黃皮白肉火龍果‘燕窩果’離體快繁技術(shù)研究

羅一然，韓國偉，毛春霞*

（1.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南大理 671003；2.紅河州林業(yè)和草原局，云南蒙自 661100）

‘燕窩果’（Hylocereus megalanthus）又名麒麟果，是一種黃皮白肉的火龍果，屬仙人掌科，為蛇鞭柱屬和量天尺屬自然雜交產(chǎn)生的四倍體植株，兼具兩屬的部分特征，大多數(shù)專家更傾向其為量天尺屬［1］，原產(chǎn)地為哥倫比亞與厄瓜多爾。燕窩果成熟時(shí)間較長，但其單果重量可達(dá)500 g，種子大而少，果肉半透明、細(xì)膩，籽外包裹著一層膠質(zhì)，口感細(xì)膩絲滑，果實(shí)甜度在17～22 度，富含維C 和膳食纖維及鐵元素，少量植物性蛋白及花青素，可食部分占總量的70%左右［2-5］。作為潛力巨大的新興水果，燕窩果具有豐富的營養(yǎng)和極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，單果售價(jià)可達(dá)一般紅皮紅肉火龍果的數(shù)十倍，其引入我國栽培的時(shí)間尚短，僅在我國海南、廣西、云南等地區(qū)少量種植，加快燕窩果的種植，將有效助力鄉(xiāng)村振興［6-7］。目前有關(guān)燕窩果的研究報(bào)告尚少，種苗稀缺，本地果的產(chǎn)量和質(zhì)量與進(jìn)口果相比尚有較大差距，一定程度上阻礙了其推廣。加快燕窩果良種繁育研究步伐，創(chuàng)新種苗繁育方法，是推動(dòng)燕窩果產(chǎn)業(yè)高效發(fā)展的關(guān)鍵。

燕窩果的傳統(tǒng)繁殖方法采用扦插和嫁接育苗［8］，由于扦插苗根系較弱［9］，生產(chǎn)上以嫁接繁殖為主。但嫁接育苗存在接穗的位置效應(yīng)和效率低等問題，限制了燕窩果規(guī)?；a(chǎn)。利用組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖系數(shù)高的特點(diǎn)，采集外植體進(jìn)行高效擴(kuò)繁，可以克服當(dāng)前燕窩果種苗少、成本高的難題，助力燕窩果的推廣。近年來對(duì)火龍果開展組織培養(yǎng)研究的報(bào)道逐漸增多，市場上主流的紅皮火龍果的組培快繁體系已不斷得到完善［10-14］，但有關(guān)黃皮火龍果的研究報(bào)道還較少，李羽佳等［15］通過種子無菌萌發(fā)的方式獲得黃皮火龍果嫩芽，再以萌芽為外植體進(jìn)行增殖擴(kuò)繁，獲得了長勢良好的生根苗，增殖系數(shù)達(dá)4.6，建立了較為高效的組培繁殖體系。程志號(hào)等［16］以‘麒麟果’實(shí)生苗萌發(fā)的莖段為外植體，研究了外植體不同的切割方法和接種方法對(duì)刺座芽萌發(fā)的影響，篩選了刺座芽誘導(dǎo)及生根培養(yǎng)基，結(jié)果表明：最適合的外植體切割方法為縱切，最適合誘導(dǎo)刺座芽的培養(yǎng)基為MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA，生根率最高的配方為1/2MS+0.1 mg/L NAA，生根率90%以上。以上研究均以黃皮火龍果的實(shí)生苗為外植體，無法完全保持原有品種的優(yōu)良性狀。因此，本項(xiàng)研究以優(yōu)良燕窩果嫩莖為外植體，建立燕窩果組織培養(yǎng)繁殖方法，可為快速繁育良種燕窩果種苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的材料為燕窩果嫁接苗，采自云南省紅河州火龍果種質(zhì)資源圃，栽植于溫室大棚內(nèi)。每年4 月和8 月左右抽生出嫩莖，待嫩莖抽生至10 cm 左右時(shí)，切取作為外植體材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌外植體材料獲得

（1）將從溫室大棚采集的幼嫩莖段帶回實(shí)驗(yàn)室，用洗潔精仔細(xì)清洗，毛刷刷洗易貯藏細(xì)菌的刺座部分，然后將外植體放置于燒杯中，流水沖洗1 h 后，再用濾紙吸干水分。（2）在超凈工作臺(tái)上以75%酒精、5%雙氧水和0.1%升汞組合消毒，設(shè)計(jì)L9（34）的正交試驗(yàn)，每種消毒劑消毒時(shí)間設(shè)置3 個(gè)水平，分別為：75%酒精5 s、10 s、20 s；5%雙氧水1 min、2 min、3 min；0.1%升汞3 min、4.5 min、6 min。（3）消毒完后用無菌水沖洗3 次，接種在MS 空白培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種5 瓶，每瓶2個(gè)外植體，重復(fù)3 次。置于培養(yǎng)室中，10 d 后觀察并統(tǒng)計(jì)污染率和褐化率。

1.2.2 增殖培養(yǎng)

將獲得的無菌外植體莖段切為2 cm 高的三棱柱狀，確保每個(gè)外植體有刺座，接種到添加有NAA 和TDZ 的MS 培養(yǎng)基中，激素濃度設(shè)計(jì)兩因素三水平，其中NAA 的3 個(gè)水平分別是0.5、1.0、1.5 mg/L；TDZ 的3 個(gè)水平分別是0.5、1.0、1.5 mg/L。共9 個(gè)處理，每個(gè)處理接種5 瓶，每瓶接種2 個(gè)外植體，重復(fù)3 次。接種30 d 后觀察并記錄增殖芽生長狀況，統(tǒng)計(jì)增殖率。待刺座芽長出1～2 cm 后，再將刺座芽切下轉(zhuǎn)接到相同培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖。

1.2.3 壯苗和生根培養(yǎng)

待增殖芽長至3～4 cm 后，將長勢良好的增殖芽從基部切下，接種于添加0.1 g/L 碳粉和不同濃度IBA（0.1、0.5 mg/L）、IAA（0.1、0.2 mg/L）、NAA（0.1、0.2 mg/L）的1/2MS 培養(yǎng)基，共6 種不同組合的試驗(yàn)，培養(yǎng)30 d 后觀察記錄不定芽和根的生長情況。每個(gè)處理接種5 瓶，每瓶接種2 顆組培苗，重復(fù)3 次。接種后每周觀察1 次，30 d 后根據(jù)生根數(shù)、不定芽與不定根長勢篩選出最適培養(yǎng)基。

1.2.4 煉苗移栽

當(dāng)小苗根長3.0 cm 以上，且苗高2～3 cm 時(shí)，即可進(jìn)行煉苗移栽。從培養(yǎng)室移至溫室大棚中放置5 d，打開瓶蓋再放置5 d，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至河沙∶園土∶珍珠巖體積比為1∶1∶1 混均基質(zhì)的穴盤中，基質(zhì)內(nèi)混合少量復(fù)合肥，澆透水。栽培30 d 后統(tǒng)計(jì)成活率，觀測生長情況。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件為：溫度（25±3）℃、光照1 500～2 600 lx、光照周期14 h/d、相對(duì)濕度55%～65%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 與SPSS 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方案對(duì)莖段消毒效果的影響

不同處理組合的消毒效果如表1 所示，酒精的消毒時(shí)間需要特別注意，75%酒精浸泡外植體5 s 不能達(dá)到較理想的滅菌效果，但消毒20 s 又易傷害幼嫩莖段，造成褐化死亡，只有3 種消毒劑的合理搭配才能達(dá)到理想的滅菌效果。不同處理組合的消毒方式對(duì)外植體污染率和存活率的影響均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。在污染率方面，處理A6、A8、A9 污染率顯著低于其他處理，分別為5%、8.3%、4.3%，三者之間差異不顯著，滅菌效果較差的是處理A1、A2 和A7，污染率達(dá)70%、66.7%和65.7%；外植體存活率方面，處理A4 和A6成活率顯著高于其他處理，存活率為88.7%、94.7%，存活率最低的是處理A3，僅為22.7%。試驗(yàn)中A4 存活率雖然較高，但污染率也偏高，達(dá)51%。A9 的污染率雖然最低，但由于消毒時(shí)間較長，外植體的存活率也隨之下降，為58.3%，表現(xiàn)為嫩莖切口處褪綠，慢慢褐化死亡。綜合考慮，選擇存活率最高且污染率較低的處理A6 作為燕窩果莖段消毒的最優(yōu)方案，即：75%酒精消毒10 s，5%雙氧水3 min，0.1%升汞3 min。

表1 不同滅菌方法對(duì)外植體污染率和存活率的影響

2.2 不同激素配比對(duì)刺座芽增殖的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有NAA 與TDZ 的濃度皆低于1.5 mg/L 的培養(yǎng)基可誘導(dǎo)出生長正常的刺座芽，激素濃度等于或高于1.5 mg/L 則會(huì)導(dǎo)致出芽玻璃化。再將刺座芽接種到添加適宜濃度的NAA 與TDZ的培養(yǎng)基中也可以獲得較好的增殖效果。不同處理組合對(duì)刺座芽誘導(dǎo)的影響如表2 所示，添加不同濃度的NAA 和TDZ 處理，其平均增殖系數(shù)和芽高存在顯著差異（P<0.05）。處理B2 的增殖系數(shù)顯著高于其他處理，增殖系數(shù)最高，為4.53，且平均芽高為3.23 cm，幼苗長勢良好。處理B8 和B9 為添加較高濃度的處理，兩個(gè)處理之間的增殖系數(shù)和芽高差異均不顯著，隨著NAA 與TDZ 的濃度升高，苗易出現(xiàn)玻璃化、長勢不良的現(xiàn)象，抑制不定芽增殖。試驗(yàn)結(jié)果表明：處理B2 為燕窩果刺座芽增殖的最優(yōu)培養(yǎng)基，即：MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L TDZ。

表2 不同濃度NAA和TDZ配比對(duì)刺座芽增殖的影響

2.3 不同激素配比對(duì)不定芽壯苗和生根的影響

不同處理組合對(duì)燕窩果不定芽壯苗和生根的影響如表3 所示，燕窩果不定芽接種到所有組合中都能生根，不同濃度激素配比對(duì)不定芽生根數(shù)有影響。平均生根數(shù)較高的處理是C4、C5、C6，分別為6.18、6.33、5.18，三者之間差異不顯著；平均生根數(shù)最低的是處理C1 和C2，分別為2.77、2.43，兩者之間差異不顯著，不定芽生長慢且根較弱小。處理C2、C3、C4、C6 的壯苗效果都較好，不定芽嫩綠、生長健壯，處理C2 的根系細(xì)弱，其余組合根系生長狀況良好，其中處理C4 的平均生根數(shù)較高，為6.18。處理5 的平均生根數(shù)最高，為6.33，但部分不定芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。綜合考慮，選擇處理4 為最佳壯苗和生根培養(yǎng)基，即1/2 MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA+0.1 g/L 碳粉。

表3 不同生長調(diào)節(jié)劑配比對(duì)不定芽生根情況的影響

2.4 煉苗移栽

組培苗移栽到基質(zhì)20 d 后，木質(zhì)化程度逐漸增強(qiáng)，小苗長勢明顯，移栽成活率可達(dá)90%以上。

3 討論

無菌材料獲得是燕窩果組織培養(yǎng)試驗(yàn)的難點(diǎn)，微生物易在刺座處駐藏，難以徹底滅菌。本研究采用何小帆［14］等對(duì)火龍果外植體進(jìn)行預(yù)處理的方法，拔除刺座處的小刺，對(duì)刺座進(jìn)行洗刷，但全年不同時(shí)期采集的外植體污染率仍出現(xiàn)很大差異，從9 月開始至來年2 月，外植體污染非常嚴(yán)重，因7 月、8 月正是病蟲害發(fā)生的季節(jié)［17］，且大理地區(qū)正值雨季，濕熱的環(huán)境加劇了微生物的繁殖。雖然燕窩果在4 月和8 月左右都會(huì)抽生嫩莖，但為了避免出現(xiàn)過高污染率，影響無菌外植體獲得，獲取無菌外植體的時(shí)間控制在3 月到7月底之間，主要采集4 月抽生的嫩莖作為外植體。為了殺死刺座處的微生物，本試驗(yàn)除了使用酒精、升汞兩種常規(guī)消毒劑，還增加了雙氧水輔助消毒，其消毒能力較強(qiáng)，對(duì)幼嫩莖段傷害小，且易沖洗去除，組合使用3 種滅菌劑獲得較好的滅菌效果。

本試驗(yàn)對(duì)比了6-BA 與TDZ 兩種細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)燕窩果刺座芽的效果。結(jié)果顯示，低濃度的6-BA 不能誘導(dǎo)刺座芽，濃度需提升至6 mg/L，外植體才能誘導(dǎo)出刺座芽，但芽出現(xiàn)玻璃化，且只有少數(shù)刺座能誘導(dǎo)出芽，誘導(dǎo)效果較差。采用TDZ 誘導(dǎo)要優(yōu)于6-BA。這可能是由于TDZ 的活性要比6-BA 高得多，可以在較短的時(shí)間內(nèi)對(duì)植物組織生長進(jìn)行有效刺激，有效促進(jìn)植物細(xì)胞再生［18］。試驗(yàn)中，培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L TDZ 與適宜濃度NAA 即可達(dá)到很好的刺座芽誘導(dǎo)效果，而且將刺座芽切下接種至該培養(yǎng)基中也能獲得較好的增殖效果，一種培養(yǎng)基可以滿足兩個(gè)關(guān)鍵組培步驟所需，提高了繁育效率，節(jié)約了成本。為了獲得更高增殖系數(shù)的配方，本試驗(yàn)嘗試提高TDZ 的濃度進(jìn)行增殖，但多數(shù)不定芽出現(xiàn)細(xì)弱、玻璃化等現(xiàn)象。TDZ 是一種具有高效促細(xì)胞分裂能力的植物生長調(diào)節(jié)劑，同時(shí)也具備生長素的作用，與較高濃度NAA 協(xié)同作用反而抑制了不定芽生長。因此，在進(jìn)一步研究中要注意適當(dāng)降低TDZ 的濃度，同時(shí)嘗試與其他生長素配合，多設(shè)置試驗(yàn)梯度，以找到最適增殖培養(yǎng)基。

試驗(yàn)中獲得了生根效果較好的組培苗，但要注意組培苗移栽后的栽培管理，燕窩果苗對(duì)栽培的土質(zhì)要求不嚴(yán)，但必須疏松透氣，排水良好，水分積滯會(huì)造成爛根。采用河沙∶園土∶珍珠巖體積比為1∶1∶1 的配比作為燕窩果的移栽基質(zhì)，配合少量復(fù)合肥，可獲得較高的移栽成活率。