不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的鎘耐性及鎘富集能力研究

韓博倫，肖清鐵，2，謝惠玲，游武，鄭新宇，2，林瑞余，2*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)測重點實驗室，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建省作物生態(tài)與分子生理重點實驗室，福州 350002）

土壤重金屬污染防控是當(dāng)前生態(tài)學(xué)的研究熱點。利用超富集植物修復(fù)土壤重金屬污染土壤具有廉價高效、操作簡單、安全可靠和環(huán)境友好等優(yōu)點，被認為是最具應(yīng)用前景的修復(fù)技術(shù)之一[1]。迄今，人們已經(jīng)鑒定了500 多種重金屬超富集植物，如鎘超富集植物遏藍菜（Thlaspi arvenseL.）、寶山堇菜（Viola baosha?nensisShu，Liu et Lan.）、印度芥菜（Brassica junceaL.）、灰楊[Populus canescens（Ait.）Smith.]、白蠟樹（Fraxinus chinensisRoxb.）、商陸（Phytolacca acinosaRoxb.）、東南景天（Sedum alfrediiHance.）、龍葵（Solanum nigurmL.）和鬼針草（Bidens pilosaL.）等[2?5]。田間修復(fù)試驗表明，龍葵、東南景天和鬼針草等[6?8]多種超富集植物生長較慢，生物量小，修復(fù)效果不理想。紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt 是唇形科的一年生草本植物，是我國傳統(tǒng)的藥食兩用作物，廣布全國各地[9]，紫蘇莖、葉以及籽粒均可作食材，其葉含揮發(fā)油和多酚類等活性物質(zhì)，具有抗衰老、抗菌、消炎和抑制腫瘤的作用；紫蘇籽富含ω?3 不飽和脂肪酸，具有降血壓、降血脂和預(yù)防動脈粥樣硬化功效[10]；紫蘇梗含木犀草素，具有抗氧化、抗炎和抗菌作用[11]。因此，紫蘇廣泛用于醫(yī)藥、油用、香料、食用和保健等方面[12]。一些研究表明，紫蘇還具有較強的鎘富集能力，生物量大、適應(yīng)性強，具備修復(fù)鎘污染土壤的潛力[13?14]，但如何安全處置收獲的鎘污染植株限制了紫蘇修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用。富集鎘的紫蘇可通過水蒸氣蒸餾分離出無鎘污染的揮發(fā)油，還可制備成高性能活性炭，有效鈍化生物質(zhì)中的鎘，制備的活性炭表現(xiàn)出良好的對水中Pb2+和Cd2+去除效果[15]，這為污染植株的后置化處理提供了思路。同時，已有研究表明，不同生態(tài)型的植物，其適應(yīng)性往往存在明顯差異[16]。紫蘇的種質(zhì)資源一般分為4 個變種，即栽培類型的紫蘇Perilla frutescensvar.frutescens（L.）Britt.（原變種）和回回蘇P.frutescensvar.crispa，野生類型的野生紫蘇P. frutescensvar.acuta 和耳齒紫蘇P. frutescensvar.auriculato?dentata[17]。根據(jù)紫蘇揮發(fā)油主要成分不同，對不同生態(tài)型紫蘇進行分類，可分為紫蘇醛型（PA）、紫蘇酮型（PK）和香薷酮型（EK）等多種化學(xué)生態(tài)型[18]。目前有關(guān)紫蘇化學(xué)生態(tài)型的研究主要集中在其揮發(fā)油化學(xué)活性成分上[19]，對其鎘污染適應(yīng)性及鎘富集能力的研究尚未見報道。探討不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的鎘富集能力及鎘污染對其揮發(fā)油化學(xué)成分的影響，對建立鎘污染修復(fù)技術(shù)及其修復(fù)植物資源的綜合利用具有重要意義。因此，本研究選擇4種化學(xué)生態(tài)型（PKPA型、EK型、PK?Ⅰ型、PK?Ⅱ型）的4個紫蘇資源，評價鎘污染下紫蘇的種子萌發(fā)特性、鎘含量及其鎘吸收能力，以期為獲得修復(fù)稻田鎘污染的適宜資源提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試4 份紫蘇資源屬于3 種化學(xué)生態(tài)型。（1）PK?PA 型：赤蘇（Perilla frutescensL.var.acuta），產(chǎn)自河北保定，葉片較小，卵形，葉面與葉背均為紫色，精油主要含檸檬烯、紫蘇酮、紫蘇醛和石竹烯。（2）EK 型：白蘇（Perilla frutescensL. Britt），產(chǎn)自甘肅慶陽，葉片寬卵形，葉面與葉背均為綠色，精油主要含薄荷腦、紫蘇酮、2?呋喃甲酸酐、石竹烯。（3）PK 型：紫蘇A（Perilla frutescensL.Britt.var.arguta），產(chǎn)自江西會昌，葉片長橢圓形，葉面平且多茸毛，葉背紫色，葉面綠色，葉柄莖稈綠色，分枝較少，精油主要含紫蘇酮、石竹烯，記為PK?Ⅰ；紫蘇B（Perilla frutescensL. Britt. Var. argu?ta），產(chǎn)自江蘇沐陽，葉片長橢圓形，葉面綠色，葉背紫色，精油主要含紫蘇酮、石竹烯，記為PK?Ⅱ。

1.2 種子萌發(fā)試驗

分別挑選30 粒籽粒飽滿的紫蘇種子置于培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，保持相對濕度70%，溫度25 ℃，每日添加等量CdCl2溶液于培養(yǎng)皿，鎘濃度設(shè)置為 0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg·L?1。連續(xù)培養(yǎng) 7 d后，測定紫蘇發(fā)芽率，每皿中隨機挑選10 粒萌發(fā)種子，測量每株紫蘇幼苗的根長和芽長，3 次重復(fù)，以平均值表示。

發(fā)芽勢=（第4 d 發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100%；發(fā)芽率=（第7 d 發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100%；根長、芽長抑制率（Inhibitory rate，IR）=（[處理?對照）/對照]×100%，IR>0 表示生長受到促進，IR<0 表示生長受到抑制。

1.3 紫蘇水培培養(yǎng)與采樣

挑選飽滿紫蘇種子，用0.05%NaClO 浸泡消毒30 min，蒸餾水洗凈后用0.5 mg·L?1赤霉素處理2 h，播種于溫室試驗地土壤中育苗。待幼苗長至10 cm 時，選擇長勢一致的幼苗，移至40 cm×30 cm×15 cm 的塑料盆中，植株以塑料泡沫板和海綿固定，每盆培養(yǎng)紫蘇24株，每盆加入10 L Hoagland完全營養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH在5.5左右。紫蘇適應(yīng)性水培7 d后，進行外源添加CdCl2溶液處理，設(shè)置鎘濃度為 0.0、2.0、5.0 mg·L?1和 10.0 mg·L?14 個處理，各處理 3 次重復(fù)，每周更換 1 次營養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng)3周后，采樣測定生物量、鎘含量[20]。

1.4 生物量測定

采樣時，將紫蘇全株取出，用去離子水洗凈根部，測定株高、根長后，將植株分為根、莖、葉3 個組分，樣品經(jīng)烘箱105 ℃殺青1 h，后于72 ℃烘干48 h，測定干質(zhì)量，生物量以干質(zhì)量表示。烘干樣品經(jīng)粉碎、過60目篩后，用于測定鎘含量。

1.5 鎘含量測定及鎘吸收能力

鎘含量測定采用火焰原子吸收（WFX?130A）方法，樣品采用VHNO3∶VHClO4=4∶1的混合酸消解。紫蘇的鎘富集量=各器官鎘含量（mg·kg?1）×生物量（kg），總鎘富集量為根、莖和葉富集量之和；鎘富集系數(shù)（BCF）=植株鎘含量（mg·kg?1）/培養(yǎng)液鎘含量（mg·kg?1）；轉(zhuǎn)移系數(shù)（TF）=地上部鎘含量（mg·kg?1）/根部鎘含量（mg·kg?1）。

1.6 統(tǒng)計分析方法與數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計分析使用DPS 7.05 軟件（杭州睿封信息技術(shù)有限公司），采用LSD 法比較不同處理間的差異顯著性水平，P<0.05；數(shù)據(jù)處理和作圖使用Excel 2003進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘污染對紫蘇種子萌發(fā)的影響

如表1 所示，鎘污染對EK 型和PK?Ⅰ型紫蘇種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢無顯著影響，對PAPK 型紫蘇的發(fā)芽率、發(fā)芽勢影響較小，對PK?Ⅱ型紫蘇種子的萌發(fā)有明顯抑制作用。5.0 mg·L?1鎘處理顯著抑制了PAPK 型紫蘇的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，10.0 mg·L?1鎘處理顯著抑制了PK?Ⅱ型紫蘇的發(fā)芽率和發(fā)芽勢（表1）。

表1 不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇種子的萌發(fā)系數(shù)（%）Table 1 Germination coefficient of Perilla frutescens seeds with different chemical ecotypes（%）

鎘脅迫對PAPK 型、EK 型、PK?Ⅰ型和PK?Ⅱ型紫蘇的根長有顯著性抑制作用（表2）。不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的根長、芽長與對照組相比，隨鎘處理濃度的升高總體呈顯著下降趨勢，PAPK 型和PK?Ⅰ紫蘇在10.0 mg·L?1鎘處理條件下，根長和芽長受到抑制最顯著，PAPK 型抑制率分別為30.3%和21.4%，PK?Ⅰ型抑制平分別為54.1%和44.2%；EK 型紫蘇在10.0 mg·L?1鎘處理條件下根長抑制最顯著，抑制率為66.3%，在 5.0 mg·L?1鎘處理條件下，芽長抑制最顯著，抑制率為37.2%；PK?Ⅱ型紫蘇在0.5 mg·L?1鎘處理條件下，根長和芽長受到抑制最顯著，抑制率分別為50.4%和16.7%。

表2 鎘污染下不同生態(tài)型紫蘇的根長和芽長Table 2 Root and bud length of different ecotype Perilla frutescens under cadmium pollution

2.2 不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的鎘含量及其鎘吸收能力

方差分析（表3）表明，紫蘇不同部位鎘含量在不同化學(xué)生態(tài)型和不同鎘處理間存在顯著差異，且紫蘇不同部位鎘含量在兩因素之間存在顯著的交互作用。不同化學(xué)生態(tài)型及不同鎘處理顯著影響紫蘇的鎘富集系數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)，且紫蘇鎘富集系數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)在兩因素之間存在顯著的交互作用（P<0.05）。

表3 紫蘇不同部位鎘含量、BCF、TF、鎘富集量及鎘分配比方差分析Table 3 Variance analysis of cadmium content in different parts of Perilla frutescens，BCF，TF，cadmium enrichment and cadmium distribution ratio

由表4 可知，不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇各器官以及全株鎘含量均隨鎘污染濃度的升高而增大，全株鎘含量變幅為 348.1~1 489.4 mg·kg?1，各部位鎘含量從高到低為：根＞莖＞葉，其中PK?Ⅰ型紫蘇相較于PAPK型、EK 型和PK?Ⅱ型紫蘇植株鎘含量較高；各生態(tài)型紫蘇的鎘富集系數(shù)為127.9~300.5；轉(zhuǎn)移系數(shù)為0.04~0.12（表4）。鎘處理條件下PAPK 型、EK 型、PK?Ⅰ型和PK?Ⅱ型紫蘇的富集系數(shù)存在顯著差異，總體表現(xiàn)為隨鎘處理濃度升高，富集系數(shù)下降。在2.0 mg·L?1鎘處理條件下PK?Ⅱ型紫蘇富集系數(shù)最高，為300.5；在5.0 mg·L?1鎘處理條件下PK?Ⅰ型紫蘇富集系數(shù)最高，為 265.5；在 10.0 mg·L?1鎘處理條件下 EK 型紫蘇富集系數(shù)最高，為148.9。

表4 不同鎘濃度處理下紫蘇各部位的鎘含量及富集、轉(zhuǎn)移系數(shù)Table 4 Cadmium content，BCF，and TF in various parts of Perilla frutescens under different cadmium concentration treatments

2.3 不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的鎘富集量及分配比

方差分析（表3）表明，紫蘇鎘富集量及鎘分配比在不同化學(xué)生態(tài)型和不同鎘處理間存在顯著差異，且紫蘇鎘含量在兩因素之間存在顯著的交互作用。由圖1可見，不同鎘濃度處理下，4種不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的根、地上部及單株的鎘富集量均在鎘濃度為5.0 mg·L?1時最大，顯著高于鎘處理濃度為2.0、10.0 mg·L?1時的鎘富集量。地上部富集量占總富集量分配比的11%~30%，根部富集量占富集量分配比的70%~89%，根部為紫蘇主要的鎘富集部位。不同鎘濃度處理下PAPK 型紫蘇單株鎘富集量為85.7~183.0 μg·株?1，PK?Ⅰ型紫蘇為 141.7~454.0 μg·株?1，PK?Ⅱ型紫蘇為145.7~268.7μg·株?1，EK型紫蘇單株鎘富集量為134.7~145.1 μg·株?1。相較于其他生態(tài)型，PK?Ⅰ型紫蘇在鎘濃度為5.0 mg·L?1時對鎘的富集量最大，達到 454.0 μg·株?1，分別是 PAPK 型、PK?Ⅱ型和EK型的2.48、1.69倍和2.05倍。

3 討論

3.1 不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的鎘耐性

種子萌發(fā)和幼苗生長是植物生長過程中的關(guān)鍵階段，因其防御機制尚未完全形成，對重金屬污染更為敏感[21]。研究表明，鎘脅迫對 PAPK 型、EK 型和PK?Ⅰ型紫蘇種子的萌發(fā)無顯著的抑制作用，表明這三種生態(tài)型紫蘇具有較高的鎘耐性；高濃度鎘脅迫顯著地抑制了PK?Ⅱ型紫蘇種子的萌發(fā)，表明其鎘耐性相對較差，這與王博等[22]研究相似。植物胚芽及其幼苗根系的生長對環(huán)境脅迫極其敏感，隨著鎘處理濃度的升高，PAPK 型、EK 型、PK?Ⅰ型和PK?Ⅱ型紫蘇胚根和胚芽生長受到顯著抑制，鎘對胚根生長的抑制作用大于胚芽，這與林必博等[23]報道的汞離子顯著抑制芝麻種子胚根的伸長、崔俊芳等[24]報道的鉛顯著抑制小麥種子胚根的伸長的結(jié)果相一致，也與宋玉芳等[25]發(fā)現(xiàn)的相同濃度處理下鎘、鋅、銅、鉛對小麥根伸長的抑制率顯著高于發(fā)芽抑制率的結(jié)果相一致。這可能是由于根系最先暴露于重金屬環(huán)境，其重金屬累積量及受脅迫時間大于胚芽，從而誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生自由基，過量的自由基影響了根系活力[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，PAPK型和EK型紫蘇種子鎘耐性高于PK?Ⅱ型，這主要與不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇遺傳背景及耐性形成機制差異有關(guān)[27?28]；PK?Ⅰ型紫蘇種子鎘耐性高于PK?Ⅱ型，這主要與PK?Ⅰ型及PK?Ⅱ型紫蘇的生存環(huán)境有關(guān)，PK?Ⅰ型紫蘇來自江西，地形以丘陵、山地為主，土壤多為紅壤，屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，水資源豐富，礦產(chǎn)資源豐富；PK?Ⅱ型紫蘇來自江蘇，屬亞熱帶季風(fēng)氣候?溫帶季風(fēng)氣候，地形以平原為主，地理位置沿海，多為堿性土壤，長期的基因型與環(huán)境互作影響了其對鎘脅迫的適應(yīng)性[28]。

3.2 不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的鎘富集能力

富集系數(shù)（BCF）是衡量植物對重金屬積累能力大小的一個重要指標，BCF越大，其富集能力越強，越利于植物對土壤重金屬的提取修復(fù)[29?30]。不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的BCF 總體上隨著鎘處理濃度上升而下降，但均遠大于1，達到了鎘超富集植物的要求，其中PAPK 型、EK 型和PK?Ⅱ型紫蘇的BCF均在鎘濃度為2.0 mg·L?1時達到最大，PK?Ⅰ型紫蘇BCF 在5.0 mg·L?1鎘處理時達到最大，表明不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的鎘耐性和鎘吸收潛力存在差異；同時，隨著鎘處理濃度增大，不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的鎘含量均呈上升趨勢，這與謝惠玲等[31]的研究結(jié)論一致。在鎘處理下，PAPK 型紫蘇全株鎘含量為 503.9~1 278.7 mg·kg?1，PK?Ⅰ型為348.1~1 416.7 mg·kg?1，PK?Ⅱ型為601.1~1 348.8 mg·kg?1，EK 型為 590.6~1 489.4 mg·kg?1，不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的鎘含量均高于鎘超富集植物的標準（100 mg·kg?1）。在不同部位間，紫蘇根部的鎘含量明顯高于莖、葉，是鎘富集的主要部位，其根系可有效阻止過多的重金屬鎘積累于地上部和種子中[32]。

遷移系數(shù)（TF）是植物地上部和根部重金屬含量的比值，可以體現(xiàn)植物從根部向地上部運輸重金屬的能力和重金屬在植物內(nèi)的分布情況。4 種不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的轉(zhuǎn)運系數(shù)均小于1，這可能是由于紫蘇根部的鎘含量較高，且鎘進入根部細胞后，為避免其繼續(xù)向植物地上部運輸，根部細胞中的蛋白質(zhì)等生物分子與重金屬形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，從而使其沉積在根部[33]。綜合分析富集系數(shù)以及轉(zhuǎn)運系數(shù)兩項指標，PK?Ⅰ型紫蘇能夠適應(yīng)較高濃度的鎘污染環(huán)境，具有較好的鎘耐性和環(huán)境修復(fù)潛力。

3.3 不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的鎘污染修復(fù)潛力

鎘脅迫能夠通過抑制植物水分吸收和運輸來抑制呼吸作用、光合作用、氮素代謝以及細胞分裂等生理生化過程，從而影響植物的生長發(fā)育，主要表現(xiàn)為植株褪綠、萎黃、矮化、生物量下降甚至死亡[34]。研究結(jié)果表明，紫蘇各器官的生物量均隨鎘處理濃度的升高而降低，當(dāng)鎘濃度達到 10.0 mg·L?1時，4 種不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的生長均受到明顯抑制，出現(xiàn)葉片失綠、底部葉片變黃脫落現(xiàn)象。從鎘富集量看，不同生態(tài)型紫蘇各部位的鎘富集量在5.0 mg·L?1鎘處理時最大，不同生態(tài)型間存在顯著差異，表現(xiàn)為PK?Ⅰ型＞PK?Ⅱ型＞EK 型＞PAPK 型，這與PK?Ⅰ型紫蘇鎘耐性較高，其根、莖、葉以及全株生物量在不同濃度鎘處理下均較高有關(guān)（表4）。不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇鎘富集量及鎘污染修復(fù)潛力存在顯著差異，主要是受遺傳特性和環(huán)境因素影響，如植株根部吸收、積累重金屬能力差異、重金屬形態(tài)等[35]。這與KUBO 等[36]和AR?DUINI 等[37]研究相似，不同品種水稻鎘富集量不同，鎘富集量與生物量有關(guān)，生物量越大鎘富集量越大。不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇對鎘耐性不同還可能與其生存環(huán)境有關(guān)，曾秀存等[29]研究發(fā)現(xiàn)，少花龍葵具有較強的耐鎘能力與它生存在礦山地區(qū)有關(guān)，在該地區(qū)生存的植物對重金屬產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性。有研究表明，不同基因型的同種植物中，與重金屬相關(guān)的基因表達量大小會影響其重金屬耐性[38]。在對擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，ZIP和Nramp家族基因參與植物體內(nèi)Zn 和Cd 等金屬離子的運輸過程[39?40]。趙首萍等[41]研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型番茄對鎘脅迫的響應(yīng)存在差異，高鎘積累品種中與鎘積累相關(guān)的NRAMP1、NRAMP3和ZIP基因的高表達可能是其高鎘積累的原因。因此需要對紫蘇中與鎘耐性相關(guān)的基因進行進一步研究，從分子層面探究其耐性機制。

4 結(jié)論

（1）不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇鎘耐性存在差異，PAPK型、EK 型和PK?Ⅰ型紫蘇種子的鎘耐性高于PK?Ⅱ型紫蘇種子。鎘脅迫下不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇種子的胚根和胚芽生長受到顯著抑制，胚根受到的抑制相較于胚芽更顯著。

（2）4 種不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇各器官以及全株鎘含量均隨鎘污染濃度的升高而增大，各部位鎘含量從高到低均為：根＞莖＞葉。其中PK?Ⅰ型紫蘇植株鎘含量高于PAPK型、EK型和PK?Ⅱ型紫蘇。

（3）不同化學(xué)生態(tài)型紫蘇的鎘富集系數(shù)均大于1，且鎘含量均高于鎘超富集植物的標準（100 mg·kg?1）。PK?Ⅰ型紫蘇在鎘處理5.0 mg·L?1時富集量及富集系數(shù)達到最大，分別為454μg·株?1和265.5。

（4）相較于其他化學(xué)生態(tài)型，PK?Ⅰ型紫蘇修復(fù)潛力最佳，可作為鎘超富集植物用于鎘污染土壤的修復(fù)。

未來應(yīng)當(dāng)探究紫蘇鎘耐性的分子機制，使超富集植物紫蘇在重金屬土壤污染的修復(fù)中發(fā)揮更大的作用。