載CXCL12抗體靶向超聲微泡制備及其體外卵巢癌細胞粘附性實驗①

付麗君，向 紅，曾倩倩，胡 蓉

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)超聲科，烏魯木齊830054）

通常患者被診斷為卵巢癌時，腫瘤已經(jīng)發(fā)展到中晚期，且腫瘤病灶已經(jīng)發(fā)生轉移，從而導致患者失去早期治療時機，預后差[1-2]。卵巢癌的早期診斷能夠提高患者的生存率[3-4]。在臨床上，超聲造影技術應用較為廣泛，近年來，該技術有了飛速的發(fā)展[5]，而靶向超聲微泡可在微泡表面上攜帶靶分子抗體，借助抗原抗體的特異性結合，在靶器官或靶組織區(qū)停留，實現(xiàn)特異性增強顯影[6-7]。研究表明，基質細胞延伸因子1（CXCL12）能夠與其趨化因子受體CXCR4組合，從而形成信號軸CXCL12/CXCR4，該信號軸可以對卵巢癌細胞進行調(diào)控[8-9]。本研究以CXCL12作為研究靶點，通過采用生物素-親和素連接法將CXCL12抗體與普通微泡結合制備攜CXCL12抗體的靶向超聲微泡，通過一般物理特性檢測和細胞爬片實驗，評價靶向微泡與靶組織的體外結合能力，旨在為腫瘤的早期診療研究提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料人卵巢癌細胞株SKOV3（購自武漢普諾賽生命科技有限公司），高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司）；磷酸鹽緩沖液；胎牛血清（Hyclone，USA）；Anti-CXCL12（博奧森生物科技有限公司）；鏈酶親和素（Streptavidin，SA，Sigma，USA）；羅丹明標記山羊抗兔IgG（北京中衫金橋）；凝膠制備試劑盒（Solarbio公司）。

1.2 培養(yǎng)人卵巢癌細胞株SKOV3細胞

1.2.1 細胞復蘇 將SKOV3細胞放到提前加熱好的水浴鍋中，使得凍存的細胞快速溶解開。待凍存管中的細胞基本上融化后，于離心機中離心5 min。棄去離心過的細胞上清液，剩下凍存管中的下層細胞小心放到超凈臺上，防止細胞污染，最后加入培養(yǎng)基，用取樣槍進行吹打混勻后，培養(yǎng)并觀察。細胞懸液分裝至培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)。

1.2.2 細胞傳代 細胞生長狀態(tài)良好，密度為90%左右時，進行傳代培養(yǎng)。棄去舊的培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，根據(jù)細胞密度加入適當量的0.25%胰蛋白酶消化液，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，待細胞變圓變亮時加入2～3 mL完全培養(yǎng)基終止反應，使用培養(yǎng)液將細胞從培養(yǎng)瓶壁吹打脫落，轉移至新的15 mL管。室溫離心棄上清(1 000 r/min,5 min)，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細胞，按實驗所需調(diào)整細胞密度，按1:2進行傳代，將細胞轉移至新培養(yǎng)瓶中繼續(xù)置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 制備普通超聲造影劑及攜CXCL12抗體靶向超聲造影劑

1.3.1 實驗分組 攜帶CXCL12抗體靶向超聲造影劑為實驗組，以未連接CXCL12抗體的聲諾維微泡作為對照組。

1.3.2 配制普通超聲造影劑 準備好聲諾維凍干粉，用生理鹽水溶解，體積為5 mL，充分混勻之后，把造影劑放置在冰箱冷藏室中待用,后續(xù)實驗在24 h內(nèi)完成。

1.3.3 配制靶向超聲造影劑 本實驗要制備攜帶CXCL12抗體靶向超聲造影劑，使用的方法是生物素-親和素橋接法，該方法的過程為：(1)準備好聲諾維凍干粉，用磷酸鹽緩沖液溶解，體積為3 mL，加入物素化脂質，重量為450 μg，在0℃條件下，用恒溫水平搖床搖晃，時間為45 min，然后靜置0.5 h，使其可以分層，分層之后去掉下層溶液，洗滌2次，收集上層乳白色微泡。(2)按10 μL/mL的比例在乳白色微泡中滴加鏈霉親和素，放置在0℃避光環(huán)境中，時間為0.5 h，使其可以分層，分層之后去掉下層溶液，收集上層乳白色微泡，按10 μL/mL的量加入抗CXCL12抗體，放置在0℃環(huán)境中，時間為0.5 h，使其可以分層，分層之后去掉下層溶液，收集上層乳白色微泡，放入4℃條件中保存待用，后續(xù)實驗在24 h內(nèi)完成。

1.3.4 間接免疫熒光觀察靶向微泡 分別在配制好的普通超聲造影劑和靶向超聲造影劑中加入羅丹明標記山羊抗大鼠IgG，混合均勻后，放置在0℃避光環(huán)境中，時間為0.5 h，使其可以分層，分層之后去掉下層溶液，收集上層，于熒光顯微鏡下檢測。

1.3.5 靶向造影劑的粒徑檢測和流式細胞儀檢測取制備好的CXCL12靶向超聲造影劑混懸液，測定微泡的粒徑大小。應用流式細胞儀測定結合率，并于手搖震蕩后再次測定結合率。每組各檢測10個樣本，并以非靶向造影劑對照。

1.4 體外尋靶當細胞貼壁之后，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，取出做細胞爬片。制作空白對照組細胞爬片和實驗組細胞爬片，每組各準備3張細胞爬片。去掉培養(yǎng)液，沖洗細胞，使死亡細胞被去除，使用的清洗液是PBS。操作方式：(1)在實驗組載玻片中加入靶向脂質微泡超聲造影劑，體積為200 μL；（2）在空白對照組的載玻片內(nèi)加入非靶向脂質微泡超聲造影劑，體積為200 μL。輕輕搖晃，使其加入的微泡可以在載玻片內(nèi)分散均勻，把爬片放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，讓造影劑和卵巢癌SKOV3反應，時間為60 min。隨后取出爬片，用緩沖液沖洗干凈之后，置于光鏡下觀察結合情況。

1.5 統(tǒng)計學分析使用SPSS23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，用單因素ANOVA檢驗和配對t檢驗分析組間差異，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 靶向超聲微泡的一般物理特性普通聲諾維微泡外觀呈乳白色，光鏡下呈圓形，分布均勻(圖1A)；加羅丹明標記的IgG熒光顯微鏡下觀察，未見熒光(圖1B)。攜CXCL12抗體的靶向微泡肉眼觀亦呈乳白色，大小均一、分布均勻(圖1C)；將羅丹明標記的IgG加入靶向微泡，熒光顯微鏡下觀察，可以看見環(huán)狀紅色熒光(圖1D)。表明IgG可以特異性地與CXCL12抗體的靶向微泡結合。對圖2進行分析可以明確，（2.45±0.26）μm為微泡的平均直徑。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，（1.67±0.04）%為對照組靶向微泡結合率，（87.77±2.83）%為實驗組靶向微泡結合率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見圖3）；且手搖震蕩靶向造影劑懸濁液有較好穩(wěn)定性，流式細胞儀檢測震蕩后靶向造影劑攜帶率為（86.55±1.12）% ，與震蕩前（87.77±2.83）%相比略降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 超聲微泡鏡光鏡及熒光顯微鏡下觀（×200）

圖2 攜CXCL12抗體靶向超聲微泡粒徑分布

圖3 攜CXCL12靶向超聲微泡結合率與非靶向超聲微泡比較

2.2 光鏡下觀察實驗組與對照組微泡對卵巢癌SKOV3細胞的結合情況實驗組微泡與人卵巢癌SKOV3細胞充分孵育后，通過400倍光鏡觀察，鏡下可見微泡分布不均勻，向細胞區(qū)域聚集。用PBS沖洗，次數(shù)為3次，置于鏡下觀察，可見細胞膜周圍粘附有大量微泡，平均值為(7.5±0.5)個；而對照組微泡僅可見數(shù)個游離的微泡，與細胞無粘附關系，平均值為(1.5±0.3)個，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；用 PBS 沖洗，次數(shù)為3次，置于鏡下觀察，試驗組可見細胞間隙無微泡存在，細胞膜周圍粘附有花環(huán)狀的微泡（見圖4A），對照組微泡鏡下未見微泡粘附細胞（見圖4B）。可見攜帶CXCL12抗體的靶向超聲微泡在體外可與人卵巢癌SKVO3細胞實現(xiàn)特異性粘附。

圖4 實驗組微泡(A)對照組微泡(B)卵巢癌細胞爬片鏡下觀（×400）

3 討論

與傳統(tǒng)的診療技術相比，分子影像技術可通過影像手段在體顯示基因表達、生物信號軸等復雜機制，為疾病的早期發(fā)現(xiàn)和靶向性治療提供了新依據(jù)。生物素-親和素橋接法因其特殊優(yōu)勢是應用最廣泛的制作靶向微泡造影劑的方法[10-11]，生物素-親和素橋接法具有高度專一性，不影響抗體分子活性，也不會在孵育和各種洗滌過程中脫落，可以穩(wěn)定存在于液相中。本研究采用這一方法，將商品化的聲諾維超聲微泡與CXCL12單抗結合，成功制備了攜帶CXCL12抗體的靶向超聲微泡，微泡大小分布均勻，和對照組相比，結合率較高，穩(wěn)定性較好；在施加一定外力對其進行震蕩之后再次對結合率進行檢測，前后差異無統(tǒng)計學意義，結果說明所制備的靶向微泡結合牢固、穩(wěn)定性好。將載CXCL12抗體靶向微泡與人卵巢癌SKVO3細胞孵育后鏡檢顯示，靶向微泡呈現(xiàn)出不均勻分布，說明存在聚集現(xiàn)象。觀察對照組，微泡呈現(xiàn)出均勻分布，說明不存在聚集現(xiàn)象。用沖洗液沖洗，可以觀察到對照組幾乎無微泡粘附癌細胞。觀察實驗組，依然發(fā)現(xiàn)癌細胞表面有較多微泡環(huán)繞，其余部分無微泡存在，靶向微泡粘附率明顯高于非靶向微泡。無論是流式細胞儀還是熒光顯微鏡，均表明CXCL12抗體與靶向微泡成功連接，并且可以與卵巢癌SKVO3細胞特異性結合。細胞分子水平的體外尋靶實驗是進一步應用于在體及將來開展臨床應用的前期實驗研究，該實驗為制備的CXCL12靶向超聲微泡能否進一步開展體內(nèi)實驗提供了一系列的實驗數(shù)據(jù)。體外實驗和小動物實驗的成功，也是為大動物模型及向臨床應用提供了方法學參考。靶向超聲造影劑應用于在體評估時，環(huán)境復雜，對靶向微泡的穩(wěn)定性及對組織靶點的特異粘附性提出了挑戰(zhàn)，因此對靶向微泡進行物理特性的檢測，以及體外尋靶實驗是否成功是十分關鍵的。

卵巢癌微環(huán)境中CXCL12表達量從無到有，標志著卵巢癌獲得了具有惡性生物學行為的新表型，而且隨著CXCL12在卵巢癌微環(huán)境中表達量的增加，卵巢癌細胞也更加具有了惡性行為。趨化因子CXCL12與其受體CXCL4結合所形成的CXCL12/CXCR4生物學信號軸廣泛參與機體的生理病理過程，在促卵巢癌生長中發(fā)揮多重關鍵作用:（1）促進癌細胞增殖、遷移和分化;（2）招募腫瘤干細胞，促進腫瘤復發(fā)和轉移;（3）通過多種途徑促進腫瘤血管生成;（4）介導免疫功能障礙;（5）形成耐藥性。因此在卵巢癌早期診斷、臨床治療、評價預后、預測抗藥性方面的研究中，CXCL12已成為卵巢癌微環(huán)境的重要研究靶點[12]。

綜上所述，本研究利用生物素－鏈霉親和素法所制備的攜帶CXCL12抗體的靶向超聲微泡粒徑分布均勻并且具有較好的穩(wěn)定性和較高的濃度。在與人卵巢癌SKVO3細胞株共孵育的體外尋靶實驗中，表現(xiàn)出特異性的粘附能力，為后期動物模型的在體實驗提供了一定的理論依據(jù)。