光遺傳學(xué)技術(shù)
——2021年拉斯克獎基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎

宮 平 徐志卿,2*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，北京 100069； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京 100069)

北京時間2021年9月25日，拉斯克獎(the Lasker Awards)公布了2021年度獲獎?wù)呙麊巍?/p>

1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎

2021年基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎頒發(fā)給了3位在光遺傳學(xué)(optogenetics)領(lǐng)域貢獻(xiàn)突出的科學(xué)家,他們是德國馬克斯普朗克生物化學(xué)研究所(Max Planck Institute of Biochemistry, Martinsried)的Dieter Oesterhelt(圖1)、柏林洪堡大學(xué)(Humboldt University of Berlin)的Peter Hegemann(圖2)和斯坦福大學(xué)(Stanford University)的Karl Deisseroth(圖3)。拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎素有“美國的諾貝爾獎”和“諾貝爾獎風(fēng)向標(biāo)”之美譽(yù)。光遺傳學(xué)技術(shù)作為一項神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的革命性新技術(shù)，目前已被全世界數(shù)千個實(shí)驗室應(yīng)用于解析神經(jīng)系統(tǒng)中的復(fù)雜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。與此同時，它也為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的思路。

圖1 Dieter Oesterhelt[1]

圖2 Peter Hegemann[1]

圖3 Karl Deisseroth[1]

2 光遺傳學(xué)的發(fā)展歷程

哺乳動物的大腦是一種復(fù)雜又精密的系統(tǒng)，大腦中約有數(shù)百億的神經(jīng)元相互連接，這些神經(jīng)元分別具有不同的特性和“布線”模式，相互纏繞的神經(jīng)元能夠精確地交換毫秒級別的電信號，從而產(chǎn)生記憶、思考、感覺和情緒等多種生理活動[2]。我們熟知的神經(jīng)系統(tǒng)疾病都與腦內(nèi)神經(jīng)元的功能密切相關(guān)。

多年以來，神經(jīng)生物學(xué)家專注于解析神經(jīng)元的具體功能。但研究手段存在局限性，無法特異性地操控某類神經(jīng)元的活動。諾貝爾獎獲得者Francis Crick在1979年曾提出“神經(jīng)科學(xué)面臨的挑戰(zhàn)是如何去操控大腦中某一類神經(jīng)元，同時不改變其他神經(jīng)元的生理功能”。科學(xué)家對此目標(biāo)也嘗試了許多種解決方法：如試圖使用藥物操控，這種方法雖然可以特異性地操控某類神經(jīng)元，但由于很難做到毫秒級別，缺乏時間精度；也曾試圖用電刺激某一類神經(jīng)元，但因為電極的控制精度有限，往往對電極插入部位的所有神經(jīng)元同時產(chǎn)生刺激作用，缺乏對目標(biāo)神經(jīng)元的選擇性，且電刺激只能促進(jìn)神經(jīng)元放電，卻不能抑制其放電。因此這些方法都具有一定的缺陷性，并不能做到精細(xì)化操控神經(jīng)元。雖然Crick也推測“也許光線可以作為控制工具操控神經(jīng)元”，但當(dāng)時的科學(xué)家不知道如何讓神經(jīng)元對光線做出反應(yīng)。

2.1 光敏蛋白的發(fā)現(xiàn)

1969年，年輕的生物化學(xué)家Dieter Oesterhelt從德國慕尼黑大學(xué)博士畢業(yè)之后，來到了美國加州大學(xué)舊金山分校，從那里開啟了對細(xì)菌視紫紅質(zhì)的研究。1971年，他和生理學(xué)家Walther Stoeckenius在細(xì)菌的細(xì)胞膜中，發(fā)現(xiàn)了一種紫紅色物質(zhì)含有視黃醛，因此將其命名為細(xì)菌視紫紅質(zhì)(bacteriorhodopsin，BR)[3]。細(xì)菌視紫紅質(zhì)能夠起到光傳感器或光感受器的作用，當(dāng)光照時能夠吸取光子的能量，將質(zhì)子泵出細(xì)胞。隨著研究的深入，研究人員證明了細(xì)菌視紫紅質(zhì)為一種光控的氫離子通道。這種微生物蛋白質(zhì)與脊椎動物的蛋白質(zhì)不同，它不與細(xì)胞內(nèi)的第二信使發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，間接影響離子通道，而是直接將光子轉(zhuǎn)成電流?？茖W(xué)家隨后對這種蛋白質(zhì)家族的其他成員展開研究。在1977年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了主要介導(dǎo)氯離子細(xì)胞內(nèi)流的鹵視紫紅質(zhì)(halorhodopsin，HR)[4](圖4)。而2002年發(fā)現(xiàn)了這個蛋白質(zhì)家族的另外一個成員視紫紅質(zhì)通道蛋白(channelrhodopsin，ChR)，開啟了光遺傳學(xué)時代。

圖4 微生物中發(fā)現(xiàn)的3種光敏蛋白[6]

視紫紅質(zhì)通道蛋白的發(fā)現(xiàn)，其靈感最早來源于另一種光敏感微生物——綠藻(Chlamydomonas)。從1986年開始，Dieter Oesterhelt的博士學(xué)生——生物物理學(xué)家Peter Hegemann就開始以萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)為材料，對其趨光性進(jìn)行研究?？茖W(xué)研究的過程并不順利，直至2001年，Peter Hegemann才通過比對綠藻基因組數(shù)據(jù)庫，找出了兩個與細(xì)菌視紫紅質(zhì)高度同源的候選基因。2003年，通過將候選基因分別轉(zhuǎn)入動物細(xì)胞(非洲爪蟾蜍的卵母細(xì)胞)[5]和人的細(xì)胞(人胚胎腎臟細(xì)胞HEK293)[6]中，均準(zhǔn)確表達(dá)了衣藻視紫紅質(zhì)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，這種蛋白的活性受光的調(diào)控，并且介導(dǎo)了陽離子如鈉離子、鈣離子等流入細(xì)胞中，這也是第一次發(fā)現(xiàn)光能夠直接控制離子通道。這種蛋白的發(fā)現(xiàn)，也給了神經(jīng)生物學(xué)家?guī)砹诵碌乃悸罚篊hR可以在神經(jīng)元中表達(dá)并影響其生理功能，它也許可以成為光控制神經(jīng)元的理想介質(zhì)。這些發(fā)現(xiàn)奠定了光遺傳學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)。

2.2 光遺傳學(xué)的誕生

ChR的發(fā)現(xiàn)吸引了眾多神經(jīng)生物學(xué)家的目光，越來越多的研究者加入到光控細(xì)胞的探索中。起初，研究者[7-8]認(rèn)為這種異物膜蛋白可能會對哺乳動物的神經(jīng)元有毒不良反應(yīng)，其光電流(photocurrent)可能會過慢或過弱，無法發(fā)揮預(yù)想的作用。且微生物的視蛋白吸收光子時需要輔助因子全反式視黃醛的配合，因此有些研究者認(rèn)為其可能難以獨(dú)立發(fā)揮作用。此時，斯坦福大學(xué)的Edward. S. Boyden和Karl Deisseroth也在探索控制神經(jīng)元的新技術(shù)，尤其是當(dāng)過精神科醫(yī)生的Karl Deisseroth迫切地想要找到一種對精神病患者不良反應(yīng)小的新的治療方法。直到2005年8月，擁有工程背景的Edward. S. Boyden和醫(yī)學(xué)背景的Karl Deisseroth使用慢病毒載體將單個ChR2基因轉(zhuǎn)入哺乳動物的神經(jīng)元后，ChR2能夠準(zhǔn)確地表達(dá)在海馬神經(jīng)元的細(xì)胞膜上，且在不添加全反式視黃醛的條件下，藍(lán)光照射表達(dá)外源性ChR2的神經(jīng)元可以在50 ms內(nèi)引起陽離子的流入，神經(jīng)元發(fā)生去極化效應(yīng)，即神經(jīng)元能夠準(zhǔn)確地對光做出反應(yīng)[9]。這一新穎的發(fā)現(xiàn)雖然當(dāng)時被Science雜志拒稿，只刊登在NatureNeuroscience上，但它卻正式拉開了光遺傳學(xué)的序幕。后來，人們證實(shí)BR和HR也能夠快速又準(zhǔn)確地開啟或終止神經(jīng)元的活動[10]。除了上述提到的科學(xué)家，華人視覺科學(xué)家潘卓華(美國韋恩州立大學(xué))，也提出了光敏蛋白ChR2在視網(wǎng)膜細(xì)胞上的表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)對治療失明有很大的臨床應(yīng)用價值[11]。同期，Lynn T. Landmesser、Stefan Herlitze(美國凱斯西儲大學(xué))和Hiromu Yawo(東京大學(xué)生命科學(xué)研究院)也分別發(fā)表了ChR2在哺乳動物細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中的應(yīng)用研究[12-13]。

3 光遺傳學(xué)的基本原理

神經(jīng)元在靜息狀態(tài)下，細(xì)胞膜兩側(cè)存在電位差，這是由于細(xì)胞膜內(nèi)外各種離子濃度分布不均勻和細(xì)胞膜對各種離子的通透性不同所造成的。而細(xì)胞膜對各種離子的通透性的改變會導(dǎo)致膜電位的改變進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元的興奮性發(fā)生改變。光遺傳學(xué)的原理是選用病毒載體，將光敏蛋白的基因轉(zhuǎn)入到特定的神經(jīng)細(xì)胞中，目的是為了表達(dá)光敏的離子通道[14]。當(dāng)這些能被不同波長的光激活的光敏蛋白受到相應(yīng)波長的光照刺激時，這些離子通道會對細(xì)胞膜內(nèi)外的陽離子或陰離子產(chǎn)生選擇性開放，引起細(xì)胞膜內(nèi)外的膜電位發(fā)生改變，從而選擇性地興奮或抑制神經(jīng)細(xì)胞(圖5)。

圖5 光遺傳學(xué)的工作原理[13]

光遺傳學(xué)是將遺傳學(xué)和光學(xué)結(jié)合在一起的新興技術(shù)[15]。它通過將具有光反應(yīng)性的基因插入特定的神經(jīng)細(xì)胞中，用光來控制經(jīng)過基因改造的目標(biāo)細(xì)胞，以此來精準(zhǔn)操控目標(biāo)細(xì)胞來確定如其在活體神經(jīng)回路中的作用等。由于哺乳動物的組織中天生就含有足量的全反式視黃醛，除了轉(zhuǎn)入ChR基因，無需再向目標(biāo)神經(jīng)元中轉(zhuǎn)入其他基因。因此，光遺傳學(xué)具有高度可行性和應(yīng)用性[16-17]。

在應(yīng)用過程中，首先要選擇適合的光敏蛋白。光敏蛋白按功能分類，可分為兩類，即激活神經(jīng)元型，如：ChR2(H134R)、ChR2(C128S/D156A)、ChETA、oChIEF、C1V1、Chronos、ChrimsonR、ST-ChroME和ChRger等；和抑制神經(jīng)元型，如eNpHR3.0、Arch、Mac、Jaws和ST-eGtACR1等。第二，將光敏蛋白導(dǎo)入靶細(xì)胞中，常用方法包括轉(zhuǎn)染、病毒注射或構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物等。第三，將光導(dǎo)入研究的區(qū)域，如采用導(dǎo)入光纖或者控制激光來實(shí)現(xiàn)，通過選擇不同參數(shù)(波長、光強(qiáng)度、頻率)光照進(jìn)行刺激，對神經(jīng)元進(jìn)行精準(zhǔn)的時間和/或空間調(diào)控。第四，配合電生理記錄或行為學(xué)手段等實(shí)驗方法，觀察和記錄光刺激后的神經(jīng)元變化、神經(jīng)環(huán)路或動物的行為學(xué)變化。

4 光遺傳學(xué)的未來

隨著光遺傳學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，光遺傳學(xué)作為一項新的技術(shù)已被廣泛用于各領(lǐng)域科學(xué)研究中。在光遺傳學(xué)技術(shù)的幫助下，在阿爾茨海默病[18]、帕金森病[19]、抑郁癥[20]、慢性疼痛和焦慮[21]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中可以對神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)解析，從而對相關(guān)機(jī)制有更深層次的認(rèn)識。光遺傳學(xué)技術(shù)的應(yīng)用也為神經(jīng)系統(tǒng)的藥物研發(fā)帶來了新的契機(jī)[22]，且人們也在不斷地探討光遺傳學(xué)技術(shù)的臨床應(yīng)用，希望能為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療開辟新的途徑。此外，光遺傳學(xué)技術(shù)不但已經(jīng)被應(yīng)用于心血管[23]等其他系統(tǒng)的生理和病理機(jī)制研究，還被用于植物細(xì)胞功能的研究[24]。同時，人們也發(fā)現(xiàn)光遺傳學(xué)技術(shù)存在一些需要關(guān)注和改善的問題：如神經(jīng)元中的光敏蛋白的表達(dá)也許并不均勻，過表達(dá)的光敏蛋白本身對細(xì)胞功能的影響，等等。每項新的科學(xué)技術(shù)的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展的背后，都隱藏著許多勇于探索和創(chuàng)新的科學(xué)家，他們都值得我們敬佩。但我們相信，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，會有更多的交叉學(xué)科技術(shù)應(yīng)用于光遺傳學(xué)中，雖然也許還需要經(jīng)歷艱難和漫長的探索過程，但光遺傳學(xué)技術(shù)會逐步得到完善并被更廣泛地應(yīng)用。