椪柑浮皮時揮發(fā)性成分變化及萜烯類物質(zhì)合成基因表達(dá)特征

姚世響，曹 琦，謝 姣，鄧麗莉，曾凱芳,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

浮皮是柑橘果實在采后衰老過程中的一種生理紊亂，表現(xiàn)為果皮與果肉分離，常伴隨著果肉的枯水，果實糖酸品質(zhì)劣變、風(fēng)味變淡，嚴(yán)重時不堪食用，喪失商品價值[1-2]。浮皮發(fā)生于溫州蜜柑、椪柑、紅橘等多類柑橘果實，是目前柑橘產(chǎn)業(yè)面臨的重要問題[1,3]。浮皮的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，與采前因素（包括品種、砧木、氣候和果園管理等）和采后因素（貯藏條件等）都密切相關(guān)[1,4-5]；目前從細(xì)胞壁降解酶、呼吸作用、礦質(zhì)元素、內(nèi)源激素等角度對柑橘果實浮皮進(jìn)行了多方面研究[3,6-10]；迄今為止，對浮皮發(fā)生的機(jī)理尚不明確，還需從更多角度、更深層次進(jìn)行分析。

柑橘果皮具有的特殊香味主要來源于果皮油胞所合成的揮發(fā)性物質(zhì)[11]，其主要成分為萜烯類化合物[12-13]。萜烯類化合物的基本結(jié)構(gòu)是異戊二烯，在植物中有2 種合成途徑：甲羥戊酸（mevalonate pathway，MVA）途徑和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（methyl-erythritol-4-phosphate pathway，MEP）途徑[14]。MVA途徑的產(chǎn)物主要為倍半萜和三萜，MEP途徑的產(chǎn)物主要為半萜、單萜、二萜和多萜。異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸酯（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）是萜類化合物合成的2 種前體。IPP合成途徑中，乙酰乙酰輔酶A硫解酶（acetoacetyl-CoA thiolase，ACAT）將兩分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A。在MEP途徑中，1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）催化5-磷酸脫氧木酮糖（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate，DOXP）生成MEP[14]。4-羥基-3-甲基-2-丁烯-焦磷酸合成酶（4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate synthase，HDS）催化2-C-甲基赤蘚糖醇2,4-環(huán)焦磷酸（2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate，ME-cPP）生成1-羥基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸（1-hydroxy-2-methyl-2-butenyl 4-diphosphate，HMBPP）[14]。HMBPP進(jìn)一步由4-羥基-3-甲基-2-領(lǐng)苯基二磷酸還原酶（4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase，HDR）和IPP異構(gòu)酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IPI）催化生成IPP。香葉基香葉基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPS）和香葉基香葉基還原酶（geranylgeranyl reductase，GGR）參與催化二甲基烯丙基焦磷酸酯（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）生成香葉基焦磷酸（Geranyl-PP，GPP），而GPP則是合成單萜類化合物的前體[14]。在二萜類化合物合成途徑中，貝殼杉烯酸羥化酶（ent-kaurenoic acid hydroxylase，KAO）和GA20-氧化酶（gibberellin 20 oxidase 2，GA20ox2）是2 個重要的酶[15]。在倍半萜和三萜合成途徑中，鯊烯合酶（squalene synthase，SQS）和萜類環(huán)化酶（terpenoidcyclases，TCS）是2 個重要的酶，SQS催化合成鯊烯，而鯊烯則是植物體內(nèi)三萜、甾醇等萜烯類物質(zhì)合成的共同前體[16]。

柑橘果實在采后貯藏過程中，果皮是響應(yīng)外界逆境和應(yīng)對果實衰老的第一道防線，其生理狀態(tài)也可在某種程度上反映果實的內(nèi)部狀況[17]。但目前對于果皮揮發(fā)性物質(zhì)在發(fā)生浮皮時是否會發(fā)生改變，還缺乏更多的實驗證據(jù)。另外，盡管前人對柑橘果皮揮發(fā)性物質(zhì)合成途徑中的相關(guān)基因已經(jīng)進(jìn)行了研究[14,18-19]，但這些基因的表達(dá)情況在采后貯藏過程中尤其是浮皮時的變化規(guī)律尚不清楚。

柑橘是世界產(chǎn)量最大的水果，其中椪柑（Citrus reticulata Blanco cv. Ponkan）有“橘中之王”的美譽(yù)，果實糖分含量高、香氣濃郁，具有較高的商品價值[20]。重慶地區(qū)的椪柑常在11～12月成熟并上市，果農(nóng)和相關(guān)企業(yè)為了緩解這種短時間大量上市造成的滯銷和價廉等問題，需要對果實進(jìn)行貯藏；椪柑的耐貯性能并不好，在貯藏過程中極易發(fā)生浮皮[5,21]。本研究以采后貯藏過程中的椪柑果實為實驗材料，運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)和RNA-Seq技術(shù)，分別分析椪柑果實浮皮時，果皮揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律和萜烯類合成途徑相關(guān)基因表達(dá)的變化特征，研究結(jié)果對理解浮皮的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椪柑果實于2015年12月采于重慶市北碚區(qū)柑橘果園。成熟的果實在采收后運(yùn)回實驗室，挑選大小和色澤一致、表面無機(jī)械損傷和疤痕的果實，經(jīng)2,4-二氯苯氧乙酸和咪鮮胺處理后，用聚乙烯薄膜單果套袋。椪柑果實貯存于冷庫中（8～10 ℃、相對濕度80%～85%）。在貯藏期間，觀察浮皮發(fā)生情況，在貯藏100 d時部分果實出現(xiàn)明顯的浮皮癥狀，即果皮與果肉分離、有明顯間隙，此時選擇浮皮程度一致的果實作為浮皮樣品，正常果實作為對照組樣品。果皮樣品用液氮冷凍后，存于－80 ℃冰箱備用。實驗重復(fù)3 次。

癸酸乙酯（純度＞98%） 阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）（色譜純） 上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；TRIzol試劑 上海英俊生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010 plus GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司；ZLS-1真空離心濃縮儀 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS樣品制備

采用Ding Yuduan等[17]的方法，準(zhǔn)確稱取1.00 g果皮樣品，用液氮充分研磨成粉末。加入5 mL MTBE和42.5 μg癸酸乙酯（內(nèi)標(biāo)），充分混勻，低溫超聲1 h。將有機(jī)相在離心濃縮儀中濃縮至0.3 mL，用直徑0.22 μm的濾膜過濾后上機(jī)。

1.3.2 GC-MS條件

GC條件：DB-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm i.d.，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度40 ℃，以3 ℃/min升到50 ℃，保持1 min；以2 ℃/min升至70 ℃，保持3 min；以3 ℃/min升至160 ℃，保持2 min；以8 ℃/min升至220 ℃，保持2 min；載氣（He，99.999%）流速0.80 mL/min；壓力33.8 kPa；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量1 μL；不分流進(jìn)樣。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；ACQ方式：掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～400。

1.3.3 RNA-Seq分析

用TRIzol試劑提取果皮RNA，取3 μg用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina（New England BioLabs, MA, USA）構(gòu)建cDNA文庫；然后用Illumina Hiseq平臺測序。原始測序文件（RAW data）用Perl腳本語言處理獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，然后用TopHat v2.0.12與柑橘（Citrus clementina）基因組進(jìn)行比對?；虮磉_(dá)水平用FPKM方法表示[22]。運(yùn)用校正的P值衡量2 個樣品之間的差異顯著性。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

譜圖基于NIST 08和NIST 08S數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，進(jìn)行定性分析，采用內(nèi)標(biāo)對各組分進(jìn)行定量分析。作圖采用Graphpad Prism 7.0和Photoshop軟件進(jìn)行。數(shù)據(jù)之間差異的顯著性采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)判斷（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 椪柑果皮揮發(fā)性物質(zhì)成分的鑒定

表1 椪柑果皮中揮發(fā)性物質(zhì)含量Table 1 Contents of volatile components in peel of ponkan fruit

續(xù)表1

對提取的椪柑果皮揮發(fā)性物質(zhì)采用GC-MS分析，將獲得的質(zhì)譜圖檢索NIST 08和NIST 08S數(shù)據(jù)，根據(jù)相似度、洗脫時間和相關(guān)文獻(xiàn)報道對揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，本實驗鑒定出53 種揮發(fā)性成分，如表1所示，其中萜烯類物質(zhì)24 種（包括單萜烯類、倍半萜烯類和其他萜烯類）、醇類物質(zhì)11 種、醛類和酮類物質(zhì)13 種、酯類物質(zhì)4 種和1 種其他類物質(zhì)（檸檬烯氧化物）。

2.2 浮皮對椪柑果皮揮發(fā)性物質(zhì)組分及含量的影響

本研究對正常和浮皮果實的果皮揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)組分均為53 種，即揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量在正常和浮皮果實之間不存在差異。進(jìn)一步用內(nèi)標(biāo)法對這53 種組分進(jìn)行定量分析，在正常果實中，萜烯類物質(zhì)占果皮總揮發(fā)性物質(zhì)含量的96%，表明萜烯類物質(zhì)是椪柑果皮揮發(fā)性物質(zhì)中含量最高的一類。而萜烯類物質(zhì)中D-檸檬烯占果皮總揮發(fā)性物質(zhì)含量的69%，表明D-檸檬烯是椪柑果皮揮發(fā)性物質(zhì)中豐度最高的組分。定量分析結(jié)果顯示，在兩類果實中，浮皮果實的果皮揮發(fā)性物質(zhì)總含量顯著降低，為正常果實的82%（P＜0.05），其中浮皮果實中果皮萜烯類物質(zhì)的含量下降為正常果實的81.4%。在這53 種組分中，32 種組分的含量有顯著性差異（P＜0.05），其余21 種組分的含量無顯著性差異。浮皮前、后揮發(fā)性物質(zhì)的定性與定量結(jié)果見表1。

2.2.1 萜烯類物質(zhì)

本研究通過鑒定共得到24 種萜烯類物質(zhì)，可分為單萜烯類、倍半萜烯類和其他烯類3 大類，總含量在浮皮時降低為對照果實的81.4%。單萜烯類物質(zhì)組分有8 種，其中α-蒎烯、β-月桂烯、D-檸檬烯、γ-松油烯和α-異松油烯在浮皮時含量顯著降低，分別為正常果皮的79.7%、78.2%、79.7%、85.7%和86.9%，僅順-β-羅勒烯的含量在浮皮果實果皮中升高，α-側(cè)柏烯和水芹烯等組分的含量在浮皮時沒有發(fā)生顯著改變（表1）。倍半萜烯類物質(zhì)組分有15 種，大多數(shù)（10 種）組分的含量在浮皮時沒有發(fā)生顯著改變，β-倍半水芹烯在浮皮時含量減少為正常果實的12.8%，α-金合歡烯和β-金合歡烯2 種組分在浮皮時含量升高（表1）。其他烯類物質(zhì)有2-甲基-1-苯基丙烯，在浮皮時含量顯著升高。

2.2.2 醇類物質(zhì)

通過鑒定共得到11 種醇類物質(zhì)，總含量在浮皮時升高了28.8%。其中，1-辛醇、欖香醇、橙花叔醇和白千層醇在浮皮時含量顯著降低，為正常果實的96.4%、54.4%、48.3%和64.3%；而芳樟醇、香芹醇、4-萜品醇和α-松油醇在浮皮時含量顯著升高，其余3 種醇類物質(zhì)的含量在2 種果皮間不存在顯著性差異。

2.2.3 醛類和酮類物質(zhì)

通過鑒定得到了13 種醛類和酮類物質(zhì)，總含量在浮皮果實中降低為對照果實的87.9%，其中壬醛、癸醛、十一醛、檸檬醛和α-甜橙醛在浮皮果實的含量均顯著低于正常果實，2,6,10-三甲基-2,6,9,11-十二碳四烯醛與香芹酮在浮皮時含量顯著升高。

2.2.4 酯類物質(zhì)和其他類揮發(fā)性物質(zhì)

本研究成功鑒定得到了4 種酯類物質(zhì)，總含量在浮皮時降低為正常果實的76.1%。這4類揮發(fā)性物質(zhì)包括乙酸辛酯、乙酸香茅酯、乙酸橙花酯和乙酸香葉酯，在浮皮時分別降低為對照的83.0%、69.5%、81.1%和84.8%。另外，檸檬烯氧化物在浮皮果實中的含量顯著高于正常果實（表1）。

2.3 浮皮對椪柑果皮萜烯類合成途徑基因表達(dá)的影響

2.3.1 萜烯骨架合成途徑基因

如圖1所示，在萜類化合物骨架合成途徑中，一共鑒定到8 個差異表達(dá)的基因，分別為acat2、dxr、hds、hdr、ipi1、ggps1、ggr、pcme。其中，pcme表達(dá)量顯著升高，由對照組的11.4升高至19.1（P＜0.05）。acat2、dxr、hds、hdr、ipi1、ggps1、ggr表達(dá)量顯著下調(diào)，分別由對照組的95.2、214.3、333.1、215.2、300.0、65.8、47.3下降至浮皮時的66.3、145.6、252.0、170.9、235.4、48.1、39.8（P＜0.05）。

圖1 萜類骨架合成途徑基因在浮皮時的表達(dá)特征Fig. 1 Expression patterns of genes involved in terpenoid backbone biosynthesis during peel puffing

2.3.2 二萜合成途徑基因

如圖2所示，在二萜合成途徑中，一共鑒定到4 個差異表達(dá)基因，在浮皮時均呈現(xiàn)顯著下調(diào)的趨勢（P＜0.05）。本研究鑒定到3 個編碼KAO的基因，分別是kao1、kao2和kao3，在浮皮時均顯著下調(diào)表達(dá)（P＜0.05），表達(dá)量在正常果實中分別為18.9、11.0、47.0，在浮皮果實中分別為10.6、4.9、27.3。本研究還鑒定到一個編碼GA20ox的基因ga20ox，在浮皮時表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），由正常果實中的8.8降低為浮皮果實中的4.6。

圖2 二萜合成途徑基因在浮皮時的表達(dá)特征Fig. 2 Expression patterns of genes involved in diterpenoid biosynthesis during peel puffing

2.3.3 倍半萜和三萜合成途徑基因

圖3 倍半萜和三萜合成途徑基因在浮皮時的表達(dá)特征Fig. 3 Expression patterns of genes involved in sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis during peel puffing

如圖3所示，在倍半萜和三萜合成途徑中，一共鑒定到2 個差異表達(dá)的基因。本研究鑒定到一個編碼SQS的基因sqs1，在浮皮時顯著下調(diào)（P＜0.05），sqs1表達(dá)量由正常果實中的47.1下降為浮皮中的35.9。本研究鑒定到一個編碼TCS的基因tcs，在浮皮時表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），tcs表達(dá)量由正常果實中的5.8下降為浮皮中的3.2。

3 討 論

浮皮是柑橘在貯藏時高發(fā)的一種生理性病害，表現(xiàn)為果皮與果肉明顯分離，常與果肉枯水伴生，嚴(yán)重影響柑橘食用價值[1]。目前對于柑橘浮皮的發(fā)生機(jī)制還沒有明確結(jié)論。本研究以重慶地區(qū)生產(chǎn)的椪柑為研究材料，發(fā)現(xiàn)在貯藏3 個月后，部分果實開始出現(xiàn)浮皮癥狀。并且隨著貯藏時間延長，浮皮果實的數(shù)量逐漸增加，浮皮癥狀也逐漸加重。在采前并沒有觀察到椪柑的浮皮現(xiàn)象，這表明采后貯藏是椪柑果實浮皮的關(guān)鍵誘發(fā)因素。本研究選擇貯藏100 d時浮皮程度一致的果實作為浮皮樣品，正常果實作為對照組樣品，從揮發(fā)性物質(zhì)的角度研究椪柑的浮皮機(jī)制。結(jié)果表明椪柑果實浮皮時，揮發(fā)性物質(zhì)組分沒有變化，但含量顯著降低。進(jìn)一步分析了浮皮對萜烯類物質(zhì)合成代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示與萜烯合成相關(guān)的基因表達(dá)量顯著下降，這表明果實發(fā)生浮皮時揮發(fā)性物質(zhì)含量的降低，與芳香物質(zhì)合成受到抑制密切相關(guān)。

本研究從椪柑果皮一共鑒定了53 種揮發(fā)性物質(zhì)組分，包括單萜烯類、倍半萜烯類、醛酮類和酯類等，其中萜烯類物質(zhì)含量占96%，D-檸檬烯含量占單萜烯類物質(zhì)的67%，是含量最高的單一組分。椪柑的其他研究也有類似結(jié)果，科學(xué)家從印度東北地區(qū)和日本高知縣的椪柑中分別鑒定到37 種和39 種果皮揮發(fā)性物質(zhì)，含量最多的為萜烯類化合物[23-24]。這種揮發(fā)性物質(zhì)的組成特征與之前在莽山野柑[11]、檸檬[25]、柚類果實[26]的研究結(jié)果一致。占果皮揮發(fā)性物質(zhì)絕大部分含量的萜烯類物質(zhì)在浮皮時降低為正常果實的81.4%，相應(yīng)地，果皮揮發(fā)性物質(zhì)總量在浮皮時降低為正常果實的82%（P＜0.05）。本研究鑒定的24 種萜烯類物質(zhì)分為單萜烯類、倍半萜烯類和其他烯類，包括α-蒎烯、β-月桂烯、D-檸檬烯、γ-松油烯和α-異松油烯在內(nèi)的單萜烯類物質(zhì)在浮皮時含量顯著降低，分別為正常果皮的79.7%、78.2%、79.7%、85.7%和86.9%，其中，β-倍半水芹烯在浮皮時含量減少為正常果實的12.8%。這些萜烯類物質(zhì)含量的降低是椪柑在浮皮時揮發(fā)性物質(zhì)含量降低的主要原因。為了進(jìn)一步分析萜烯類物質(zhì)含量降低的原因，本研究首次運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)[22]對椪柑果實在浮皮時基因表達(dá)的變化進(jìn)行分析，結(jié)果顯示編碼萜烯類物質(zhì)合成的基因在浮皮時表達(dá)量顯著下降。在萜類化合物骨架合成途徑中，共有7 個基因在浮皮時表達(dá)下調(diào)，包括acat2、dxr、hds、hdr、ipi1、ggps1和ggr，其中，acat2與dxr分別具有調(diào)控MVA合成途徑與MEP途徑的功能。在二萜合成途徑[19]中，kao1、kao2、kao3和GA20ox在浮皮時表達(dá)量顯著下降。在倍半萜和三萜合成途徑[19]中，sqs1和tcs在浮皮時表達(dá)量顯著下降。芳香類物質(zhì)的含量在細(xì)胞內(nèi)處于合成與降解的動態(tài)變化中，其含量的高低取決于合成和降解的速度[27-28]。本研究基于正常果實和浮皮果實中基因的差異表達(dá)模式得出如下結(jié)論：浮皮時，果皮揮發(fā)性物質(zhì)的合成途徑受到抑制，從而導(dǎo)致?lián)]發(fā)性物質(zhì)總含量下降。

由于柑橘浮皮的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，僅根據(jù)某些相關(guān)基因表達(dá)量的變化進(jìn)行分析無法系統(tǒng)地闡釋浮皮發(fā)生的機(jī)理。未來的研究需要借助于高通量組學(xué)技術(shù)，如代謝組學(xué)技術(shù)[29]和以第2代測序技術(shù)[22]和第3代測序技術(shù)[30]為主的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)和定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[31-32]，對不同柑橘品種，柑橘果實浮皮的動態(tài)過程中的果皮揮發(fā)性物質(zhì)組分與含量、全基因組水平的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯特征系統(tǒng)解析，在組學(xué)水平理解柑橘浮皮的發(fā)生機(jī)制，這對于從根本上闡明柑橘果實浮皮的原因具有重要意義。

4 結(jié) 論

綜合以上結(jié)果與分析，本研究運(yùn)用GC-MS技術(shù)分析了果皮揮發(fā)性物質(zhì)在椪柑果實浮皮時的變化，結(jié)果顯示揮發(fā)性物質(zhì)的組分在浮皮時沒有改變，但其含量呈顯著降低趨勢。為了探討其背后的生物學(xué)機(jī)制，本研究進(jìn)一步運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)RNA-Seq系統(tǒng)分析了萜烯類物質(zhì)代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示參與萜烯合成的基因在浮皮時表達(dá)量呈下降趨勢。這表明，在浮皮發(fā)生時，果皮揮發(fā)性物質(zhì)含量顯著下降，與萜烯類合成途徑相關(guān)基因表達(dá)量下調(diào)密切相關(guān)。本研究首次揭示了果皮揮發(fā)性物質(zhì)在浮皮時的降解特征，并初步探討了其背后的生物學(xué)的機(jī)制。這對于未來進(jìn)一步研究柑橘浮皮的發(fā)生機(jī)制具有重要意義，為柑橘浮皮防控措施的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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