎng)分的循環(huán)和提高土壤對不良環(huán)境的抵御能力，也是預(yù)防土傳病害的關(guān)鍵所在［1］。土壤中一切物質(zhì)轉(zhuǎn)化都有酶的參與。土壤酶大部分來自于土壤微生物，因此與土壤微生物有密切關(guān)系。影響土壤微生物活性的因素也必然影響酶的活性。

枯草芽孢桿菌B29菌株不僅對黃瓜枯萎病具有明顯的防治效果，而且灌根施用后可使黃瓜根際土壤向“細(xì)菌型”土壤轉(zhuǎn)化［2］。在此基礎(chǔ)上，筆者又探討了該菌株對黃瓜根際幾種主要功能細(xì)菌和土壤酶活力的影響，為枯草芽孢桿菌B29菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供微生態(tài)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 枯草芽孢桿菌B29菌液的制備?？莶菅挎邨U菌B29是由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所在黃瓜根圍土壤中分離、純化、保存。將活化好的枯草芽孢桿菌B29菌株按2%接種量轉(zhuǎn)接于50 ml的NYD液體培養(yǎng)基中，30℃150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，采用平板稀釋計(jì)數(shù)法測定菌數(shù)為5.75×108cfu/ml，備用。

1.1.2 供試植株。哈爾濱市群力開發(fā)區(qū)小西屯保護(hù)地春季移栽黃瓜。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)處理。春季黃瓜移栽時(shí)，隨機(jī)分為3組。①生防菌B29菌劑處理組，將B29菌原液稀釋至5.75×107cfu/ml，灌根處理，每株灌根250 ml，共處理60株;②化學(xué)農(nóng)藥處理組，將濃度75%百菌清4 g加水稀釋至25 L，灌根處理，每株灌根250 ml，共處理60株;③空白對照組，每株黃瓜用清水灌根250 ml，共處理60株。

自黃瓜移栽當(dāng)天算起，移栽后10、20、30、40 d分別取土樣。將植株根圍表土除去，取3～6 cm深且靠近植株根系土壤約40 g。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)采取10株黃瓜根際土樣，分別裝到已消毒的封口袋中，做好標(biāo)記，－20℃保存，待測。

1.2.2 黃瓜根際部分功能細(xì)菌數(shù)量的測定。

1.2.2.1 氨氧化細(xì)菌數(shù)量的測定。先將氨氧化細(xì)菌培養(yǎng)液加到試管中，每個(gè)試管加5 ml，共25個(gè)試管，再將已稀釋好的土壤菌懸液(5個(gè)梯度，每個(gè)梯度5次重復(fù))1 ml加到裝有培養(yǎng)液的試管中，放在28～30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28 d后，向每只試管中滴入Griess.Ilosvay試劑1～2滴，若由紅色變?yōu)楹稚?，則說明該試管中有氨氧化細(xì)菌生長，采用最大或然數(shù)法計(jì)算出土壤樣品中氨氧化細(xì)菌數(shù)量。

1.2.2.2 亞硝酸氧化細(xì)菌數(shù)量的測定。先將亞硝酸氧化細(xì)菌培養(yǎng)液加到試管中，每個(gè)試管加5 ml，共25個(gè)試管，再將已稀釋好的土壤菌懸液(5個(gè)梯度，每個(gè)梯度5個(gè)重復(fù))1 ml加到裝有培養(yǎng)液的試管中，放在28～30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d后，向試管中加0.3 ml濃硫酸和0.3 ml硫酸聯(lián)苯胺溶液，若呈現(xiàn)深藍(lán)色，則說明沒有發(fā)生脫氮作用，記錄變色試管數(shù)，采用最大或然數(shù)法計(jì)算出土壤樣品中亞硝酸氧化細(xì)菌數(shù)量。

1.2.2.3 好氣性纖維素分解菌數(shù)量的測定。先將好氣性纖維素分解菌培養(yǎng)液加到試管中，每個(gè)試管加5 ml，共25個(gè)試管，再將已稀釋好的土壤菌懸液(5個(gè)梯度，每個(gè)梯度5次重復(fù))1 ml加到裝有培養(yǎng)液的試管中，然后將備用的濾紙貼于試管內(nèi)壁，一半浸入培養(yǎng)液內(nèi)，一半在培養(yǎng)液外，放在28～30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，觀察且記錄結(jié)果，而后按稀釋比率法計(jì)數(shù)。

1.2.3 黃瓜根際部分土壤酶活性的測定。脲酶采用苯酚鈉次氯酸鈉顯色法測定;過氧化氫酶活性采用滴定法測定法測定;酸性磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定;蔗糖酶活性采用 3，5－二硝基水楊酸比色法測定［3］。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際功能細(xì)菌數(shù)量變化

2.1.1 氨氧化細(xì)菌。氨氧化細(xì)菌又被稱亞硝酸細(xì)菌，是土壤中氮素轉(zhuǎn)化的重要參與菌株。它可將氨氧化成亞硝酸，是硝化作用的第一步，也是限速步驟。氨氧化細(xì)菌是土壤中氮素循環(huán)的關(guān)鍵氧化物質(zhì)，在土壤氮素轉(zhuǎn)化中有著不可替代的作用［4］。

由圖1可知，在黃瓜移栽后10、20 d時(shí)，經(jīng)枯草芽孢桿菌B29菌劑處理過的黃瓜根際土壤中氨氧化細(xì)菌數(shù)量高于對照組，且差異在0.01水平顯著;百菌清藥液處理后黃瓜根際的氨氧化細(xì)菌數(shù)量在第10天時(shí)明顯低于對照組，且差異在0.01水平顯著。比較化學(xué)殺菌劑處理組與菌劑處理組根際氨氧化細(xì)菌數(shù)量，可以看出在黃瓜移栽后10、20 d，生防菌劑處理組數(shù)量要明顯高于化學(xué)農(nóng)藥處理組，差異在0.01水平顯著。在處理第30、40天時(shí)，氨氧化細(xì)菌數(shù)量在各處理組間已無明顯差異，此時(shí)氨氧化細(xì)菌數(shù)量已基本不受百菌清藥液的影響，枯草芽孢桿菌B29菌劑處理組此時(shí)對氨氧化細(xì)菌的生長已無明顯的促進(jìn)作用。由此可知，枯草芽孢桿菌B29的施加在黃瓜生長前期可以促進(jìn)黃瓜根系土壤中氨氧化細(xì)菌的生長，并且能及時(shí)地供給植物所需氮素，促進(jìn)植物的生長;化學(xué)殺菌劑的施加不利于氨氧化細(xì)菌的生長，在施加一段時(shí)間后氨氧化細(xì)菌數(shù)量已基本恢復(fù)到初始時(shí)的數(shù)量。

2.1.2 亞硝酸氧化細(xì)菌。亞硝酸氧化細(xì)菌又稱硝酸細(xì)菌，可將土壤中的亞硝酸鹽氧化成可被植物吸收利用的硝酸鹽，進(jìn)而提高了土壤中可被利用氮素的含量。圖2為不同處理組黃瓜根際土壤中亞硝酸細(xì)菌在不同時(shí)間的數(shù)量變化。從生防菌B29菌劑處理后的10、20 d的測定結(jié)果可以看出，生防菌B29菌劑處理過的黃瓜根際土壤中亞硝酸氧化細(xì)菌要明顯高于其他兩組，且差異在0.01水平顯著，說明短時(shí)間內(nèi)生防菌B29施加能促進(jìn)黃瓜根系土壤中亞硝酸細(xì)菌的生長;在10、20 d時(shí)，化學(xué)殺菌劑處理組的亞硝酸細(xì)菌數(shù)量要明顯低于生防菌B29處理組，且差異在0.01水平顯著;與對照組相比，在10、20 d時(shí)化學(xué)農(nóng)藥處理組亞硝酸氧化細(xì)菌數(shù)量要低于空白組，在10 d時(shí)亞硝酸氧化細(xì)菌數(shù)量明顯低于空白組，且差異在0.05水平顯著，由此可知化學(xué)農(nóng)藥的施加會(huì)抑制亞硝酸氧化細(xì)菌的生長;在處理30 d后，各組差異不顯著，此時(shí)生防菌B29和化學(xué)農(nóng)藥對亞硝酸氧化細(xì)菌的影響已基本解除。

2.1.3 好氣性纖維素分解菌。好氣性纖維素分解菌是土壤中一種主要的功能細(xì)菌。它可將纖維素分解成葡萄糖，增加土壤中有機(jī)碳的含量，分解產(chǎn)物葡萄糖可被作物根系吸收利用。纖維素分解菌的數(shù)量可以從側(cè)面反映土壤中有機(jī)碳源的含量，是土壤肥力的一個(gè)生物指標(biāo)。

圖3表示不同處理黃瓜根際土壤中好氣性纖維素分解菌的數(shù)量隨時(shí)間變化的趨勢。在施加生防菌后第10、20天測得的好氣性纖維素分解菌的數(shù)量均高于其他兩組，且差異在0.05水平顯著，隨著好氣性纖維素菌數(shù)量的增多，土壤內(nèi)有機(jī)碳含量也會(huì)相應(yīng)增加，土壤肥力提高，同時(shí)為植物提供生長所必需的養(yǎng)分，促進(jìn)植物的生長;在處理30 d后，各處理組好氣性纖維分解菌數(shù)量差異不顯著，此時(shí)生防菌B29菌劑對好氣性纖維分解菌已無影響。在處理后不同時(shí)間段，化學(xué)殺菌劑處理組的好氣性纖維分解菌數(shù)量均與對照組無差異。

2.2 不同處理后黃瓜根際土壤酶活性變化

2.2.1 脲酶。脲酶是氮轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶。它主要來源于微生物和植物代謝，其活性的變化主要取決于土壤中氮元素的含量［5］。

不同處理對土壤中脲酶活性的影響見圖4。生防菌B29菌劑的施加能促進(jìn)提高脲酶活性，在處理后第10、20天生防菌B29處理組脲酶活性高于其他2個(gè)處理組，且差異均在0.01水平顯著，說明生防菌B29的施加在黃瓜生長前期有利于提高脲酶活性;化學(xué)殺菌劑處理組土壤中脲酶活性在黃瓜生長前期(移栽后10、20 d)在0.01水平顯著低于生防菌劑處理組和對照組，在黃瓜生長后期(移栽后30～40 d)化學(xué)殺菌劑處理組與其他兩組中的脲酶活性已無明顯差異，此時(shí)化學(xué)殺菌劑和生防菌B29對脲酶活性都已無明顯影響，說明化學(xué)殺菌劑在黃瓜生長前期(移栽后10、20 d)內(nèi)會(huì)降低土壤中脲酶活性，后期脲酶活性恢復(fù)到與對照組基本一致的水平。

2.2.2 過氧化氫酶。過氧化氫酶是一種穩(wěn)定的氧化物分解酶，能將過氧化氫分解成水和氧氣，進(jìn)而解除過氧化氫對植物的毒害作用。不同處理對土壤中過氧化氫酶活性的影響見圖5。在施加生防菌B29后，黃瓜根際土壤中過氧化氫酶活性在短期內(nèi)(10、20 d)在0.01水平顯著高于空白對照組和百菌清藥液處理組，且為百菌清藥液處理組酶活性的1.7倍以上;隨著黃瓜的生長發(fā)育，生防菌B29處理組的土壤中過氧化氫酶活性略有下降;在施用30 d后，生防菌B29處理組與其他2組相比差異均不顯著，此時(shí)生防菌B29對土壤中過氧化氫酶活性已無顯著影響;百菌清藥液處理后10 d，黃瓜根際土壤中過氧化氫酶活性在0.01水平顯著低于空白對照組。由此可知，枯草芽孢桿菌B29菌劑對黃瓜根際過氧化氫酶活性的提高有促進(jìn)作用，而化學(xué)殺菌劑則對黃瓜根際過氧化氫酶活性有較明顯的抑制作用。

2.2.3 蔗糖酶。蔗糖酶又稱“轉(zhuǎn)化酶”，是糖苷酶之一，可將蔗糖催化為果糖和葡萄糖的一種分解酶，廣泛存在于微生物和動(dòng)植物體內(nèi)，主要受溫度、底物濃度的影響。從圖6可以看出不同處理對土壤中蔗糖酶活性的影響。在黃瓜生長初期(10、20 d)，生防菌B29處理組測蔗糖酶活性要明顯高于其他2組處理，且差異在0.01水平顯著，說明生防菌B29菌劑施加一定時(shí)間(20 d)內(nèi)可以提高土壤中蔗糖酶的活性;在黃瓜生長初期(10 d)，施加化學(xué)殺菌劑組土壤中蔗糖酶活性在0.05水平顯著低于空白組中蔗糖酶活性，說明化學(xué)殺菌劑的施加抑制了蔗糖酶活性，不利于植物根系的養(yǎng)分吸收。隨著處理后時(shí)間的推移，生防菌B29和化學(xué)殺菌劑對黃瓜根際蔗糖酶活性的影響均不再體現(xiàn)。

2.2.4 磷酸酶。土壤中的磷酸酶是一類能參與土壤中有機(jī)磷化合物合成的一種酶，其活性主要由土壤中微生物數(shù)量、種類及植被所影響。磷酸酶活性是鑒定土壤肥力一項(xiàng)重要指標(biāo)。從圖7可以看出，在施加生防菌B29后30 d內(nèi)磷酸酶活性在0.01水平顯著高于其他兩組，說明生防菌的施加促進(jìn)土壤內(nèi)無機(jī)磷鹽的溶解，提高土壤肥力，進(jìn)而緩解植物在生長期對磷元素的需求;在施用40 d時(shí)，磷酸酶活性與空白組相比無差異，說明此時(shí)生防菌B29已不再影響磷酸酶活性。施加化學(xué)殺菌劑組的磷酸酶活性在10 d時(shí)在0.01水平顯著低于空白組，此時(shí)化學(xué)農(nóng)藥對磷酸酶活性有明顯的抑制作用，但在以后的時(shí)間段(20、30、40 d)其酶活性與空白組無差異。

3 討論

研究表明，施加枯草芽孢桿菌B29后，前期(10、20 d)土壤內(nèi)氨氧化細(xì)菌數(shù)量要明顯高于空白組，后期(30、40 d)其數(shù)量與對照組基本一致。亞硝酸氧化細(xì)菌、好氣性纖維素分解菌變化規(guī)律亦是如此。由此可知，枯草芽孢桿菌B29的施加能促進(jìn)黃瓜根際土壤中功能細(xì)菌的生長。化學(xué)殺菌劑處理組土壤中氨氧化細(xì)菌、亞硝酸細(xì)菌的數(shù)量在前期(10、20 d)時(shí)在0.05水平顯著低于空白組。該結(jié)果與張桂山［6］在多菌靈、呋喃丹對湖南紅壤土壤微生物和酶活性效應(yīng)的研究結(jié)果一致，即施加多菌靈后的一段時(shí)間內(nèi)對土壤中硝化細(xì)菌生長有明顯的抑制作用;好氣性纖維素分解菌則受影響不大，在整個(gè)生長周期中與空白組數(shù)量差異不顯著。由此可知，化學(xué)殺菌劑的施加對土壤中部分功能細(xì)菌的生長有抑制作用。

而施加枯草芽孢桿菌B29有利于提高土壤中脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶的活性，且這些土壤酶活性隨時(shí)間的變化趨勢基本一致，均為先升高后降低。該結(jié)果與王輝［7］辣椒疫病生防ASD菌株對土壤微生態(tài)調(diào)控機(jī)理研究結(jié)果基本一致，即ASD菌株施加到辣椒根圍土壤后，土壤脲酶活性、酸性磷酸酶活性、蔗糖酶活性及脫氫酶活性均有不同程度的提高，只有過氧化氫酶活性提高不顯著。羅珍等［8］在接種AM真菌對玉米秸稈降解及土壤微生物量碳、氮和酶活性的影響中指出，接種AF真菌到玉米根際，對土壤中酸性磷酶、過氧化氫酶活性和蛋白酶活性均有顯著提高，形成明顯不同于非根際的微生物區(qū)系。劉慧芬［9］在刺槐根瘤固氮菌放氫對根際土壤微生物的影響研究中發(fā)現(xiàn)，刺槐根瘤固氮放氫能提高土壤微生物代謝強(qiáng)度，脫氫酶、過氧化氫酶、脲酶、轉(zhuǎn)化酶等土壤酶活性有顯著的升高。魏海燕［10］在枯草芽孢桿菌、春雷霉素對黑土微生物的生態(tài)影響中指出，各質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理的春雷霉素對土壤中的細(xì)菌、真菌和放線菌均有促進(jìn)生長的作用，且25 000、50 000 mg/kg處理組的促進(jìn)作用最為明顯，由此得知生防菌的施加有利于土壤酶活性的提高，間接地促進(jìn)微生物生長，增加土壤中微生物的生物量，對土壤肥力的提高、健康程度的增加都有積極的促進(jìn)作用。研究中，化學(xué)殺菌劑百菌清施用后10、20 d，黃瓜根際土壤脲酶活性要顯著低于空白組，過氧化氫酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶活性在處理10 d時(shí)在0.05水平顯著低于空白組，說明化學(xué)殺菌劑對土壤酶活性有抑制作用。土壤酶活性是土壤質(zhì)量的主要參數(shù)之一。土壤酶活性降低也間接導(dǎo)致土壤質(zhì)量肥力變差，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)盡量避免施加化學(xué)殺菌劑，以減少其帶來的危害。

由此可知，生防菌不僅抑制病菌的繁殖，而且可以有效改善作物根際微生態(tài)環(huán)境。它作為植保新途徑為生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展注入新活力。

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