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    林可霉素發(fā)酵培養(yǎng)基原材料替代

    2021-11-10 05:55:44丁立波
    科學與生活 2021年21期
    關(guān)鍵詞:林可霉素培養(yǎng)基

    丁立波

    摘要:通過使用當?shù)匾椎玫霓r(nóng)副產(chǎn)品替代搖瓶培養(yǎng)基中的低溫黃豆餅粉,接種后培養(yǎng)檢測發(fā)酵最終的效價,在亞麻粕、高粱蛋白粉、葵粕中優(yōu)選出葵粕具有替代的可行性。結(jié)果表明在發(fā)酵生產(chǎn)中使用有機氮源葵粕按0.95:1比例替代配方中的低溫黃豆餅粉,可提高林可霉素A效價2.2%,原材料成本每月可節(jié)約50.7萬元。尤其可大幅提高最終成品質(zhì)量,發(fā)酵液中降低雜質(zhì)林可霉素B效價24.1%。

    關(guān)鍵詞:林可霉素、培養(yǎng)基、有機氮源

    林可霉素為林可酰胺類抗生素,是由林可酰胺(Lincosamide,LSM)和丙基輔氨酸(Propylproline,PPL)兩部分縮合后修飾而成,丙基輔氨酸是由L-酪氨酸合成而來[1]。實際生產(chǎn)中也需要使用大量的低溫黃豆餅粉補加,來補充發(fā)酵培養(yǎng)過程中的有機氮源,供菌體生長及產(chǎn)抗利用。通過使用本地較豐富、價格低廉的高粱蛋白粉、亞麻籽粉、葵粕按照粗蛋白含量等量換算替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的低溫黃豆餅粉從理論上是可行的。

    1.材料與方法

    1.1.菌種

    林可霉素生產(chǎn)菌林肯鏈霉菌(菌LK20-14)由寧夏泰益欣生物科技有限公司菌種中心提供。

    1.2.培養(yǎng)基

    1)斜面培養(yǎng)基(%,W/V):低溫黃豆餅粉0.62,淀粉2.1,KNO32,NaCl0.06,K2HPO40.06,MgSO4·7H2O0.06,F(xiàn)eSO4·7H2O0.002,pH7.0~7.5;

    2)搖瓶種子培養(yǎng)基(%,W/V):低溫黃豆餅粉2,淀粉2.1,葡萄糖1.1,(NH4)2SO40.2,CaCO30.5,pH7.0;

    3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基(%,W/V):低溫黃豆餅粉3.1,葡萄糖10.5,玉米漿0.32、(NH4)2SO40.82,NaCl0.60,K2HPO40.02,NaNO30.82,CaCO30.81,pH7.0,

    1.3.實驗方法

    1)斜面培養(yǎng):玻璃棒沾取菌懸液,在斜面培養(yǎng)基涂抹均勻,培養(yǎng)溫度29~31℃,相對濕度16%~24%的環(huán)境下倒置,培養(yǎng)7~8d。

    2)搖瓶種子培養(yǎng):從斜面挑取單菌落接種搖瓶,培養(yǎng)基裝量30mL/300mL三角瓶,培養(yǎng)溫度29~31℃,相對濕度15%~25%,搖床轉(zhuǎn)速220r/min條件下培養(yǎng)48~52h。

    3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):待種子到培養(yǎng)周期后,將種子接入發(fā)酵搖瓶,培養(yǎng)基裝量35mL/300mL三角瓶,培養(yǎng)溫度29~31℃,相對濕度15%~25%,搖床轉(zhuǎn)速220r/min條件下培養(yǎng)72h。

    4)放大培養(yǎng):150kL機械攪拌發(fā)酵罐,29.5~30.5℃、罐壓0.025~0.035MPa、接種量40%培養(yǎng)。

    2.實驗結(jié)果

    2.1.低溫黃豆餅粉替代物的優(yōu)化選擇

    低溫黃豆餅粉為有機氮源,含有豐富的粗蛋白、有機磷,本次實驗選用的三種替代物料依據(jù)粗蛋白含量計算替代物使用量,其中高粱蛋白粉、葵粕(浸提)按1:1量替代,亞麻粕1.3:1替代相應比例的低溫黃豆餅粉。綜合發(fā)酵單位及成本,葵粕(浸提)市場供應充足、價格低廉、替代后發(fā)酵單位林可霉素A組分較好。選定葵粕(浸提)為最佳低溫黃豆餅粉替代原材料。

    2.2.葵粕最佳替代比例確定

    由粗蛋白含量確定替代比例,但某些氨基酸及維生素含量差異需要實驗不同比例替代對發(fā)酵單位的影響,實驗驗證全部替代低溫黃豆餅粉所需的葵粕量,由下圖可以看出,當葵粕的替代比例為0.95:1時,發(fā)酵單位可達到最高,觀察搖瓶菌絲形態(tài)及發(fā)酵液離心濕重均正常。確定最佳替代比例葵粕:低溫黃豆餅粉為0.95:1。

    2.3.150kL發(fā)酵罐大生產(chǎn)放大實驗

    為檢驗搖瓶實驗結(jié)果在發(fā)酵大生產(chǎn)中的效果,依據(jù)搖瓶替代比例,在發(fā)酵生產(chǎn)中按0.95:1使用葵粕替代四級發(fā)酵罐培養(yǎng)基中的低溫黃豆餅粉,連續(xù)進十批實驗驗證。

    從表4可以看出,替代后的平均發(fā)酵單位A組分效價較未替代前的平均單位高2.2%,使用葵粕較低溫黃豆餅粉價格成本低,月可為車間節(jié)約50.7萬元。產(chǎn)品質(zhì)量有較大提升,其中B組分效價替代后有較大幅度下降,發(fā)酵放罐B組分下降24.1%。

    3.討論

    由表1葵粕的粗蛋白含量與低溫黃豆餅粉含量相同,通過粗蛋白含量等量換算可以有效替代有機氮源,因其中氨基酸和其他物質(zhì)含量的不同,對林可霉素發(fā)酵單位有不同影響,需要適當調(diào)整替代比例,最佳替代比例為0.95:1。

    林可霉素生物合成中的所有甲基化作用均以甲硫氨酸作為甲基供體,在蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的催化下,蛋氨酸與ATP作用,生成S腺苷蛋氨酸(SAM)。SAM中的甲基十分活潑,稱活性甲基,SAM稱活性蛋氨酸。SAM在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下,可將甲基轉(zhuǎn)移給另一物質(zhì),使甲基化[3][4]。葵粕蛋氨酸及膽堿含量相對低溫黃豆餅粉較高,為林可霉素A生物合成中三個甲基化步驟提供了較多的甲基供體。本次使用葵粕替代即降低了發(fā)酵罐培養(yǎng)基的物料成本,又降低了雜質(zhì)組分林可霉素B的含量。

    參考文獻

    [1]劉瑞華.林可霉素生物合成的研究進展[J].微生物學通報,2018,45(05):1138-1145.

    [2]中國飼料數(shù)據(jù)庫.FeedStuff(2017)常規(guī)飼料成分[EB/OL].http://www.chinafeeddata.org.cn/picture/pdf/CFICout2017_1.pdf

    [3]Ushimaru R,Lin CI,Sasaki E,et al.Characterization of enzymes catalyzing transformations of cysteine S-conjugated intermediates in the lincosamidebiosynthetic pathway[J].ChemBioChem,2016,17(17):1606-1611

    [4]Hou BB,Lin YW,Wu HZ,et al.The novel transcriptional regulator lmbU promotes lincomycin biosynthesis through regulating expression of its target genes in Streptomyces lincolnensis[J].Journal of Bacteriology,2018,200(2):e00447-17

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