山茱萸環(huán)烯醚萜苷對快速老化小鼠行為學及病理學改變的影響

馬登磊 李延崢,2 祝艷秋 李 林 張 蘭*

(1. 首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥學部 神經(jīng)變性病教育部重點實驗室 北京市神經(jīng)藥物工程研究中心，北京 100053； 2. 華北理工大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北唐山 063000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以進行性認知障礙和記憶損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。隨著年齡的增加，AD的患病率增高，其中65歲以上人群中AD的患病率約為5%，70歲以上為10%，80歲以上則高達30%[1]。老化對疾病的發(fā)生和進展影響很大，是AD發(fā)病最重要的危險因子。AD等神經(jīng)退行性病變的發(fā)生和進展等多個過程均與衰老有關，通過延緩腦及機體的衰老而預防和治療AD將可能減輕AD患者的患病負擔[2]。

快速老化小鼠(senescence-accelerated mouse prone 8，SAMP8)是由京都大學在AKR/J系小鼠繁育過程中發(fā)現(xiàn)的具有快速老化特征的小鼠品系。SAMP8小鼠表現(xiàn)不可逆的快速老化，表現(xiàn)與老年人和AD患者類似的老化癥狀，例如壽命減低、記憶障礙、運動障礙、突觸丟失、Aβ及tau蛋白病變等[3-4]。

傳統(tǒng)中藥山茱萸具有補益肝腎的作用。山茱萸環(huán)烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside, CIG)是山茱萸中的有效部位。筆者[5]的前期研究顯示，CIG能夠改善創(chuàng)傷性腦損傷模型大鼠的認知功能及tau蛋白磷酸化。此外，研究[6-7]顯示CIG可以改善不同月齡的SAMP8小鼠的行為學表現(xiàn)及tau蛋白的過度磷酸化，以上結果提示CIG在老化及AD中的潛在價值。但是CIG在SAMP8小鼠上對AD相關的其他病理改變的藥理作用尚未完全闡明。因此，本研究擬應用8月齡的SAMP8小鼠，進一步研究藥物CIG對SAMP8小鼠腦內(nèi)淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)代謝相關蛋白及突觸相關蛋白的變化，從而進一步探明CIG在老化及AD治療中的潛在價值和可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8月齡正常老化小鼠(senescence accelerated mouse/resistant 1,SAMR1)，雄性，24只；8月齡快速老化小鼠SAMP8，雄性，48只，購自天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心，動物分級為無特定病原體級(SPF)。實驗動物飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院實驗動物室屏障系統(tǒng)中，自由進食進水，保持每日12 h/12 h光照周期控制，溫度控制20～25 ℃。所有飼養(yǎng)條件及操作規(guī)范按首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院實驗動物倫理委員會的要求進行,實驗動物許可證號:0003474。

1.2 主要藥品、試劑及儀器

CIG由宣武醫(yī)院藥物研究室自行研制，為中藥山茱萸的有效部位。從山茱萸中提取和分離，獲得CIG，純度為70% (其中主要成分為莫諾苷和馬錢苷)。實驗中采用干粉劑量，溶解于0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液(以下簡稱生理鹽水)，制成藥液應用。陽性藥奧拉西坦膠囊(oxiracetam capsule)，石藥集團歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20031033。適應證：輕中度血管性癡呆、AD以及腦外傷等癥引起的記憶與智能障礙。

淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)抗體(貨號2452)，識別突觸后致密物蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD95)抗體(貨號3409)，GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)抗體(貨號5174)，識別鈣調(diào)素依賴蛋白激酶IIα286位點蘇氨酸Thr磷酸化(phospho-calcium calmodulin dependent protein kinase IIα,p-CamkIIα)抗體(貨號12716)：購自美國Cell Signaling Technology公司；識別可溶性淀粉樣前體蛋白α(soluble amyloid procurer protein α,sAPPα )抗體(貨號SIG-39139)：購自美國Covance公司；識別去整合素金屬蛋白酶10 (a disintegrin and metalloproteinase 10,ADAM10) 抗體(貨號A2726)，識別突觸囊泡蛋白突觸體素(synaptophysin)抗體(貨號SAB4502906)：購自美國Sigma公司；識別β-淀粉樣前體蛋白裂解酶(β-site APP cleaving enzyme,BACE-1 ) 抗體(貨號ab2077)、識別胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme,IDE)抗體(貨號ab109538)、識別α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體R1亞基GluR1 (glutamate ionotropic receptor AMPA type subunit 1)抗體(貨號ab31232)、識別鈣調(diào)素依賴蛋白激酶(calcium calmodulin dependent protein kinase IIα,CamkIIα)抗體(貨號ab22609)均購自美國Abcam公司。

小鼠紅外自主活動儀，BA-2小鼠避暗實驗箱：中國醫(yī)學科學院藥物研究所。Western blotting法電泳及電轉設備：美國Bio-Rad公司?；瘜W凝膠成像系統(tǒng)(Flour Chem HD2)：美國Protein Simple 公司。

1.3 動物分組及給藥

8月齡SAMR1共24只，采用數(shù)字表法隨機分為2組：SAMR1對照組，SAMR1+CIG低劑量組(100 mg/kg)，每組12只。8月齡SAMP8共48只，采用數(shù)字表法隨機分為4組：SAMP8模型組、SAMP8+CIG低劑量組(100 mg/kg，M)、SAMP8+CIG高劑量組(200 mg/kg，H)、SAMP8+奧拉西坦組(360 mg/kg，Oxi)，每組12只。CIG灌胃給藥每日1次，共2個月，至10月齡。SAMR1對照組、SAMP8模型組灌胃給予同體積生理鹽水。

1.4 自主活動實驗

在給藥2個月后，應用自主活動測試儀對SAMP8小鼠進行自主活動測試。將小鼠放入自主活動箱內(nèi)，蓋上箱蓋，讓小鼠適應3 min后，使用電腦程序控制實驗開始，箱體內(nèi)的紅外感應自動記錄小鼠的活動，計數(shù)5 min內(nèi)小鼠的自主活動次數(shù)。

1.5 避暗實驗

避暗實驗是利用嚙齒類動物趨暗的特性而設計的檢測被動回避記憶能力的行為學方法[8]。實驗裝置分為明暗兩室，明室有燈照射，暗室底部有通電銅柵，兩室間有小門連接。訓練時將動物放置在明室，因其嗜暗的特性鉆入暗室，此時動物接受電擊獲得記憶。記錄小鼠在第2次訓練24 h后首次進入暗室的時間(步入潛伏期)。

1.6 Western blotting法檢測

每組4只小鼠，麻醉后取出腦，剝離出皮質(zhì)組織，放入-80 ℃保存。皮質(zhì)組織按照1∶10(mg∶mL)比例加入含有蛋白酶抑制劑的組織勻漿液，裂解后加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃加熱變性蛋白。用BCA法對蛋白含量進行測定。取30～50 μg樣品，10%(質(zhì)量分數(shù)) SDS-PAGE凝膠電泳及電轉，蛋白轉印到PVDF膜上，5% (質(zhì)量分數(shù))TBST脫脂奶粉封閉，分別與一抗(1∶1 000)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠或抗兔IgG抗體(二抗，1∶2 000) 孵育。加ECL發(fā)光液后，在化學發(fā)光系統(tǒng)中得到蛋白條帶。用Multi Gauge V3.0軟件對目的條帶進行灰度分析和統(tǒng)計，與GAPDH灰度比值后得到蛋白相對表達。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 CIG對SAMP8小鼠行為學的影響

在給藥2個月后對SAMP8小鼠進行行為學測試，觀察CIG對模型小鼠衰老(自主活動)及認知功能(避暗試驗)的影響。自主活動記錄各種小鼠的自主活動次數(shù)，避暗試驗記錄小鼠在第2次訓練24 h后首次進入暗室的時間(步入潛伏期)。實驗結果顯示，各組間小鼠的自主活動次數(shù)及步入潛伏期時長差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較結果顯示，模型組小鼠的自主活動次數(shù)與對照組相比顯著降低(P<0.01)，而灌胃給予CIG(100、200 mg/kg)能夠顯著增加SAMP8小鼠的自主活動次數(shù)(P<0.05)。模型組小鼠步入潛伏期顯著降低(P<0.05)，而CIG(200 mg/kg) 給藥組可以顯著增加SAMP8小鼠的步入潛伏期(P<0.05，圖1)。

圖1 CIG對SAMP8小鼠自主活動及避暗實驗的影響Fig.1 Effects of CIG on locomotor activity and step-in latencyA: quantitative analysis of the number of locomotor activities; B: quantitative analysis of the step-in latency. #P<0.05, ##P<0.01 vs SAMR1 group; *P<0.05, **P<0.01 vs SAMP8 groups. CIG: cornel iridoid glycoside; SAMR1: senescence accelerated mouse/resistant 1; SAMP8: senescence accelerated mouse/prone 8; Oxi: oxiracetam (360 mg/kg); CIG(L): CIG 100 mg/kg; CIG(H): CIG 200 mg/kg.

2.2 CIG對SAMP8小鼠皮質(zhì)APP相關蛋白表達的影響

采用Western blotting法檢測SAMP8小鼠APP、sAPPα 、ADAM10、BACE-1、IDE的表達。各組間SAMP8小鼠sAPPα、ADAM10、IDE表達濃度差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而BACE-1、APP表達濃度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩兩比較結果顯示，SAMP8小鼠皮質(zhì)sAPPα、ADAM10和IDE的表達濃度顯著低于SAMR1組(P<0.05)。CIG給藥可以顯著增加SAMP8小鼠皮質(zhì)sAPPα、ADAM10和IDE的表達濃度(P<0.05，圖2)。

圖2 CIG對SAMP8小鼠皮質(zhì)APP相關蛋白表達的影響Fig.2 Effects of CIG on the expression of APP related proteins in the cerebral cortex of SAMP8 miceA: representative images of the expression of APP, sAPPα, ADAM10, BACE1 and IDE in the cerebral cortex of mice; B: quantitative analysis of the Western blotting. GAPDH served as an internal loading control and the relative intensity in the SAMP8 model group was set as 1.0. #P<0.05 vs SAMR1 group; *P<0.05, **P<0.01 vs SAMP8 group. Sal: normal saline (vehicle); APP: β-amyloid precursor protein; sAPPα: soluble APPα fragment; ADAM10: a disintegrin and metalloproteinase 10 (α-secretase); BACE-1: β-site APP cleaving enzyme (β-secretase); IDE: insulin-degrading enzyme; CIG: cornel iridoid glycoside; SAMR1: senescence accelerated mouse/resistant 1; SAMP8: senescence accelerated mouse/prone 8; CIG(L): CIG 100 mg/kg; CIG(H): CIG 200 mg/kg.

2.3 CIG對SAMP8小鼠皮質(zhì)突觸相關蛋白的影響

各組間SAMP8小鼠大腦皮質(zhì)synaptophysin、PSD-95、GluR1和p-CaMKIIα表達差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而CaMKIIα表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩兩比較結果顯示，SAM8小鼠大腦皮質(zhì)synaptophysin、PSD-95、GluR1和p-CaMKIIα的表達顯著降低(P<0.05)。CIG給藥可以顯著增加SAMP8小鼠皮質(zhì)synaptophysin、PSD-95、GluR1和p-CaMKIIα的表達(P<0.05，圖3)。

圖3 CIG對SAMP8小鼠皮質(zhì)突觸相關蛋白的影響Fig.3 Effects of CIG on the expression of synaptic plasticity-related proteins in the cerebral cortex of SAMP8 miceA： representative images of the expression of synaptophysin, PSD95, GluR1, phosphorylated CamKIIα and total CamKIIα in the cerebral cortex of mice; B: quantitative analysis of the Western blotting. #P<0.05 vs SAMR1 group; *P<0.05, **P<0.01 vs SAMP8 groups. Sal： normal saline (vehicle); PSD95： postsynaptic density protein 95; GluR1: AMPA receptor subunit 1; CamKIIα: Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II α; p-CamKIIα: phosphorylated CamKIIα at Thr286; CIG: cornel iridoid glycoside; CIG(L): CIG 100 mg/kg; CIG(H): CIG 200 mg/kg; Oxi: oxiracetam (360 mg/kg).

3 討論

SAMP8小鼠模型可以模擬由老化等多種因素引起的散發(fā)型AD的臨床和病理表現(xiàn)。SAMP8小鼠的老化速度，尤其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的衰老速度，是SAMR1對照小鼠的近兩倍[9]。在4月齡時，SAMP8小鼠就開始表現(xiàn)出認知功能的障礙，從7月齡開始SAMP8小鼠表現(xiàn)出跟年齡相關的運動障礙[3, 10]。本研究發(fā)現(xiàn)10月齡的SAMP8小鼠表現(xiàn)出明顯的認知和運動功能的障礙，CIG給藥可以顯著改善10月齡SAMP8小鼠的認知功能和運動功能障礙，提示CIG在改善老化引起的AD中的藥理作用。

APP的異常剪切和Aβ沉積是AD的發(fā)病機制和病理表現(xiàn)之一。自6月齡起，SAMP8小鼠即表現(xiàn)出來了年齡相關性的Aβ沉積[11]。病理性的Aβ片段由APP在β-位點剪切酶BACE1和γ-位點剪切酶共同作用下生成[12]。而在健康大腦中，APP主要的剪切途徑是被α-位點剪切酶ADAM10作用，生成可溶性的APP片段sAPPα和C末端[13]。與之前的研究[14]結果一致，本研究中發(fā)現(xiàn)SAMP8小鼠腦內(nèi)ADAM10和sAPPα的表達水平顯著降低。研究[15]顯示，通過增加ADAM10的表達水平進而降低腦內(nèi)Aβ沉積可以顯著改善SAMP8小鼠的病理表現(xiàn)和存活。本研究中，CIG可以顯著增加SAMP8小鼠腦內(nèi)ADAM10和sAPPα的水平，提示CIG可能通過增加APP在α-位點的剪切，進而減少Aβ片段的形成。此外，IDE作為Aβ的降解酶，其表達的增加也可以改善Aβ沉積引起的病理改變[16]。因此，本研究認為CIG可以通過增加ADAM10和IDE等代謝酶的表達，改善APP的剪切途徑，減少Aβ的形成。本研究中發(fā)現(xiàn)BACE-1在該月齡SAMP8小鼠的腦內(nèi)有增加的趨勢，CIG給藥有降低其表達的趨勢，這提示BCAE-1也可能參與Aβ的形成。

突觸是神經(jīng)系統(tǒng)的基本單元，在神經(jīng)元信號傳遞中發(fā)揮重要的作用。本研究采用Western blotting法檢測了突觸相關蛋白的表達，包括突觸囊泡蛋白突觸體素(synaptophysin)、突觸后致密物蛋白95(postsynaptic density protein 95，PSD95)、GluR1、CaMKIIα及其在蘇氨酸(Thr)286位點磷酸化(p-CaMKIIα)的表達。突觸的可塑性參與學習和記憶形成的基本環(huán)節(jié)。Aβ片段聚集后可以產(chǎn)生毒性，可以損傷突觸的形態(tài)和正常的功能[17]。因此，SAMP8小鼠的一個特征病理表現(xiàn)就是突觸的丟失及突觸相關蛋白表達的降低[18]。突觸相關蛋白synaptophysin和PSD95參與囊泡的轉運和神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，其表達量的多少提示了突觸的丟失情況[19]。GluR1是α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(AMPAR)R1亞基，AMPAR在突觸可塑性及沖動傳遞中發(fā)揮重要的作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，CIG可以增加SAMP8小鼠腦內(nèi)synaptophysin、PSD95和GluR1的表達，提示CIG給藥可以改善突觸的丟失和功能。

本研究進一步探討了CaMKIIα的表達及激活情況。CaMKIIα為神經(jīng)元突觸后致密成分中重要組分部分，是一種鈣離子激活的酶，它作為一個興奮轉錄偶聯(lián)的介導因子在學習和記憶功能方面發(fā)揮重要作用[21]。CaMKIIα在激活后，蘇氨酸(Thr)286位點發(fā)生磷酸化，參與神經(jīng)突觸的重塑、學習記憶增強等過程[22-23]。本研究中發(fā)現(xiàn)CIG明顯增加p-CaMKIIα的表達，提示CIG可能增加了SAMP8小鼠腦內(nèi)突觸的重塑和突觸可塑性。

綜上，本研究提示CIG可能有利于治療老化引起的認知障礙及AD樣的病理改變。