橡膠樹(shù)前纖維蛋白（profilin）基因家族的鑒定及表達(dá)分析

鄧治 李德軍

摘? 要：肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架可能在橡膠樹(shù)乳管傷口堵塞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。前纖維蛋白（profilin）是肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)平衡的重要調(diào)節(jié)子，但對(duì)橡膠樹(shù)profilin基因家族系統(tǒng)研究的報(bào)道較少。通過(guò)分析橡膠樹(shù)基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定到6個(gè)橡膠樹(shù)profilin基因，對(duì)其基本特性及蛋白保守基序、結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)模式等進(jìn)行分析?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，橡膠樹(shù)profilin基因都包含3個(gè)外顯子2個(gè)內(nèi)含子，編碼的蛋白序列含有profilin蛋白特有的保守基序KYMVIQGE和VIRGKKG。進(jìn)化分析顯示，橡膠樹(shù)profilin并未嚴(yán)格分為營(yíng)養(yǎng)型和生殖型2種類(lèi)型。profilin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)均包含3個(gè)α螺旋和7個(gè)β折疊。表達(dá)分析結(jié)果顯示，4個(gè)profilin基因在膠乳中高表達(dá)，橡膠樹(shù)排膠和碘化鉀處理調(diào)控這4個(gè)profilin基因表達(dá)，推測(cè)profilin基因參與橡膠樹(shù)排膠過(guò)程。該研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明橡膠樹(shù)profilin基因在乳管傷口堵塞和排膠中的作用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：前纖維蛋白基因家族;橡膠樹(shù);排膠;表達(dá)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S794.1????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Identification and Expression Analysis of profilin Gene Family in Hevea brasiliensis

DENG Zhi， LI Dejun*

Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation and Physiology of Tropical Crops， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Actin cytoskeleton might play an important role in laticifer wound plugging of Hevea brasiliensis. Although profilin is a vital regulator in actin dynamics， there is still no systematic study on profilin gene family in Hevea brasiliensis. In this study， six profilin genes were identified from the genome and transcriptome of Hevea brasiliensis. The six genes were analyzed in details， including gene basic characteristics， conserved protein motifs， structure features， evolutionary relationships， and expression profiles. Gene structure analyses demonstrated that the six profilin genes contained three exons and two introns. Conserved domain analyses indicated that the six profilin proteins possessed unique motifs of profilin protein， KYMVIQGE and VIRGKKG motifs. Evolutionary analyses showed that Hevea profilins were not strictly divided into vegetative and reproductive subclasses. The main secondary structures of profilin proteins were random coil and tertiary structures consist of three α helices and seven β turns. Expression analyses showed that four profilin genes were highly expressed in latex， and regulated by latex flow and potassium iodide treatment， suggesting that profilin genes might be involved in latex flow. These results would lay a foundation for further elucidating profilin roles in laticifer wound plugging and latex flow of Hevea brasiliensis.

Keywords： Profilin gene family; Hevea brasiliensis; latex flow; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.002

微絲是細(xì)胞骨架的重要組分，肌動(dòng)蛋白單體是構(gòu)成微絲的基本單位。真核細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架可通過(guò)快速動(dòng)態(tài)重組來(lái)響應(yīng)胞內(nèi)外信號(hào)，從而調(diào)控許多重要的細(xì)胞過(guò)程，例如胞質(zhì)流動(dòng)[1]、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞形態(tài)建成、細(xì)胞分裂和分化[2]、頂端生長(zhǎng)[3]、病原菌[4]、脅迫[5]和激素[6]響應(yīng)等。肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（actin binding protein，ABP）通過(guò)提高或抑制肌動(dòng)蛋白的聚合來(lái)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)重組[2]。植物ABP由多個(gè)基因家族構(gòu)成，其中前纖維蛋白（profilin）是表達(dá)量較高的一個(gè)ABP家族。Profilin分子量為12～16 kDa[7]，是一種高度保守的肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合蛋白。動(dòng)物細(xì)胞中profilin具有2種不同的功能，一方面，profilin結(jié)合G-actin，阻止肌動(dòng)蛋白自發(fā)成核，抑制微絲聚合[8]。另一方面，profilin可促進(jìn)ATP/ADP交換，將G-actin-ATP定位到能提高肌動(dòng)蛋白裝配的微絲正端，促進(jìn)單體結(jié)合到微絲上使微絲生長(zhǎng)[9]。此外，profilin還能與磷酸肌醇[10]、poly-L-脯氨酸[11]和Arp2-3復(fù)合體[12]結(jié)合。綜上所述，profilin在肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)中扮演著關(guān)鍵角色，為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排與多種細(xì)胞過(guò)程中的信號(hào)傳導(dǎo)途徑間提供連接。

首個(gè)植物profilin蛋白在樺樹(shù)花粉過(guò)敏原中發(fā)現(xiàn)[13]，隨后在擬南芥、水稻、楊樹(shù)、玉米和橡膠樹(shù)等植物中也發(fā)現(xiàn)profilin的存在。植物profilin與非植物profilin蛋白氨基酸序列一致性為25%左右，植物profilin同樣具有抑制微絲聚合的作用，但目前未發(fā)現(xiàn)植物profilin能促進(jìn)核苷酸ATP/ADP交換的功能[14]。高等植物profilin可分為營(yíng)養(yǎng)型和生殖型2類(lèi)[15-16]，如營(yíng)養(yǎng)型的擬南芥PRF1、PRF2和PRF3幾乎在所有組織中都表達(dá)，生殖型的擬南芥PRF4和PRF5主要在成熟花粉中表達(dá)。profilin在植物中具有多種功能，例如在擬南芥細(xì)胞擴(kuò)張過(guò)程中參與formin介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白成核和纖絲裝配[17]，調(diào)控極性花粉管生長(zhǎng)中頂端肌動(dòng)蛋白聚合[18]，參與擬南芥蓮座葉和花序形態(tài)建成[19]，通過(guò)負(fù)調(diào)控formin介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白裝配來(lái)調(diào)節(jié)PAMP觸發(fā)的植物免疫[20]。棉花過(guò)表達(dá)GhPFN2基因能增強(qiáng)對(duì)黃萎病抗性[21]。大量研究表明profilin還是一種極具交叉反應(yīng)性的植物變應(yīng)原[22]。

橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）原產(chǎn)巴西亞馬遜河流域，其產(chǎn)生的膠乳是目前天然橡膠最重要的來(lái)源。有研究表明肌動(dòng)蛋白微絲骨架可能在橡膠樹(shù)乳管傷口堵塞、產(chǎn)膠和死皮等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[23-25]。作為肌動(dòng)蛋白微絲骨架重要調(diào)節(jié)子的profilin在橡膠樹(shù)中的研究報(bào)道較少。2001年Ganglbergera首次克隆了1個(gè)橡膠樹(shù)profilin基因，該基因表達(dá)的蛋白是膠乳過(guò)敏原Hev b 8[26]。2011年筆者克隆了另一個(gè)橡膠樹(shù)profilin基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析[27]。本研究利用橡膠樹(shù)基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定橡膠樹(shù)profilin家族基因，并對(duì)其基本特性及蛋白結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)模式等進(jìn)行分析，該研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明橡膠樹(shù)profilin基因在乳管傷口堵塞和排膠中的作用奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 本研究所用材料為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)種植的橡膠樹(shù)品系‘熱研7-33-97。將3%碘化鉀（KI）溶液涂抹在7年生未開(kāi)割橡膠樹(shù)幼樹(shù)割面上、下2 cm范圍內(nèi)，用黑色塑料布包裹避光，分別于處理后0、6、24、48 h采集膠乳。選取10年生橡膠樹(shù)，采集割膠后0～5 min、>5～35 min、>35 min至停止排膠3個(gè)時(shí)間段的膠乳，分別記為T(mén)1、T2和T3。所有樣品經(jīng)液氮冷凍后置于–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2? 試劑? 通用植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis購(gòu)自Thermo Scientific公司;熒光定量PCR試劑TB Green? Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。引物合成由廣州英駿生物公司完成。

1.2? 方法

1.2.1? 橡膠樹(shù)profilin基因家族的鑒定? 橡膠樹(shù)profilin基因的篩選方法如下，在橡膠樹(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)HeveaDB（http：//hevea.catas.cn/home/index）中搜索profilin序列，篩選出注釋為profilin的相關(guān)基因。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中將擬南芥profilin基因序列與橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，篩選出與擬南芥profilin基因同源的序列。將2種方法篩選得到的profilin基因序列進(jìn)行比對(duì)去除冗余序列，利用pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org/）分析橡膠樹(shù)profilin蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，確定橡膠樹(shù)profilin基因序列。利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)。根據(jù)橡膠樹(shù)profilin的基因組序列和轉(zhuǎn)錄組序列確定內(nèi)/外含子數(shù)目和位置。

1.2.2? 橡膠樹(shù)profilin蛋白特性及結(jié)構(gòu)分析? 利用在線軟件ProtParam （https：//web.expasy.org/ protparam/）預(yù)測(cè)橡膠樹(shù)profilin蛋白的理化性質(zhì)。利用PSORT （https：//psort.hgc.jp/）在線預(yù)測(cè)橡膠樹(shù)profilin蛋白的亞細(xì)胞定位。通過(guò)SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線預(yù)測(cè)橡膠樹(shù)profilin蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。以擬南芥profilin蛋白的三維結(jié)構(gòu)（PDB：6IQI）為模板，通過(guò)SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）對(duì)橡膠樹(shù)profilin蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模。利用PyMOL軟件顯示橡膠樹(shù)profilin蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3? 橡膠樹(shù)profilin蛋白進(jìn)化分析? 在NCBI和Phytozome網(wǎng)站下載擬南芥、水稻、楊樹(shù)、玉米、葡萄、蓖麻和麻風(fēng)樹(shù)的profilin蛋白氨基酸序列，結(jié)合橡膠樹(shù)profilin蛋白序列，利用MEGA軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4? 橡膠樹(shù)profilin基因家族組織表達(dá)分析? 在橡膠樹(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)HeveaDB（http：//hevea.catas.cn/ home/index）中下載6個(gè)橡膠樹(shù)組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)，對(duì)橡膠樹(shù)profilin基因的組織表達(dá)量進(jìn)行歸一化/標(biāo)準(zhǔn)化處理，用R軟件中的pheatmap函數(shù)繪制基因表達(dá)熱圖。

1.2.5? qRT-PCR分析? 根據(jù)橡膠樹(shù)profilin基因家族組織表達(dá)的結(jié)果，選取膠乳中高表達(dá)的4個(gè)橡膠樹(shù)profilin基因，設(shè)計(jì)qRT-PCR引物。由于橡膠樹(shù)profilin基因家族保守性較高，引物設(shè)計(jì)盡量避開(kāi)保守結(jié)構(gòu)域。以橡膠樹(shù)18S rRNA基因（GenBank登錄號(hào)AB268099）作為內(nèi)參基因。本研究所用引物序列見(jiàn)表1。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。每樣品均為3次重復(fù)。基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT計(jì)算。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 橡膠樹(shù)profilin基因家族鑒定

對(duì)橡膠樹(shù)基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合profilin蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析，最后確定6個(gè)橡膠樹(shù)profilin家族基因，命名為HbPRF1～HbPRF6（表2）。橡膠樹(shù)profilin家族基因ORF長(zhǎng)度為396 bp或402 bp，編碼氨基酸長(zhǎng)度為131或133個(gè)氨基酸，蛋白分子量為14.00～14.35 kDa，等電點(diǎn)范圍為4.63～5.02。6個(gè)橡膠樹(shù)profilin蛋白均為親水蛋白和穩(wěn)定蛋白。蛋白序列比對(duì)顯示6個(gè)橡膠樹(shù)profilin蛋白高度保守，含有profilin的保守基序KYMVIQGE、VIRGKKG、LAPTG、PGQCN、MSWQ、GDYL、YVD、KKT和AAI，其中KYMVIQGE和VIRGKKG為profilin特有基序（圖1）。基因結(jié)構(gòu)分析顯示6個(gè)橡膠樹(shù)proflin基因都包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子（圖2）。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位表明6個(gè)橡膠樹(shù)profilin蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)。

橫線表示profilin蛋白的保守基序。

藍(lán)色方框表示外顯子，黑色線條表示內(nèi)含子。

2.2? 橡膠樹(shù)profilin蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

為進(jìn)一步研究橡膠樹(shù)profilin蛋白空間結(jié)構(gòu)特性，對(duì)橡膠樹(shù)profilin蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（表3）。6個(gè)橡膠樹(shù)profilin蛋白都以無(wú)規(guī)則卷曲為主，其中無(wú)規(guī)則卷曲比例為35.34%～41.98%，α螺旋比例為22.14%～30.83%，延伸鏈比例為23.31%～25.19%，β折疊比例為6.87%～10.69%。對(duì)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，6個(gè)橡膠樹(shù)profilin蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，均包含3個(gè)α螺旋和7個(gè)β折疊（圖3）。上述蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果說(shuō)明6個(gè)橡膠樹(shù)profilin蛋白結(jié)構(gòu)高度保守。

2.3? 植物profilin蛋白進(jìn)化關(guān)系分析

為研究橡膠樹(shù)profilin蛋白的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA軟件構(gòu)建橡膠樹(shù)與擬南芥、水稻等植物profilin蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。根據(jù)進(jìn)化樹(shù)的分支（圖4），可將植物profilin蛋白家族分為2個(gè)亞AtPRF1～AtPRF5： Arabidopsis thaliana （AAB39480.1， AAB39481.1， Q9FE63.2， AAB39477.1， AAB39479.1）; OsPRF1～OsPRF2： Oryza sativa （BAD69332.1， AAK92580.1）; ZmPRF1～ZmPRF6： Zea mays （CAA51718.1， CAA51719.1， CAA51720.1， AAB86960.1， AAG35601.1， ONM38364.1）;PtPRF1～PtPRF3： Populus trichocarpa （XP_002304225.1， XP_002299743.1， XP_011000942.1）; VvPRF1～VvPRF4： Vitis vinifera （XP_002274966.3， XP_002283450.1， XP_002283490.1， XP_010656249.1）; JcPRF1～JcPRF3： Jatropha curcas （NP_001295719.1， XP_012069066.1， XP_012076840.1）; RcPRF1～RcPRF3： Ricinus communis （XP_002514199.1， XP_002515952.1， XP_002514198.1）; CcPRF： Colletotrichum chlorophyti （OLN95629）.族，擬南芥營(yíng)養(yǎng)型的AtPRF1、AtPRF2和AtPRF3聚為一個(gè)亞族，HbPRF1～HbPRF6與擬南芥生殖型的AtPRF4和AtPRF5等植物profilin蛋白聚為另一個(gè)亞族。其中HbPRF1和HbPRF2與麻風(fēng)樹(shù)PRF1和蓖麻PRF1聚為一支，HbPRF3和HbPRF4與麻風(fēng)樹(shù)PRF3和蓖麻PRF2聚為一支，HbPRF5和HbPRF6與擬南芥生殖型的AtPRF4和AtPRF5等聚為一支。值得注意的是，單子葉植物profilin蛋白聚為一支，其中營(yíng)養(yǎng)型和生殖型profilin分別聚為2個(gè)亞支。說(shuō)明profilin蛋白進(jìn)化早于單、雙子葉植物分化，橡膠樹(shù)profilin蛋白與同為大戟科的麻風(fēng)樹(shù)和蓖麻親緣關(guān)系較近。

2.4? 橡膠樹(shù)profilin基因家族的表達(dá)分析

2.4.1? HbPRFs的組織表達(dá)模式? 由圖5可知，HbPRF1和HbPRF2在所有檢測(cè)的組織中均有較高的表達(dá)，其中膠乳中表達(dá)量最高;HbPRF3在所有檢測(cè)組織中幾乎不表達(dá);HbPRF4在所有檢測(cè)組織中均表達(dá)，其中膠乳中表達(dá)量最高，葉片中表達(dá)量最低;HbPRF5在雄花中表達(dá)量最高，膠乳中幾乎不表達(dá);HbPRF6在葉片中表達(dá)量最低，在膠乳中表達(dá)量最高。上述結(jié)果表明，6個(gè)橡膠樹(shù)profilin基因中有4個(gè)在膠乳中表達(dá)量最高，說(shuō)明這4個(gè)profilin基因可能在膠乳中發(fā)揮重要作用。

2.4.2? HbPRFs在不同排膠時(shí)間的表達(dá)模式? 微絲細(xì)胞骨架在橡膠樹(shù)排膠過(guò)程中具有重要作用。根據(jù)HbPRFs組織表達(dá)分析結(jié)果，選擇HbPRF1、HbPRF2、HbPRF4和HbPRF6等4個(gè)在膠乳中高表達(dá)的基因，進(jìn)一步研究其排膠相關(guān)處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式。結(jié)果顯示（圖6），HbPRF1隨著排膠時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸上調(diào)，HbPRF2、HbPRF4和HbPRF6等3個(gè)基因在T2排膠時(shí)間段表達(dá)量下調(diào)，T3排膠時(shí)間段上調(diào)表達(dá)。其中HbPRF2在T3排膠時(shí)間段中的表達(dá)量高于T1排膠時(shí)間段。而HbPRF4和HbPRF6在T3排膠時(shí)間段中的表達(dá)量稍低于T1排膠時(shí)間段。說(shuō)明HbPRF1、HbPRF2、HbPRF4和HbPRF6等4個(gè)基因的表達(dá)與橡膠樹(shù)排膠有關(guān)。

2.4.3? KI處理下HbPRFs的表達(dá)模式? 由圖7可知，微絲解聚劑KI處理可誘導(dǎo)HbPRF1、HbPRF2、HbPRF4和HbPRF6基因表達(dá)，HbPRF4最高表達(dá)量出現(xiàn)在處理后48 h，約為0 h表達(dá)量的14倍。其余3個(gè)HbPRFs的最高表達(dá)量都出現(xiàn)在KI處理后24 h。上述結(jié)果提示，HbPRF1、HbPRF2、HbPRF4和HbPRF6等4個(gè)基因可能參與橡膠樹(shù)膠乳中KI調(diào)控微絲解聚過(guò)程，其中HbPRF4與碘化鉀引起的微絲解聚最為相關(guān)。

3? 討論

基因組測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展使得全面篩選和鑒定重要的基因家族成為可能。profilin基因家族是一個(gè)古老且普遍存在功能分化的家族，調(diào)節(jié)生物細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)方面。本研究利用橡膠樹(shù)基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合生物信息學(xué)系統(tǒng)分析，鑒定到6個(gè)橡膠樹(shù)profilin基因，說(shuō)明橡膠樹(shù)profilin基因家族成員數(shù)量與其他植物類(lèi)似，如擬南芥有5個(gè)profilin基因[15， 19]，玉米有6個(gè)profilin基因[14]。Profilin蛋白序列中的KYMVIQGE和VIRGKKG為其獨(dú)有的保守基序，此外還包括8個(gè)3～5位氨基酸的保守基序[28]。序列分析發(fā)現(xiàn)除HbPRF6中AAI基序變?yōu)锳SI序列外，其余橡膠樹(shù)profilin蛋白序列均含有上述保守基序?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示橡膠樹(shù)profilin基因均由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示橡膠樹(shù)profilin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)都以無(wú)規(guī)則卷曲為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)均包含3個(gè)α螺旋和7個(gè)β折疊。值得注意的是HbPRF5和HbPRF6一致性雖然很高（97.76%），但在膠乳和葉片中的表達(dá)模式出現(xiàn)明顯差異，HbPRF5蛋白的AAI保守基序在HbPRF6中變?yōu)锳SI序列，僅這1個(gè)氨基酸的差異，可能會(huì)造成這2個(gè)蛋白功能的差異。

為研究橡膠樹(shù)profilin蛋白的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)橡膠樹(shù)與擬南芥、水稻等植物profilin蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析。結(jié)果顯示雙子葉植物擬南芥的profilin蛋白分為營(yíng)養(yǎng)型和生殖型2個(gè)亞族。橡膠樹(shù)profilin蛋白與擬南芥生殖型profilin蛋白聚為一個(gè)亞族，在該亞族中HbPRF1和HbPRF2聚為一支，HbPRF3和HbPRF4聚為一支，HbPRF5和HbPRF6與擬南芥生殖型的AtPRF4和AtPRF5聚為一支，單子葉植物profilin蛋白聚為一支。說(shuō)明profilin作為一個(gè)古老的蛋白進(jìn)化發(fā)生在雙子葉和單子葉物種分化之前，這與Pandey等[28]結(jié)果一致。蛋白進(jìn)化分析結(jié)果顯示橡膠樹(shù)profilin并未嚴(yán)格分為營(yíng)養(yǎng)型和生殖型2種類(lèi)型，組織表達(dá)結(jié)果與進(jìn)化分析結(jié)果一致，橡膠樹(shù)profilin基因沒(méi)有在營(yíng)養(yǎng)型和生殖型組織中存在特異性或顯著性差異表達(dá)，表明橡膠樹(shù)profilin蛋白進(jìn)化過(guò)程較復(fù)雜，這可能與橡膠樹(shù)次生代謝產(chǎn)物——膠乳中肌動(dòng)蛋白發(fā)揮重要和特殊的功能有關(guān)。

根據(jù)細(xì)胞所處的不同狀態(tài)，profilin具有兩種相反的功能，既能調(diào)控肌動(dòng)蛋白聚合過(guò)程也能調(diào)控肌動(dòng)蛋白解聚過(guò)程。雖然目前對(duì)植物profilin是否具有促進(jìn)ATP/ADP交換的功能仍有爭(zhēng)議[14]，但研究發(fā)現(xiàn)與植物profilin結(jié)合的肌動(dòng)蛋白單體可以添加到肌動(dòng)蛋白絲的正端，促進(jìn)G-肌動(dòng)蛋白聚合為微絲[9]。擬南芥profilin下調(diào)導(dǎo)致F-肌動(dòng)蛋白數(shù)量下降，頂端分生組織中肌動(dòng)蛋白絲紊亂[18]。排膠時(shí)間是決定橡膠樹(shù)膠乳產(chǎn)量的一個(gè)重要限制因素，乳管傷口堵塞物形成的速度決定著排膠時(shí)間的長(zhǎng)短。微絲細(xì)胞骨架在橡膠樹(shù)乳管堵塞過(guò)程中具有重要作用[23-25]。割膠后5 min的橡膠樹(shù)割面的乳管傷口末端出現(xiàn)蛋白質(zhì)，隨著排膠進(jìn)行乳管傷口末端的蛋白質(zhì)逐漸積累。當(dāng)排膠終止時(shí)蛋白質(zhì)大量積累在乳管傷口末端形成一個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[25， 29]。該蛋白質(zhì)網(wǎng)起到堵塞乳管和保護(hù)乳管傷口的作用[29]。隨著排膠的進(jìn)程肌動(dòng)蛋白在割膠后的乳管傷口末端逐漸聚集。橡膠樹(shù)排出的膠乳中肌動(dòng)蛋白含量逐漸減少，說(shuō)明膠乳中的肌動(dòng)蛋白可能在排膠過(guò)程中逐漸截留在乳管傷口處[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然HbPRF2表達(dá)在排膠中期稍有下調(diào)，但排膠末期與排膠初期時(shí)相比HbPRF1和HbPRF2的表達(dá)明顯上調(diào)。說(shuō)明排膠過(guò)程中HbPRF1和HbPRF2上調(diào)可能促進(jìn)微絲逐漸聚合，這與排膠過(guò)程中肌動(dòng)蛋白逐漸截留在乳管傷口末端的結(jié)果相符，說(shuō)明profilin在橡膠樹(shù)乳管堵塞過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)KI處理導(dǎo)致微絲解聚的同時(shí)也引起橡膠樹(shù)profilin基因上調(diào)表達(dá)。KI處理導(dǎo)致微絲快速解聚[30]，可能造成細(xì)胞內(nèi)G-肌動(dòng)蛋白大量積累，為維持胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)平衡，profillin與G-肌動(dòng)蛋白形成復(fù)合體，封存G-肌動(dòng)蛋白，從而抑制微絲的聚合，但還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4? 結(jié)論

本研究對(duì)橡膠樹(shù)profilin基因家族成員進(jìn)行了基本特性及蛋白結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)模式等進(jìn)行分析。結(jié)果表明profilin基因在橡膠樹(shù)排膠過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究為后續(xù)橡膠樹(shù)profilin基因在乳管傷口堵塞和排膠中的作用研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]? Nick P. Signals， motors， morphogenesis： the cytoskeleton in plant development[J]. Plant Biology， 1999， 1（2）： 169-179.

[2]? Lappalainen P. Actin-binding proteins： the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks[J]. Molecular Biology of the Cell， 2016， 27（16）： 2519-2522.

[3]? Qu X L， Jiang Y X， Chang M， et al. Organization and regulation of the actin cytoskeleton in the pollen tube[J]. Frontiers in Plant Science， 2014， 5： 786.

[4]? Porter K， Day B， Biology C M， et al. From filaments to function： The role of the plant actin cytoskeleton in pathogen perception， signaling and immunity[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2016， 58（4）： 299-311.

[5]? Hafke J B， Ehlers K， F?ller J， et al. Involvement of the sieve element cytoskeleton in electrical responses to cold shocks[J]. Plant Physiology， 2013， 162（2）： 707-719.

[6]? Lanza M， Garcia-Ponce B， Castrillo G， et al. Role of actin cytoskeleton in brassinosteroid signaling and in its integration with the auxin response in plants[J]. Developmental Cell， 2012， 22（6）： 1275-1285.

[7]? Rodríguez del Río P， Díaz-Perales A， Sánchez-García S， et al. Profilin， a change in the paradigm[J]. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology， 2018， 28（1）： 1-12.

[8]? Yarmola E G， Bubb M R. Profilin： emerging concepts and lingering misconceptions[J]. Trends in Biochemical Sciences， 2006， 31（4）： 197-205.

[9]? Perelroizen I， Didry D， Christensen H， et al. Role of nucleotide exchange and hydrolysis in the function of profilin in action assembly[J]. Journal of Biological Chemistry， 1996， 271（21）： 12302-12309.

[10]????? Lassing I， Lindberg U. Specific interaction between phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate and profilactin[J]. Nature， 1985， 314（6010）： 472-474.

[11]????? Archer S J， Vinson V K， Pollard T D， et al. Elucidation of the poly-L-proline binding site in Acanthamoeba profilin-I by NMR spectroscopy[J]. FEBS Letters， 1994， 337（2）： 145-151.

[12]????? Mullins R D， Heuser J A， Pollard T D. The interaction of Arp2/3 complex with actin： nucleation， high affinity pointed end capping， and formation of branching networks of filaments[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1998， 95（11）： 6181-6186.

[13]????? Valenta R， Duchêne M， Pettenburger K， et al. Identification of profilin as a novel pollen allergen; IgE autoreactivity in sensitized individuals[J]. Science， 1991， 253（5019）： 557-560.

[14]????? Kovar D R， Dr?bak B K， Staiger C J. Maize profilin isoforms are functionally distinct[J]. The Plant Cell， 2000， 12（4）： 583-598.

[15]????? Huang S， McDowell J M， Weise M J， et al. The Arabidopsis profilin gene family.（Evidence for an ancient split between constitutive and pollen-specific profilin genes）[J]. Plant Physiology， 1996， 111（1）： 115-126.

[16]????? Kandasamy M K， McKinney E C， Meagher R B. Plant profilin isovariants are distinctly regulated in vegetative and reproductive tissues[J]. Cell Motillity and the Cytoskeleton， 2002， 52（1）： 22-32.

[17]????? Zhang S， Liu C， Wang J J， et al. A processive Arabidopsis formin modulates actin filament dynamics in association with profilin[J]. Molecular Plant， 2016， 9（6）： 900-910.

[18]????? Liu X N， Qu X L， Jiang Y X， et al. Profilin regulates apical actin polymerization to control polarized pollen tube growth[J]. Molecular Plant， 2015， 8（12）： 1694-1709.

[19]????? Müssar K J， Kandasamy M K， McKinney E C， et al. Arabidopsis plants deficient in constitutive class profilins reveal independent and quantitative genetic effects[J]. BMC Plant Biology， 2015， 15： 177.

[20]????? He S， Qiao Z， Chua K P， et al. Profilin negatively regulates formin-mediated actin assembly to modulate PAMP-tri-ggered plant immunity[J]. Current Biology， 2018， 28（12）： 1882-1895.

[21]????? Wang W Y， Sun Y D， Han L B， et al. Overexpression of GhPFN2 enhances protection against Verticillium dahliae invasion in cotton[J]. Science China Life Science， 2017， 60（8）： 861-867.

[22]????? Valenta R， Duchene M， Ebner C， et al. Profilins constitute a novel family of functional plant pan-allergens[J]. Journal of Experimental Medicine， 1992， 175（2）： 377-385.

[23]????? 高政權(quán)， 孟春曉， 吳繼林， 等. 巴西橡膠樹(shù)乳管肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架與采膠的關(guān)系[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2003， 24（3）： 22-26.

[24]????? 高政權(quán)， 郝秉中. 植物細(xì)胞骨架在橡膠樹(shù)產(chǎn)膠和排膠中的可能作用[J]. 海南師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2001， 14（2）： 23-25.

[25]????? Shi M J， Li Y， Deng S N， et al. The formation and accumulation of protein-networks by physical interactions in the rapid occlusion of laticifer cells in rubber tree undergoing successive mechanical wounding[J]. BMC Plant Biology， 2019， 19（1）： 8.

[26]????? Ganglbergera E， Radauera C， Wagnera S， et al. Hev b 8， the Hevea brasiliensis latex profilin， is a cross-reactive allergen of latex， plant foods and pollen[J]. International Archives of Allergy and Immunology， 2001， 125（3）： 216-227.

[27]????? 李德軍， 劉向紅， 鄧? 治. 巴西橡膠樹(shù)Profilin基因克隆及生物信息學(xué)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2011， 27（30）： 187-191.

[28]????? Pandey D K， Chaudhary B. Evolutionary expansion and structural functionalism of the ancient family of profilin proteins[J]. Gene， 2017， 626： 70-86.

[29]????? Hao B Z， Wu J L， Meng C X， et al. Laticifer wound plugging in Hevea brasiliensis： The role of a protein-network with rubber particle aggregations in stopping latex flow and protecting wounded laticifers[J]. Journal of Rubber Research， 2004， 7（4）： 281-299.

[30]????? Nagy B， Jencks W P. Depolymerization of F-Actin by concentrated solutions of salts and denaturing agents[J]. Journal of the American Chemical Society， 1965， 87： 2480-2488.

責(zé)任編輯：黃東杰