通過RNA-seq技術(shù)對兒童腎惡性橫紋肌樣瘤病理組織差異表達基因的富集分析

張黃成昊 嚴兵 楊震 謝余澄 唐浩宇 張昆 武成闖 夭志剛 周永琦

腎惡性橫紋肌樣瘤(malignant rhabdoid tumor of kidney, MRTK)是惡性橫紋肌樣瘤的一種，是常發(fā)生于嬰幼兒腎臟的一種高侵襲性腫瘤，預(yù)后極差，男性發(fā)病率稍高于女性(1.5∶1)[1]。該病由 Beckwith等[2]在1978年首次提出。起初MRTK被認為是腎母細胞瘤的一種亞型，1981 年 Haas等[3]發(fā)現(xiàn)了其不同于腎母細胞瘤和腎橫紋肌肉瘤的獨特性，故將其獨立命名。隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)MRTK患者存在22號染色體單體缺失或22q111.2的hSNF/INI1基因突變失活，故INI-1蛋白在核內(nèi)表達喪失對于該病的診斷具有重要意義[4]。

轉(zhuǎn)錄組測序即RNA-seq，是一種基于Illumina高通量測序平臺測定mRNA或非編碼RNA序列表達水平的技術(shù)，不僅可分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達水平，還可發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本。因此，RNA-seq可從轉(zhuǎn)錄組整體水平反映基因結(jié)構(gòu)和功能，揭示特定的生物學(xué)過程及病理過程中的分子機制，是研究細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的全部RNA表達水平的重要手段，包括mRNA和非編碼RNA等。研究表明，MRTK的發(fā)生、發(fā)展與表觀遺傳學(xué)即基因修飾密切相關(guān)，然而轉(zhuǎn)錄組即RNA表達的變化正是這些修飾結(jié)果最直接的體現(xiàn)。因此本研究擬采用RNA-seq技術(shù)對收治的5例MRTK患兒的術(shù)中病理組織及3例正常兒童腎臟組織的RNA進行差異分析，再通過富集分析為MRTK可能的病理機制與治療靶點探尋新的思路。

材料與方法

一、樣本來源與取材

本研究得到昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會論證，并取得患兒家屬知情同意。入選標準：術(shù)前穿刺活檢明確為MRTK的患兒，排除其它因素導(dǎo)致腫瘤發(fā)病者。本研究共納入MRTK樣本5例，男2例、女3例，年齡6個月～7歲、中位年齡1歲4個月，右側(cè)1例、左側(cè)4例。入院后完善相關(guān)檢查，因CT、B超等影像學(xué)檢查均未能明確腫瘤性質(zhì)，予以局麻下行左腎穿刺活檢，病檢明確為MRTK，遂全麻下行左腎根治性切除術(shù)+淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)中完整切除腫瘤組織，清掃腎周淋巴結(jié)及腹主動脈旁淋巴結(jié)；術(shù)后淋巴結(jié)病檢均提示反應(yīng)性增生，未見腫瘤組織浸潤，明確術(shù)中為腫瘤完全切除。對照組選擇1～3歲經(jīng)病理科證實的正常兒童腎臟組織3例。

二、高通量RNA測序RNA-seq分析

在手術(shù)過程中將患者的組織保存在RNA保存溶液中，然后使用TRIzol試劑提取組織中的總RNA，在質(zhì)量控制和純化之后，將每個樣品的總RNA用于富集mRNA。mRNA被片段化并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后純化cDNA，與銜接子連接，使用試劑盒進行PCR擴增以獲得cDNA文庫。經(jīng)過質(zhì)量檢查后，通過Illumina平臺對文庫進行測序。

通過使用預(yù)處理工具Trimmomatic(v0.36)從原始測序讀物中除去銜接子和低質(zhì)量讀物，可獲得干凈的讀物。使用比對程序TOPHAT2，將純凈讀段映射到Ensembl GRCh38參考基因組。使用StringTie v1.3.1c將映射的數(shù)據(jù)整理成轉(zhuǎn)錄本并進行定量，以得到FPKM中的表達值矩陣。根據(jù)PBS-DNA之間的基因表達差值倍數(shù)(fold change, FC)變化的對數(shù)值，篩選出差異表達的基因(differential gene, DEG)。如果log3FC>1或<1，并且存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，則將其判斷為DEG。通過R工具包獲得DEGs分布的火山圖及熱點圖，并使用Ensembl GRCh38注釋文件進行功能注釋。

三、差異基因分析

使用在線生物工具GO數(shù)據(jù)庫(http://geneontology.org)進行基因本體論(Gene Ontology, GO)分析。

四、通路富集分析

使用在線生物工具KEGG Mapper 83.0(http://www.kegg.jp/kegg/mapper.html)進行京都基因與基因組百科(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)分析。

結(jié) 果

一、樣本質(zhì)量分析與豐度分布

Illumina9.0質(zhì)量分析結(jié)果顯示，質(zhì)量分值均在20以上，代表RNA質(zhì)量合格，可以進行下一步分析；FPKM箱線圖顯示RNA表達量分布合理、均一、穩(wěn)定，可進行差異性分析。

二、MRTK與正常腎組織基因表達差異

在細胞中，基因的表達是通過DNA外顯子區(qū)域轉(zhuǎn)錄為轉(zhuǎn)錄本(包括mRNA、LncRNA等)后體現(xiàn)的，而每個蛋白可由不同序列的轉(zhuǎn)錄本共同翻譯后獲得。

我們將這些相同靶蛋白的轉(zhuǎn)錄本合并后發(fā)現(xiàn)，與正常兒童腎組織相比，MRTK患者術(shù)中組織有2 013個基因發(fā)生顯著差異性變化(log3FC>1或<-1，P<0.05)。其中976個基因上調(diào)，1 037個基因下調(diào)。熱圖聚類分析顯示，MRTK患者術(shù)中組織的差異基因與正常腎組織相比具有較高組間差異性。同時無聚類錯位現(xiàn)象，可進行下一步分析。

三、MRTK與正常腎組織差異基因的GO分析

GO分析提示所有轉(zhuǎn)錄本中有5 316個差異基因參與了細胞內(nèi)不同的生物活動過程，735個基因參與了不同的細胞組成過程，1 444個基因參與了不同的分子功能過程(表1)。其中在參與分子功能的差異表達基因中，又以參與蛋白構(gòu)建與離子結(jié)合相關(guān)功能的基因最多，分別有1 090和319個(表2)。

表1 MRTK與正常腎組織差異表達的基因

表2 MRTK中參與蛋白構(gòu)建與離子結(jié)合相關(guān)功能的差異基因

四、KEGG信號通路分析

KEGG信號通路分析結(jié)果顯示差異表達基因參與PI3K-AKT信號通路的DEGs最多(表3)，說明PI3K-AKT信號通路在MRTK的發(fā)生、發(fā)展中有著關(guān)鍵調(diào)控作用，這在之前的MRTK相關(guān)研究中未見報道；參與腫瘤相關(guān)MicroRNA的基因數(shù)量同樣位列前二十，提示MicroRNA也在MRTK的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著不可替代的作用。

表3 MRTK中參與信號通路的差異表達基因

討 論

本研究中5例患兒病理免疫組化結(jié)果均為 INI-1 陰性，符合MRTK的特異性表現(xiàn)[4]。RNA-seq分析結(jié)果顯示與正常兒童腎臟組織相比，MRTK患兒相關(guān)蛋白對應(yīng)的基因有2 013個發(fā)生差異變化，其中976個DEGs表達上調(diào)，1 037個DEGs表達下調(diào)，該結(jié)果對MRTK機制研究及臨床診斷具有重要參考意義。GO分析結(jié)果顯示參與蛋白構(gòu)建的DEGs最多，達1 090個，這提示在MRTK的發(fā)生、發(fā)展中有大量參與蛋白構(gòu)建的基因表達發(fā)生了改變，該發(fā)現(xiàn)為深入探究MRTK的病理機制提供了新的思路。

如何安全靶向的對癌癥患者病灶實施精準治療是目前腫瘤治療的難題。本研究測序結(jié)果顯示，MRTK病理組織中參與細胞膜組成的DEGs數(shù)量排名第二，說明這些表達發(fā)生變化的基因可導(dǎo)致MRTK膜蛋白構(gòu)成異于正常細胞，即有特異性靶點存在于MRTK細胞膜上，這對尋找MRTK新的藥物治療靶點有著重要研究價值。

本研究通過KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)部分基因(56個)參與了PI3K-AKT信號通路，PI3K-AKT信號通路可能在MRTK的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，與v-Src和v-Ras等癌基因的產(chǎn)物相關(guān)，且PI3K本身具有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。癌癥基因組圖譜(TCGA； http://cancergenome.nih.gov)已通過大規(guī)模基因組測序以及表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，對11 000例癌癥患者樣本進行了研究，在PI3K/AKT信號級聯(lián)反應(yīng)的各節(jié)點中都發(fā)現(xiàn)了遺傳改變，這些遺傳改變已被證實可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[5-8]。PI3K某些位點如編碼催化亞基p110α的PIK3CA基因的突變及其相關(guān)抑制酶的表達失常，可激活PI3K/AKT信號通路，從而引起惡性腫瘤的發(fā)生。Shayesteh等[8]發(fā)現(xiàn)，PIK3CA在卵巢癌中高度擴增并發(fā)揮關(guān)鍵作用；Samuels等[5]證實在PIK3CA高表達的惡性腫瘤，如大腸癌、胃癌、乳腺癌和肺癌中，均發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路的激活。Campbell等[9]和Murph等[10]的研究表明，PIK3CA突變幾乎涵蓋所有類型的惡性腫瘤，包括卵巢癌、頭頸癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和腎癌，并且Kang等[11]和Samuels等[12]證明了PIK3CA位點的突變是強致癌性的。同時，Song等[13]發(fā)現(xiàn)PI3K的抑制酶PTEN與INPP4B活性的變化同樣會激活PI3K/AKT信號通路，甲基化PTEN引起PI3K/AKT信號通路在癌癥中的表達上調(diào)。INPP4B則是另一種重要的脂質(zhì)磷酸酶腫瘤抑制因子，在發(fā)生突變或缺失后也會激活PI3K/AKT信號通路[14-16]。AKT作為PI3K/AKT途徑的核心成分，AKT亞型的過表達和突變已在卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肝癌和肺癌中被發(fā)現(xiàn)[17-19]。提示PI3K-AKT信號通路在癌癥發(fā)生、發(fā)展中十分重要。

總之，目前報道的PI3K/AKT途徑的大多數(shù)組成節(jié)點都具有遺傳變異的趨勢，進而激活跨癌癥譜系的途徑。因此，通過研究PI3K/AKT途徑及其相關(guān)組成蛋白的表達可對包括MRTK在內(nèi)的腫瘤病理機制探究提供新的方向。

另外，在MRTK的KEGG分析中，其它高表達信號通路如細胞周期、原發(fā)性免疫缺陷等通路都是常見的腫瘤致病通路，但值得注意的是，目前還沒有對MRTK中MicroRNA表達變化的相關(guān)研究，而本研究中KEGG結(jié)果提示有大量的MicroRNA相關(guān)基因在MRTK中發(fā)生改變，有報道稱靶向MicroRNA是極為安全有效的且具備潛力的新型靶點[20]，本研究這一發(fā)現(xiàn)也可為MRTK的新型治療手段提供理論依據(jù)。

本研究提供了多種具有可行性的新型診療靶點，但考慮本研究樣本量較少，結(jié)論存在偏倚可能性較大，故仍需要進一步增加納入研究的樣本數(shù)來驗證結(jié)論。